Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

Het algemene doel van de volgende methode is om de functies van mestcellen in vivo te analyseren met behulp van mastcel-knockin-muizen. Dit wordt bereikt door eerst uit het beenmerg afgeleide gekweekte mestcellen (BMC MC's) te genereren, of door transplantatie in mestceldeficiënte muizen. In de tweede stap worden de BMC MC's adoptief overgebracht naar diverse anatomische locaties in de mestceldeficiënte muizen om mastcel-knockin-muizen te creëren.

Uiteindelijk worden de aantallen en de anatomische distributie van de adoptief overgedragen mestcellen beoordeeld via flowcytometrie en immunohistochemische analyse om te evalueren in hoeverre de gegraftede populaties lijken op die in wild-type muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een directe beoordeling mogelijk maakt van de functies van de gegraftede wild-type of genetisch gemodificeerde mestcelpopulaties in vivo. Deze methode kan daarom helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de mestcelbiologie, zoals in hoeverre mestcellen of hun producten kunnen bijdragen aan kenmerken van muismodellen van fysiologische, immunologische of pathologische processen, inclusief modellen van menselijke ziekten.

Over het algemeen kunnen personen die deze methode aanleren problemen ondervinden omdat de ingestroomen mastcellen en het tekort daarin kunnen variëren, afhankelijk van de methode die wordt gebruikt om BM CMC's te genereren, de injectieplaats, het aantal geïnjecteerde BMC MC's en het aantal weken dat men wacht na de engraftment voordat de in vivo experimenten worden uitgevoerd. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien aspecten van de engraftmentprocedure moeilijk aan te leren zijn tenzij men exact ziet hoe deze worden uitgevoerd. Gebruik om het beenmerg te extraheren eerst steriele dissectie-instrumenten om het femur, de tibia en de fibula te oogsten van wild-type muizen zonder de botepifysen te beschadigen.

Terwijl elk bot wordt gedissecteerd, wordt het met een pincet vastgezet en wordt al het overbodige weefsel weggeschraapt. Plaats het bot vervolgens in PBS op ijs. Wanneer alle botten zijn verzameld, worden ze overgebracht naar een steriele weefselkweekkap. Zet vervolgens elk bot één voor één vast met een pincet en snijd beide epiphyses af om de mergholtes bloot te leggen. Gebruik daarna spuiten van drie milliliter, voorzien van naalden met een gauge van 30 en spoel met koud medium al het rode beenmerg uit elk bot in een nieuwe petrischaal. Wanneer alle botten zijn uitgespoeld, wordt dezelfde spuit gebruikt om de beenmergcelclusters te dissociëren door herhaaldelijk voorzichtig op te zuigen en uit te stoten.

Breng de celsuspensie vervolgens over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Vul de buis met koud spoelmedium en centrifugeer de cellen. Suspendeer de celpellet in 10 milliliters kweekmedium.

Breng vervolgens de beenmergcellen over naar een weefselkweekfles van een passende grootte. Na één tot twee dagen cultuur worden de niet-adherente cellen samen met 10 milliliters vers kweekmedium per muis overgebracht naar een nieuwe fles gedurende de volgende weken. Voed de cellen elke drie tot vier dagen, zoals zojuist gedemonstreerd.

Overdraag de niet-adherente cellen eenmaal per week naar een nieuwe kolf totdat er geen adherente cellen meer over zijn voor intradermale transplantatie in de oorschelp van de resus. Suspendeer de BMC MC's in koud DMEM in een concentratie van vier keer 10⁷ cellen per milliliter. Aspireer de cellen vervolgens in een injectiespuit van 1 milliliter die is voorzien van een naald van 30 gauge en plaats de spuit op ijs.

Bevestig vervolgens de juiste anesthesiediepte door een knijptest uit te voeren bij een vier tot zes weken oude mastcel-deficiënte recipiënte muis en breng oogzalf aan voordat de cellen worden geïnjecteerd. Gebruik de wijsvinger om de ventrale zijde van de oorschelp bloot te leggen en uit te rekken, waarbij verticale druk op de dorsale zijde van het oor wordt uitgeoefend. Dien vervolgens een eerste intradermale injectie van 25 µL met 1 × 10⁶ BMC MC's toe in het midden van het oor, en een tweede injectie van 25 µL van hetzelfde mengsel richting de punt van de oorschelp.

Voor intraperitoneale transplantatie worden de BMC MC's geresuspendeerd in koud DMEM in een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per milliliter. Gebruik vervolgens een spuit van 1 milliliter met een naald van 25 gauge om 2 × 10⁶ BM CMCs in 200 µL medium in de peritoneale holte van de mastcel-deficiënte ontvangers te injecteren. Voor intraveneuze transplantatie worden de BM CMCs geresuspendeerd in koud DMEM in een concentratie van 2,5 × 10⁷ cellen per milliliter, waarna 5 × 10⁶ BMC MC's in 200 µL medium via de staartvene worden geïnjecteerd.

Vier tot zes weken na een intraperitoneale transplantatie gebruikt u een spuit van vijf milliliter, voorzien van een naald met een gauge van 25, om vijf milliliter koude PBS in de peritoneumholte van het ontvangende dier te injecteren. Masseer de buik gedurende 20 seconden om de peritoneale cellen te oogsten. Gebruik vervolgens een spuit van vijf milliliter, voorzien van een naald met een gauge van 22, om de peritoneale lavage langzaam te aspireren.

Het percentage mestcellen en het totale aantal cellen in het peritoneale spoelvloeistof kan vervolgens worden geëvalueerd via flowcytometrie of histochemie. Om de mestcellen in de mesenteriale vensters te evalueren, wordt het peritoneum opengesneden om het darmkanaal bloot te leggen. Plaats vier tot vijf mesenteriale vensters per muis op een objectglas, gevolgd door een fixatie van één uur in Carnoy-oplossing.

Breng het geheel aan het einde van de incubatie naar kamertemperatuur, laat de slides aan de lucht drogen en verwijder de darm. De gefixeerde mesenteriële vensters blijven aan de slides gehecht. Kleur de preparaten vervolgens gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met chaba-kleuringsoplossing; de flowcytometrische analyse en odine-blauwkleuring van BM CMCs na respectievelijk 1, 15 en 45 dagen kweek in DMEM, aangevuld met IL-3, worden getoond. BM CMCs die 45 dagen zijn gekweekt, zijn 95% zuiver en bevatten grote aantallen cytoplasmatische granula.

Daarom zijn cellen uit deze culturen geschikt voor entingsexperimenten, terwijl cellen die 15 dagen zijn gekweekt in deze afbeeldingen niet geschikt zijn. Succesvolle enting van het oor vier weken na intradermale enting, mesenteriale vensters, de peritoneumholte zes weken na intraperitoneale enting en de long 12 weken na intraveneuze enting worden getoond zoals verwacht. Masten zijn aanwezig in de weefselmonsters die zijn geïsoleerd uit wild-type muizen, terwijl er geen mastcellen worden aangetroffen in de mastcel-deficiënte dieren of in de mastcel-knockin muizen.

De adoptief overgedragen BMC MC's verschijnen echter op locaties die vergelijkbaar zijn met die welke in de wild-type dieren zijn waargenomen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er rekening mee te houden dat het interval tussen de transplantatie en de bestudering van het experiment zal variëren, afhankelijk van de injectieplaats van de mestcellen. Het is essentieel om deze intervallen in acht te nemen, zodat de getransplanteerde cellen voldoende tijd hebben om te rijpen en hun definitieve locatie in vivo in te nemen.

Deze benadering heeft belangrijke informatie verschaft en blijft dat doen over wat massacellen en hun product in vivo kunnen of niet kunnen. Houd er altijd rekening mee dat het werken met levende dieren specifieke training vereist, passende beoordeling en goedkeuring van experimentele protocollen en strikte naleving van de hoogste normen voor dierenwelzijn, inclusief het zorgvuldig verminderen van pijn en stress bij het dier tijdens het uitvoeren van deze procedures.