Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

Het algemene doel van de volgende methode is om de functies van mestcellen in vivo te analyseren met behulp van mestcel knockin-muizen. Dit wordt bereikt door eerst botmerg-afgeleide gekweekte mestcellen te genereren, of BMC MC's of implantatie in mestcel-deficiënte muizen. In de tweede stap worden de BMC MC's adoptief overgebracht naar verschillende anatomische locaties in de mestcel-deficiënte muizen om mestcel knockin-muizen te genereren.

Uiteindelijk worden de aantallen en anatomische verdeling van de adoptief overgedragen mestcellen beoordeeld door middel van flowcytometrie en immunohistochemische analyse om te evalueren in welke mate de geïmplanteerde populaties lijken op die van wildtype muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een directe beoordeling mogelijk maakt van de functies van de geïmplanteerde wandtype of genetisch gemodificeerde MA-celpopulaties in vivo. Deze methode kan daarom helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van MA-celbiologie, zoals in welke mate MA-cellen of hun producten kunnen bijdragen aan kenmerken van muismodellen van fysiologische, immunologische of pathologische processen, inclusief modellen van menselijke ziekten.

Over het algemeen kunnen personen die deze methode leren, worstelen omdat mestcelingenplantatie en -deficiëntie kunnen variëren afhankelijk van de methode die wordt gebruikt om BM CMC's te genereren, de wortel van injectie, het aantal BMC MC's dat wordt geïnjecteerd en het aantal weken dat men wacht na implantatie voordat in vivo-experimenten worden uitgevoerd. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien aspecten van de implantatieprocedure moeilijk te leren zijn tenzij men precies ziet hoe ze worden uitgevoerd. Om het beenmerg te extraheren, gebruik eerst steriele dissectiegereedschappen om het dijbeen, scheenbeen en kuitbeen te oogsten van wildtype muizen zonder enige botepiphysis te verwonden.

Terwijl elk bot wordt gedissecteerd, zet het vast met een pincet en schraap al het overtollige weefsel eraf. Plaats het bot vervolgens in PBS op ijs wanneer alle botten zijn verzameld, breng ze over naar een steriele weefselkweekhood, zet vervolgens, één voor één, elk bot vast met een pincet en snijd beide epifysen af om de medullaire holten bloot te leggen. Gebruik vervolgens drie milliliter spuiten, uitgerust met naalden van 30 gauge en koel medium spoelen, al het rode beenmerg uit elk bot in een nieuwe petrischaal. Wanneer alle botten zijn gespoeld, gebruik dezelfde spuit om de beenmergcellenclusters te dissociëren door herhaald zachte aspiratie en uitdrijving.

Breng vervolgens de celsuspensie over in een centrifugeerbuis van 15 milliliter. Vul de buis met koud spoelmedium en centrifugeer de cellen opnieuw. Suspendeer de cellenpellet in 10 milliliter kweekmedium.

Breng vervolgens de beenmergcellen over in een speciaal afgemeten weefselkweekkolf. Na één tot twee dagen kweek, breng de niet-aanhechtende cellen over naar een nieuwe kolf samen met 10 milliliter vers kweekmedium per muis gedurende de volgende weken. Voer de cellen elke drie tot vier dagen, zoals hierboven is gedemonstreerd.

Breng de niet-aanhechtende cellen één keer per week over naar een nieuwe kolf totdat er geen aanhechtende cellen meer zijn voor intradermale implantatie in de oorpinna. Suspendeer de BMC MC's bij vier keer 10 tot de zevende cel per milliliter in koud DMEM. Zuig vervolgens de cellen op in een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 30 gauge en plaats de spuit op ijs.

Volgende, bevestig de juiste diepte van anesthesie door een bovenste snuif van een vier tot zes weken oude mestcel-deficiënte ontvangende muis en breng oogzalf aan om de cellen te injecteren. Gebruik de wijsvinger om het ventrale gezicht van de oorpinna bloot te leggen en uit te rekken, waardoor verticale druk op het dorsale gezicht van de oor wordt uitgeoefend. Breng vervolgens 1 25 microliter intradermale injectie van één keer 10 tot de zesde BMC MC's in het midden van de oor aan, en een tweede 25 microliter injectie van hetzelfde naar de punt van de pinna.

Voor intraperitoneale implantatie, hersuspendeer de BMC MC's bij één keer 10 tot de zevende cel per milliliter in koud DMEM. Gebruik vervolgens een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 25 gauge om twee keer 10 tot de zesde BM CMC's in 200 microliter medium in de buikholte van de mestcel-deficiënte ontvangers te injecteren voor intraveneuze implantatie. Hersuspendeer de BM CMC's bij 2,5 keer 10 tot de zevende cel per milliliter in koud DMEM, en injecteer vervolgens vijf keer 10 tot de zesde BMC MC's in 200 microliter medium via de staarvene.

Vier tot zes weken na een intraperitoneale implantatie, gebruik een spuit van vijf milliliter uitgerust met een naald van 25 gauge om vijf milliliter koud PBS in de buikholte van het ontvangende dier te injecteren. Masseer de buik gedurende 20 seconden om de peritoneale cellen te oogsten. Gebruik vervolgens een spuit van vijf milliliter uitgerust met een naald van 22 gauge om langzaam de peritoneale wasvloeistof te aspireren.

Het percentage mestcellen en het totale aantal cellen in het peritoneale wasvloeistofvloeistof kan vervolgens worden geëvalueerd door middel van flowcytometrie of histochemie. Om de mestcellen in mesenteriale vensters te evalueren, snijd het peritoneale membraan open om de darm te ontbloten. Schik vier tot vijf mesenteriale vensters per muis op een dia gevolgd door een vaststelling van één uur in carnoise-oplossing.

Voeg kamertemperatuur toe aan het einde van de incubatie, laat de dia's drogen en verwijder het darm. De gefixeerde mesenteriale vensters blijven aan de dia's gehecht. Vervolgens kleuren de preparaten gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met chaba-kleuringsoplossing vertegenwoordigde flowcytometrische analyse en jodiumblauwkleuring van BM CMC's na één 15 en 45 dagen van kweek in DMEM, aangevuld met IL drie tonen BM CMC's gekweekt gedurende 45 dagen en 95% zuiver en bevatten hoge aantallen cytoplasmatische korrels.</