Name: Comet Assay als een indirecte maat van Systemische oxidatieve stress (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer de COMET-assay als indirecte maat voor systemische oxidatieve stress door DNA-schade in leukocyten te kwantificeren. Deze eenvoudige, betrouwbare methode helpt onderzoekers ziektegerelateerde mechanismen bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag de LGA Stiftung bedanken, in Triesen Liechtenstein, voor financiële ondersteuning van ons onderzoek naar oxidatieve stress.

Studies over comet assay uitgevoerd aan de Universiteit van Basel, afdeling Oogheelkunde werden goedgekeurd door het Lokaal Ethisch Comité van Basel 1. Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (Ca ++, Mg ++ vrij) door toevoeging van PBS (1 L packet) en 990 ml dH 2 O tot de media. Stel de pH op 7,4. Bewaar bij RT. </li><li> Bereid lyserende oplossing: Ter voorbereiding 1,000 ml toe 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) en 10 mM Trizma base (1,2 g) in dH 2 O. </li><li> Elektroforesegel buffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) door toevoeging van 30 ml 10 M NaOH en 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs 1500 ml dH 2 O en meng. Het totale volume is afhankelijk van de gel box vermogen. Voor gebruik wordt de pH van de buffer op een pH van&gt; 13 waarborgen. </li><li> Bereid neutralisatie buffer met 0,4 M Tris (48,5 g toegevoegd aan ~ 800 ml dH 2 O, aan te passen pH tot 7,5), geconcentreerd (&amp; #62; 10 M HCl) in 1000 ml met dH 2 O. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid kleurstofoplossing. Om ethidiumbromide (EtBr, 10x voorraad, 20 ug / ml) toe 10 mg EtBr in 50 ml dH 2 O en bewaar bij kamertemperatuur. Voor 1x Stock - meng 1 ml met 9 ml dH 2 O. VOORZICHTIG! Behandel EtBr met voldoende voorzorg omdat het een bekend carcinogeen. </li></ol> 2. Isolatie van leukocyten <ol><li> Verkrijgen menselijke bloedmonsters (20 ml) met een anti-stollingsmiddel zoals heparine via venapunctie. </li><li> Scheid de lymfocyten met een dichtheidsgradiënt celscheider zoals Histopaque. <ol><li> Kort verdunnen bloed 1: 1 verhouding met PBS of RPMI (zonder FBS) en laag over 600 ul celseparator vloeistof. </li><li> Centrifuge 1800 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Zuig het &quot;buffy&quot; coat in 3-5 ml PBS / RPMI en gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 min aan de lymfocyten pellet. </li><li> Ophalen lymfocyten van net boven grens tussen PBS (RPMI) En celscheider vloeistof met behulp van een pipet. Verwijder de leukocyten bands uit de interface tussen plasma en de cel separator vloeibare lagen van elke buis en verzamelen in een 50 ml buis. </li></ol></li><li> Breng het totale volume op 50 ml met koude Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM). Was de celsuspensie driemaal met DMEM bij 300 xg gedurende 10 min. </li><li> Tel het totale aantal cellen met een hemocytometer. Hang de cellen in PBS en aliquote in microcentrifugebuizen op 10 7 cellen / buis. </li><li> Pipetteer 0,4 ml van de cellen in een 5 ml plastic wegwerp buis. Voeg 1,2 ml 1% lage gelerende temperatuur agarose bij 40 ° C. Mix en snel en pipet 1,2 ml celsuspensie op de agarose-bedekte oppervlak van een pre-coated slide. Vermijd het produceren van bubbels. </li><li> Laat de agarose gel gedurende ongeveer 2 min. Wees consistent met de tijd en de temperatuur gebruikt voor geleren, en ervoor zorgen dat agarose volledig is ingesteld voordat dompelen in lysisoplossing. Na volledig set, onderdompelen in lyserende oplossing bij ~ 4 ºC. </li></ol> 3. Lysis en elektroforese Opmerking: De beschreven procedure voor elektroforese onder pH&gt; 13 alkalische omstandigheden. <ol><li> Na minstens 2 uur bij ~ 4 ºC, verwijder voorzichtig dia&#39;s uit de lyserende Solution. Plaats glijdt naast elkaar op het horizontale gel box nabij een uiteinde, glijden deze zo dicht mogelijk bij elkaar. </li><li> Vul het buffer reservoirs met vers op pH&gt; 13 elektroforesebuffer totdat het vloeistofniveau volledig bedekt slides (belletjes via agarose voorkomen). </li><li> Laat slides zitten in de alkalische buffer gedurende 20 min om voor het afwikkelen van DNA en expressie van alkali-labiele beschadiging. </li><li> Schakel de stroomtoevoer naar 25 volt (~ 0,75 V / cm) en stel de huidige tot 300 milliampère door het verhogen of verlagen van de buffer-niveau. Electrophorese de objectglaasjes gedurende 30 minuten. </li><li> Schakel de stroom uit. Til de dia&#39;s uit de buffer en pkant op een drain lade. Drop verstandig de vacht van de dia&#39;s met neutralisatie buffer. Laat de objectglaasjes zitten minstens 5 min. Giet slides en herhaal nog twee keer. </li><li> Vlekken op de dia&#39;s met 80 pi 1x ethidiumbromide (EtBr) en laat gedurende 5 minuten en vervolgens duik in koud gedestilleerd water om overtollig vlek te verwijderen. Plaats dan een dekglaasje over de glijbaan en onmiddellijk op te slaan. Store dia&#39;s voor een maand bij RT in droge omstandigheden. OPMERKING: Other DNA kleurstoffen (zoals SYBR-groen) kunnen eveneens worden gebruikt. Let op! Draag beschermende handschoenen als de meeste kleurstoffen zijn mutageen. </li></ol> 4. Kwantificering van DNA Breaks <ol><li> Om de DNA-schade te visualiseren, observeren de EtBr-gekleurd DNA dia onder een 40x doelstelling fluorescentiemicroscoop. </li><li> Beoordelen DNA schade kwantitatief in de cellen door de lengte van DNA migratie en het percentage DNA migreerden (figuur 1A). Kwantificeren van DNA-schade (Figuur 1B) door de achterklep moment en Olive-moment. Definities van Tail-Moment en Olive -Moment zijn eerder gegeven 8-10. LET OP: Het is onze ervaring dat het genoeg is om vast te houden met één van de parameters. De cellen worden gefotografeerd door de geautomatiseerde tool die scant over de microscoop glijbaan en foto cellen. Kwantificatie van DNA breuken kan door beeldanalyse software pakketten. Er zijn verschillende software pakketten die op maat zijn gemaakt om het beeld van de cellen vast te leggen en te kwantificeren DNA-schade. We raden het gebruik van dezelfde software pakket gedurende het experiment. De laborant identificeert de intacte cel of komeet worden gescoord op de computer en het klikken met de muis op het. De comet of intacte cel wordt automatisch gescoord. </li></ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+fields+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li>
<li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay%3A+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li>
<li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li>
<li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer%3A+role+of+lipid+peroxidation%2C+DNA+damage%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li>
<li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair%3A+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li>
<li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li>
<li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tob+Induc+Dis%22%5BJournal%5D)">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li>
<li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li>
<li>Gaivão, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+comet+assay%3A+insights%2C+uses%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304(2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li>
<li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li>
<li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li>
<li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage%3A+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li>
<li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood%3A+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li>
<li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li>
<li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station%5BTitle%5D)+AND+%22Electromagn+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li>
<li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li>
</ol>

Zweedse wetenschappers Ostling en Johanson waren de eerste in hun vakgebied te komeettest gebruiken om DNA-schade in de cellen 1 kwantificeren. De neutrale omstandigheden dat de twee wetenschappers die echter alleen kon de detectie van dubbelstrengs DNA breuken. Singh et al. Ingericht later de assay voor gebruik onder alkalische omstandigheden, die een gevoelige versie die dubbel en enkelstrengs DNA breuken kunnen beoordelen en detecteren alkali-labiele plaatsen 12 geproduceerd. Sinds de eerste ontwikkeling is de assay aangepast in verschillende stappen het geschikt voor het beoordelen typen DNA schade in verschillende celtypes 13-15 te maken. Zoals bij alle technieken, waarbij strikte aandacht voor technische details belangrijk om nauwkeurige resultaten te 16 verkrijgen. Op basis van onze ervaring, worden de beste resultaten verkregen als elke methodologische stap uit de oplossing voorbereiding tot komeet-kwantificering wordt uitgevoerd door deskundige laboratorium technicians. Het gebruik van verse en juist bereide media, adequate pipetteertechnieken, exacte timing en (zoals eerder in de paragraaf resultaten vermeld) het gebruik van vers bereide leukocyten zijn essentieel om lysis en gelelektroforese om nauwkeurige resultaten te 17 verkrijgen. Alle afzonderlijke stappen in deze assay zijn even belangrijk voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. 16 Over het algemeen de beste resultaten worden verkregen wanneer elke methodologische stappen van oplossingspreparaat tot comet kwantificering wordt uitgevoerd door ervaren laboratorium technicians.Important lijken het gebruik van verse en juist bereide media voldoende pipetteertechnieken, exacte timing en zoals reeds in de resultaten sectie het gebruik van vers bereide leukocyten voor lysis en gelelektroforese om voldoende resultaten te verkrijgen van het 17 genoemde assay. Als andere methodes, de komeet assay techniek heeft zijn advanTages en nadelen. Als een gevoelige werkwijze is de test gevoelig voor factoren (bijvoorbeeld, UV-belichting) die DNA breuken kunnen vergroten, zodat de resultaten beïnvloeden. Elke factor die oxidatieve stress kunnen versterken, met uitzondering dat wordt onderzocht, moet worden vermeden. Stressoren kunnen niveau van oxidatieve stress niet alleen in leukocyten, maar ook in alle andere bloed mediums en lymfocyten te verhogen. Zoals eerder vermeld zijn er veel verschillende en directere manier meten oxidatieve stress 18,19. De comet assay is een van vele werkwijzen die bepaalde voordelen heeft. Deze omvatten een relatief lage kostprijs, het kleine aantal cellen vereist (&lt;10.000 cellen) en daarmee de kleine bloedmonsters vereist per patiënt, de relatieve korte periode nodig is om DNA schade in cellen (ongeveer 3 dagen) kwantificeren de gevoeligheid en de wijdverbreide toepassing op ezels DNA schade in verschillende celtypen. In het verleden kiezen we ervoor om te werken met leukocyten omdat we ervaring met dezeceltype en toepassing was voor specifieke studie gepland. Een ander voordeel van het comet assay is dat het kan worden gebruikt om verschillende typen en niveaus van DNA schade detecteert en daardoor kan in diverse andere gebieden van studies naast oxidatieve stress zoals DNA herstel studies, aanvulling proeven of genotoxiciteit worden toegepast. Oxidatieve stress is nu erkend als een centrale rol spelen in de pathogenese van verschillende ziektes. De comet assay werkwijze, terwijl een van vele manieren voor het meten van oxidatieve stress 18,19, relatief eenvoudig, veelzijdig en goedkoop. Wanneer de knie, kan deze methode worden gebruikt in alle gebieden van de geneeskunde, waarin oxidatieve stress speelt rol 8-10,20,21.

Comet assay werd voor het eerst ontwikkeld door Zweedse wetenschappers Ostling en Johanson 1. DNA is een negatief geladen molecuul. Tijdens electroforese, kleinere, beschadigde DNA-fragmenten sneller reizen naar een positief geladen anode 2. De kleinere DNA-fragmenten, hoe sneller de migratie naar de anode tot een typische &quot;comet&quot; met een &quot;head&quot; bestaande uit intacte, onbeschadigde DNA en een &quot;staart&quot; bestaande uit beschadigde DNA-fragmenten 3 vormen. Beschadigd DNA kan worden hersteld door verschillende mechanismen in het lichaam 4, waarbij het ​​genereren houden van DNA breuken vrij evenwichtig 5. Indien echter de weegschaal in het voordeel van DNA breuken, kunnen de onderbrekingen ophopen en uiteindelijk bijdragen aan de ontwikkeling van een ziekte. Ons DNA lijdt ongeveer 0.000165% schade op een gegeven moment 6. Enkelstrengs DNA breuken betrekking op een defect aan een van de twee strengen van de DNA dubbele helixdat dubbelstrengs DNA breuken veroorzaakt wanneer beide strengen van de DNA dubbele helix beschadigd. Er zijn verschillende factoren die de hoeveelheid DNA breuken op een bepaald moment kan versterken, zoals de leeftijd van de cel, sigarettenrook, verschillende drugs of oxidatieve stress 9/7. Als alle factoren die leiden tot betere DNA-breuken constant worden gehouden, dan is de kwantificering van DNA breuken via comet assay is een goede indirecte parameter van oxidatieve stress. De methode van de komeet assay wordt steeds meer gebruikt vandaag de dag in de geneeskunde, waaronder de oogheelkunde. Een reden hiervoor is dat oxidatieve stress steeds meer erkend als pathogenese van verschillende ziekten 8-11 en comet assay is een methode waarbij oxidatieve stress indirect kunnen worden gekwantificeerd.

<table><tbody><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Qualigens</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ vrij)</td><td>HiMedia</td><td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materialen vereist voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>Normal Melting Agarose (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Methanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (Nr. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor en Tips</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes, conventioneel / Micro gelelektroforese (MGE) glijmiddel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comet assay als een indirecte maat van systemische oxidatieve stress

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Hogere eukaryotische organismen kan niet leven zonder zuurstof; nog, paradoxaal genoeg, zuurstof kan schadelijk zijn voor hen. De zuurstof molecuul chemisch relatief inert omdat het twee ongepaarde elektronen in verschillende pi * anti-bonding orbitalen. Deze twee elektronen parallelle spins, wat betekent dat ze roteren in dezelfde richting rond hun eigen as. Daarom zuurstof molecuul niet erg reactief. Activering van zuurstof kan plaatsvinden door twee verschillende mechanismen; hetzij door reductie via één elektron per keer (monovalent reductie), of door absorptie van voldoende energie om de rotatie van één van de ongepaarde elektronen te keren. Dit resulteert in de productie van reactieve oxidatieve deeltjes (ROS). Er zijn een aantal manieren waarop het menselijk lichaam elimineert ROS in de fysiologische toestand. Als ROS productie overschrijdt de reparatie capaciteit, oxidatieve stress resultaten en schade verschillende moleculen. Er zijn veel verschillende manieren waarop oxidatieve stress me kanasured. Dit manuscript is gericht op een van de genoemde cel gelelektroforese, ook bekend als &quot;comet assay&quot; de metingen van DNA breuken toelaat werkwijzen. Als alle factoren waarvan bekend is DNA schade, anders dan oxidatieve stress constant worden gehouden, de hoeveelheid DNA schade, gemeten door comet assay is een goede parameter van oxidatieve stress. Het principe is eenvoudig en berust op het feit dat DNA-moleculen negatief geladen. Een intact DNA-molecuul zodanig vergroot dat het niet migreert tijdens elektroforese. DNA breuken, echter indien aanwezig resulteren in kleinere fragmenten die bewegen in het elektrische veld naar de anode. Kleinere fragmenten migreren sneller. Aangezien de fragmenten verschillende grootten het uiteindelijke resultaat van de elektroforese is geen afzonderlijk lijn maar een continuüm met de vorm van een komeet. Het systeem maakt een kwantificering van de resulterende &quot;comet&quot; en dus van de DNA breuken in de cel.

Hoewel de werkwijze van comet assay maakt reproduceerbare resultaten kan worden beïnvloed door verschillende factoren. Een dergelijke factor is of de leukocyten worden ingevroren voorafgaand aan lysis en gelelektroforese of dat dit wordt uitgevoerd op vers bereide leukocyten. Figuur 2 toont aan dat in groep 2, waarbij leukocyten voorafgaand aan lysis en gelelektroforese ss- DNA werden ingevroren onderbrekingen waren significant hoger dan in groep 1 waarin lysis en gel -electrophoresis werd uitgevoerd op vers bereide cellen. De test kan ook worden gebruikt om indirect beoordelen systemische oxidatieve stress. Tabel 1 toont de beschrijvende statistieken voor achterklep moment en Olijf- moment in rokers en gezonde proefpersonen. De gegevens blijkt dat het roken van een half pakje sigaretten per dag meer dan verdubbelt ssDNA onderbrekingen in de circulerende leukocyten 9. <img alt="Figuur 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52.763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="Figuur 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Figuur 1. (A) beeldt de microscoop tijdens comet assay analyse. (B) Δ beeldt een typische &quot;komeet&quot; met een heldere kop en staart (beschadigde kleinere DNA-fragmenten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Figuur 2. ssDNA breuken waren significant hoger bij leukocyten werden ingevroren (groep 2) dan na het bereiden leukocyten voorafgaand aan lysis en gelelektroforese werden gebruikt. <imgalt = &quot;Tabel 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabel 1. Rokers had meer dan het dubbele van het aantal ssDNA breekt in vergelijking met leeftijd en geslacht overeenkomende gezonde niet-rokers.

Comet assay meet DNA-breuken, veroorzaakt door verschillende factoren. Als alle elementen (behalve oxidatieve stress) veroorzaakt DNA beschadiging constant worden gehouden, de hoeveelheid DNA schade een goede indirecte parameter van oxidatieve stress. Het doel van dit protocol is het comet assay gebruikt voor indirecte meting van oxidatieve stress.

Comet Assay als een indirecte maat van Systemische oxidatieve stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Het algemene doel van deze procedure is om de COMET-assay te gebruiken voor de indirecte meting van oxidatieve stress. Dit wordt bereikt door eerst leukocyten te isoleren uit menselijke bloedmonsters. De tweede stap bestaat uit het mengen van de cellen met laagsmeltende agarose en het immobiliseren van de cellen op objectglaasjes.Vervolgens worden de cellen gedurende twee uur gelyseerd, gevolgd door elektroforese nadat de coupes zijn gekleurd met diumbromide. Het DNA wordt gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Ten slotte worden DNA-breuken gekwantificeerd via softwareanalyse van de fluorescentiemicroscopische gegevens.Tegenwoordig weten we dat oxidatieve stress een cruciale rol speelt bij de pathogenese van diverse ziekten, waaronder uiteraard oogziekten. Er zijn veel verschillende manieren om oxidatieve stress te meten. Een manier om dit indirect te meten is via de comit-assay.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het een eenvoudige, goedkope en betrouwbare tactiek is waarmee we oxidatieve stress indirect kunnen meten. De leukocyten voor dit experiment worden geïsoleerd uit menselijke bloedmonsters, verkregen met een antistollingsmiddel via veneuze punctie; om de lymfocyten te scheiden, wordt het bloed eerst in een verhouding van één-op-één verdund met PBS. Voeg vervolgens 600 µL van een vloeistof voor dichtheidsgradiënt-celseparatie toe, zoals histo pack, en centrifugeer 20 minuten bij 1.800 ×g bij 4 °C.Suctioneer de buffycoat in drie tot vijf milliliter PBS en centrifugeer bij 300 G gedurende 10 minuten. Om de lymfocyten te isoleren met een pipet, haalt u de lymfocyten op net boven de grens tussen de PBS en de cel-scheidingsvloeistof. Verwijder de leukocytenbanden van de interface tussen de plasmalaag en de laag met cel-scheidingsvloeistof van elke buis en verzamel deze in één buis van 50 milliliter.Breng het totale volume aan met koude PBS tot 50 milliliter. Was de celsuspensie drie keer met PBS bij 300 G gedurende 10 minuten. Tel na de derde wasbeurt het totale aantal cellen met een hemocytometer.Suspendeer de cellen in PBS en Eloqua in microcentrifugebuisjes met 10 miljoen cellen per buisje. Pipetteer 0,4 milliliter cellen in een wegwerpplastic buisje van 1,5 milliliter. Voeg 50 microliter cel-suspensie toe aan 500 microliter van een 1% lage gellingtemperatuur.Zorg dat de agaroze op 40 °C is; pipetteer vervolgens snel 50 µL van de celsuspensie op het met agaroze bedekte oppervlak van een vooraf gecoate slide. Laat de agaroze ongeveer twee minuten geleren bij 4 °C. Wees consistent met de gebruikte tijd en temperatuur voor het geleren en zorg dat de agaroze volledig is gestold voordat u overgaat tot de lysisprocedure.Zodra de agros volledig is uitgehard, worden de slides gedurende minimaal twee uur ondergedompeld in een lyseringisoplossing bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens voorzichtig de slides uit de lyseringsoplossing. Plaats de slides naast elkaar aan één uiteinde van een horizontale gelbox, waarbij ze zo dicht mogelijk tegen elkaar aan worden geschoven.Vul de bufferreservoirs met vers bereide elektroforesebuffer met een pH hoger dan 13. Let op dat de hier getoonde procedure bedoeld is voor elektroforese. Vul onder alkalische omstandigheden met een pH hoger dan 13 de bufferreservoirs tot het vloeistofniveau de objectglazen volledig bedekt.Voorkom dat er bellen over de aros ontstaan. Laat het preparaat 20 minuten in de alkalische buffer liggen om het DNA te laten ontvouwen en de alkalilabelbeschadiging tot uiting te laten komen. Zet na 20 minuten de voeding op 25 volt en stel de stroom in op 300 milliampère door het bufferniveau te verhogen of te verlagen.Voer de elektroforese op de coupes 30 minuten lang uit. Schakel na 30 minuten de stroom uit. Til de coupes voorzichtig uit de buffer en plaats ze op een aflopende tray; bedek de coupes vervolgens druppelsgewijs met een neutralisatiebuffer.Laat de preparaten ten minste vijf minuten inwerken. Laat de preparaten uitlekken en herhaal de coating met neutralisatiebuffer nog twee keer. Kleur de preparaten vervolgens gedurende vijf minuten met één milliliter van één x Ethereum bromide.Draag beschermende handschoenen omdat ethylenbromide een bekend carcinogeen is. Dompel de objectglazen na vijf minuten in gekoeld gedistilleerd water om overtollige kleurstof te verwijderen. Plaats vervolgens een dekglas op elk objectglas.Bewaar de preparaten onmiddellijk. Gekleurde preparaten kunnen een maand worden bewaard bij vier graden Celsius onder droge omstandigheden. Om de DNA-schade te visualiseren en te beoordelen, observeert u het met ethidiumbromide gekleurde DNA-preparaat onder een fluorescentiemicroscoop met een 40 x objectief.Stel het geautomatiseerde instrument in dat over de microscoop scant, de objectglaasjes vastlegt en de cellen in de comet-assay fotografeert. DNA-schade werd kwantitatief beoordeeld in cellen door de lengte van de DNA-migratie en het percentage gemigreerd DNA te meten. De zwarte pijl wijst naar een typische komeet met een heldere kop en staart.De kop bestaat uit intact onbeschadigd DNA en de staart bestaat uit kleinere beschadigde DNA-fragmenten. Hoewel de COMET-assay reproduceerbare resultaten oplevert, kan deze worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals of de assay wordt uitgevoerd op vers geprepareerde leukocyten. In deze grafiek is het staartmoment gedefinieerd als het product van de staartlengte en de staart.Het DNA-percentage van het totale DNA van leukocyten uit groep twee die vóór lysis en elektroforese werden cryopreservéerd, vertoont significant meer enkelstrengs DNA-breuken dan vers bereide leukocyten uit groep één. Deze assay kan ook worden gebruikt om systemische oxidatieve stress indirect te beoordelen. Hierbij vertegenwoordigt het olijfmoment het product van het percentage totaal DNA in de staart en de afstand tussen de massamiddelpunt van de kop- en staartregio's.Resultaten van op leeftijd en geslacht afgestemde rokers en gezonde proefpersonen tonen aan dat het dagelijks roken van een halve pak sigaretten het aantal enkelstrengse DNA-breuken in de circulerende leukocyten meer dan verdubbelt. Eenmaal beheerst biedt deze techniek verschillende voordelen, waaronder de relatief lage kosten, het geringe aantal cellen en daarmee de kleine hoeveelheid bloed die per patiënt nodig is, evenals de relatief korte tijd die nodig is om DNA-schade in cellen te kwantificeren.

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

The video demonstrates the comet assay for detecting DNA damage following exposure to harmful agents. Under alkaline conditions, the DNA unwinds and denatures, and upon electrophoresis, the undamaged and damaged DNA migrate differently in the agarose gel, forming a comet-shaped structure. The slowly migrating undamaged DNA forms the circular comet head, while the rapidly migrating damaged DNA fragments form the elongated comet tail.

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

This video demonstrates the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay to assess oxidative stress in biological samples.

Thiobarbituric Acid-Reactive Substances Assay to Assess Oxidative Stress in Human Serum

De komeet assay is een efficiënte manier voor het opsporen enkel-en dubbel-breuken, met inbegrip van alkali-labiele sites en DNA-DNA/DNA-protein cross-links op het DNA in alle cellen met inbegrip van hippocampale neuronen. De methode maakt gebruik van de differentiële migratie van DNA in een elektrisch veld als gevolg van verschillen in hoeveelheid DNA schade.

Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay

We beschrijven hier een platform dat comet assay detectie van DNA-schade met ongekende doorvoer toestaat. De inrichting patronen zoogdiercellen in een microarray en maakt parallelle verwerking van 96 monsters. De benadering maakt analyse van basisniveau DNA schade, blootstelling DNA schade en DNA herstel kinetiek.

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

De alkalische komeet-assay meet DNA-strengbreuken in eukaryotische cellen. Door een digestiestap met Endonuclease III of humane 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase toe te voegen, kan de assay efficiënt oxidatieve DNA-schade detecteren. We beschrijven methoden voor het gebruik van deze assays om DNA-schade in rattenlever te detecteren.

In vivo Alkaline Comet Assay en Enzyme-gemodificeerde Alkaline Comet Assay voor het meten van DNA-breuken en oxidatieve DNA-schade in Rat Liver

De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.

Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

De komeettest is een populair middel om DNA-schade op te sporen. Deze studie beschrijft een benadering van het uitvoeren van dia's in representatieve varianten van de komeettest. Deze aanpak verhoogde het aantal monsters aanzienlijk, terwijl de looptijd van de test, het aantal diamanipulaties en het risico op schade aan gels afnam.

Een high-throughput comet assay-benadering voor het beoordelen van cellulaire DNA-schade

Dit protocol beschrijft een effectieve methode voor het kwantificeren van het verschil in DNA-schade veroorzaakt door type I- en type II-remmers in FLT3-mutante cellen door de toepassing van de komeettest.

Komeettest om DNA-schade te kwantificeren in FLT3-cellen die mutant tot expressie brengen van 32D na blootstelling aan type I en type II FLT3-remmers

De DNA-bindend eiwit van uitgehongerde cellen (DPS) speelt een cruciale rol in de strijd tegen bacteriële stress. Dit artikel bespreekt de zuivering...

Toepassing van een<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Protection Assay om stress Mediation Eigenschappen van de Dps Protein Visualiseer

Leer de COMET-assay als indirecte maat voor systemische oxidatieve stress door DNA-schade in leukocyten te kwantificeren. Deze eenvoudige, betrouwbare methode helpt onderzoekers ziektegerelateerde mechanismen bestuderen.

Comet Assay als een indirecte maat van Systemische oxidatieve stress

Meer video's verkennen