High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen In Vitro

Het algemene doel van deze procedure is om neutrofiele extracellulaire vallen, of NETs, die vrijkomen van menselijke neutrofielen op een grootschalige schaal te kwantificeren. De hier gepresenteerde methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontsteking en veranderende ontstekingsziekten door de studie van het mechanisme en de regulatie van de vorming van extracellulaire neutrofielenvallen in vitro in menselijke neutrofielen. De implicaties van deze techniek omvatten de identificatie van een centrale NET-bemiddelende signaalroutes en NET-remmende of NET-stimulerende moleculen.

Om neutrofielen uit bloed te isoleren, verdeel 20 milliliter menselijk bloed in 250 milliliter kegelvormige buizen. Voeg 10 milliliter 6% dextran toe, meng voorzichtig en laat de oplossingen 20 minuten op kamertemperatuur staan. Breng voorzichtig de leukocytenrijke bovenste fase over in schone 50 milliliter kegelvormige buizen en vul de buis tot de bovenkant met steriel PBS.

Centrifugeer vervolgens het monster gedurende tien minuten bij 400 keer G en gebruik 15 milliliter steriel PBS om de pellet te resuspenderen. Herhaal deze wasstap nog een keer. Bereid vervolgens vijf stappen percoll-gradienten van 85, 80, 75, 70 en 65 procent in 215 milliliter kegelvormige buizen voor en leg twee milliliter van de leukocyten suspensie bovenop elk gradiënt.

Centrifugeer vervolgens de gradiënten gedurende 30 minuten bij 800 keer G met de breekfunctie. Na centrifugatie, verzamel de cellen in de lagen op de 75-80% en 70-75% grenzen. Was de cellen twee keer met PBS en gebruik vervolgens een hemocytometer om de cellen te tellen.

Om de kinetiek van de afgifte van extracellulair DNA te meten, bereid een suspensie van neutrofielen in assaymedium voor op een concentratie van twee keer tien tot de zes cellen per milliliter. Voeg vijf micromol per liter SYTOX oranje toe, een membraanimpermeable DNA-bindende kleurstof, en meng voorzichtig. Verdeel menselijke neutrofielen in steriele 96-well zwarte transparante bodem microplates en zorg ervoor dat het assaymedium de volledige bodem van de well bedekt.

Indien niet, tik voorzichtig op de zijkant van de plaat. Verwarm de plaat gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius. Gebruik in de tussentijd 37 graden Celsius assaymedium om oplossingen te bereiden die stimuli bevatten met dubbel hun uiteindelijke concentratie om te worden gebruikt.

Als positieve NET-controle, bereid 100 nanomolar phorbol myristaat acetaat, of PMA, voor om menselijke neutrofielen gedurende vier uur te behandelen om maximale NET-afgifte te activeren. Bereid vervolgens de microplate fluorometer voor voor meting. Stimuleer neutrofielen door 50 microliter van de stimulusoplossing toe te voegen aan 50 microliter van neutrofielen suspensies.

Voeg een uiteindelijke concentratie van 0,5 milligram per milliliter saponine toe aan één well, om de maximale DNA-afgifte signaal te meten. Plaats de plaat in de lezer en meet veranderingen in fluorescentie met tussenpozen van twee minuten gedurende vier uur zonder te schudden. Om de gegevens te analyseren, bereken genormaliseerde toenames in fluorescentie over tijd door de baseline fluorescentie af te trekken van de eindwaarden voor alle wells inclusief saponine.

De stijging in saponinefluorescentie zou het hoogste signaal moeten zijn en wordt aangeduid als de maximale DNA-afgifte. Gemiddel de resultaten van replica's en presenteer deze als percentage van maximale DNA-afgifte. Om de NET-vorming te kwantificeren met behulp van MPO-DNA en HNE-DNA ELISA-assays, voeg anti-MPO of anti-HNE capture-antilichamen toe aan 96-well ELISA-platen met hoge bindingscapaciteit en incubeer ze een nacht om te coaten.

De volgende ochtend gebruik 200 microliter per well van PBS om de ELISA-platen drie keer te wassen. Gebruik vervolgens 200 microliter van 5% bovine serum albumine, of BSA, en 0,1% human serum albumine, of HSA, om de wells bij kamertemperatuur gedurende twee uur te blokkeren. Gedurende deze tijd, plaats neutrofielen in 100 microliter assaymedium op een 96-well plaat met een dichtheid van 100.000 cellen per well en induceer NET-vorming na toevoeging van stimuli door incubatie bij 37 graden Celsius gedurende vier uur.

Voer vervolgens een beperkte DNase-vertering uit door twee eenheden per milliliter DNAse toe te voegen aan de neutrofielen supernatanten, meng goed en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Stop vervolgens de reactie door 15 microliter van 25 millimolair EGTA toe te voegen en meng goed. Verzamel de supernatanten en schone microfugebuizen en centrifugeer de monsters om celdeeltjes te verwijderen bij 300 keer G en kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Het verzamelen van NETs zonder beperkte vertering resulteert in inconsistente gegevens. De beperkte DNA-verteringsstap is cruciaal om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Daarom is de concentratie van DNase I-enzym en de duur van de vertering geoptimaliseerd.

Breng het supernatant over naar schone microfugebuizen en bewaar het op ijs. Gebruik vervolgens een aliquot van eerder bereide NET-standaard om een verdunning van één tot twee in PBS en EGTA te bereiden. Gebruik nu PBS met EGTA om DNase I-verteerde monsters twintigvoudig te verdunnen en verdeel ze op ELISA-platen gecoat met capture-antilichamen.

Incubeer de platen een nacht bij vier graden Celsius. Voordat u PBS gebruikt om de platen drie keer te wassen, breng 100 microliter per well van een detectieantilichaam oplossing aan, zoals paardenraden geconjugeerd anti DNA-antilichaam, en incubeer in het donker gedurende één uur. Na vier wasbeurten met PBS, voeg 100 microliter per well van TMB peroxidase substraat toe en incubeer gedurende 30 minuten.

Blauwe kleuring duidt op peroxidase-activiteit en de aanwezigheid van NETs. Om de reactie te stoppen, voeg 100 microliter van een molair HCL toe. De blauwe oplossingen zullen geel worden.

Gebruik een microplaatfotometer om de absorptie bij 450 nanometer te meten. Om de hoeveelheid MPO-DNA of HNE-DNA complexen te vergelijken die is