Name: High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Leer hoe je NET-vorming in menselijke neutrofielen kwantitatief meet met high-throughput methoden. Deze technieken helpen bij het onderzoek naar inflammatoire ziekten en signaleringsroutes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bijzondere dank aan het personeel van het Health Center laboratorium van de University of Georgia voor hun voortdurende ondersteuning van ons werk aan het isoleren van menselijke neutrofielen. Dit werk werd ondersteund door het startkapitaal van Dr. Rada, verstrekt door UGA Office of Vice President for Research.

De Institutional Review Board van de Universiteit van Georgia goedgekeurd het menselijk subject onderzoek van de perifere bloed van gezonde vrijwilligers (UGA # 2012-10769-06) te verzamelen. 5,7,8 Vrijwilligers tekende de vereiste informed consent formulier voor bloedafname. Het onderzoek uitgevoerd in dit artikel is in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor medisch onderzoek met mensen van de Verklaring van Helsinki. 1. Isolatie van neutrofielen uit perifeer menselijk bloed (figuur 1) Opmerking: Er zijn verschillende manieren om neutrofielen uit perifeer bloed te isoleren. Het volgende protocol voorziet één mogelijkheid. Dit protocol levert grote aantallen niet-geactiveerde humane neutrofielen kan vrijgeven NET op externe stimulatie. Gebruik 40 ml bloed van gezonde vrijwilligers verkregen door venapunctie. 7,9 <ol><li> Aliquot 20 ml bloed in twee 50 ml conische buizen. Voeg 10 ml 6% dextran. Meng voorzichtig. </li><li> Na 20 min overdracht van de leukocyten-rich bovenste fase zonder enige vorm van pellets rode bloedcellen in schone 50 ml conische buizen en vul het met steriele PBS. </li><li> Centrifugeer bij 400 x g 10 min. Resuspendeer pellet in 4 ml steriele PBS. </li><li> Bereid een 5-staps Percoll gradiënt van 85% -80% -75% -70% -65% in twee 15 ml conische buizen en laag 2 ml leukocyt suspensie bovenop elkaar gradiënt. </li><li> Centrifuge 800 g gedurende 30 min met remmen los. </li><li> Verzamel alle cellen (neutrofielen) in lagen op de 75% / 80% en 70% / 75% interface. </li><li> Was de cellen tweemaal in PBS (350 xg, 10 min, RT) en cellen te tellen met een hemocytometer. </li></ol> 2. Meting van de kinetiek van extracellulaire DNA release Met behulp van een Microplate Fluorimeter Opmerking: deze methode kan de meting van veranderingen in fluorescentie van een membraan ondoorlaatbare DNA-bindende kleurstof die indicatief is voor DNA afgifte aan een 96-well microplaat formaat (Figuur 2). <ol><li> Maak een suspensie van neutrofielen in testmedium (HBSS +1% (v / v) autoloog serum + 5 mM glucose) in een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Voeg 5 micromol / l van het membraan ondoordringbaar DNA-bindende kleurstof. Meng voorzichtig. </li><li> Aliquot menselijke neutrofielen (50 pl / putje) op 96-well zwart, transparant bodem microtiterplaten. Controleer het testmedium bestrijkt de gehele bodem van de put. Zo niet, dan tikt u op de plaat voorzichtig op de zijkant. </li><li> Verwarm de plaat met neutrofielen gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> In de tussentijd worden de oplossingen van stimuli op het dubbele van hun uiteindelijke concentraties te worden gebruikt (in 37 ° C warm assay medium). Als een positieve controle NET gebruiken humane neutrofielen met 100 nM forbol-myristaat-acetaat (PMA) gedurende 4 uur tot maximaal NET versie te activeren. 5,8 PMA stimulatie voor 4 uur garandeert maximale netto vrijval terwijl spontane NET formatie blijft laag 5,8. </li><li> Bereid de microplaat fluorimeter voor het meten (4 uur, 37 ° C, 530 nm voor excitatie en 590 nm voor emissie). &lt;/ Li&gt; <li> Neutrofielen stimuleren door toevoeging van 50 ul stimulus oplossing van 50 gl neutrofielen suspensies. Gebruik 0,5 ug / ml saponine in een put om maximale DNA afgifte signaal te meten. </li><li> Plaats de plaat in de reader en de veranderingen in fluorescentie gedurende 4 uur bij elke 2 min zonder schudden meten. </li><li> Gegevensanalyse Bereken genormaliseerde toename in fluorescentie in de tijd. <ol><li> Aftrekken van de basislijn fluorescentie eindpunt waarden van alle putjes zoals saponine (Figuur 2A, B). Stijging van de saponine fluorescentie moet de hoogste signaal. Het wordt aangeduid als &quot;maximale DNA afgifte&quot; (Figuur 2A). </li><li> Percentages berekenen van DNA afgifte in onbekende monsters door het delen toename in fluorescentie van onbekende monsters door DNA maximale afgifte. </li><li> Gemiddelde resultaten van herhalingen en presenteren als &quot;% van de maximale DNA release&quot; (figuur 2C). </li></ol></li></ol> 3. kwantificering van NET Formatie van MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays Opmerking: Deze testen gemodificeerd (MPO-DNA) of gevestigde (HNE-DNA) in ons laboratorium kwantificeren netvorming door het meten van niveaus van MPO-DNA en HNE-DNA complexen 5. <ol><li> Coat 96-well high-bindend vermogen ELISA-platen &#39;s nachts met capture antilichamen (50 pl / putje): anti-MPO (1: 2000 verdunning) of anti-HNE (1: 2000). </li><li> Wassen ELISA platen driemaal met PBS (200 ul / putje) en blokkeren met 5% BSA en 0,1% menselijk serum albumine gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (200 ui / putje). Spoel driemaal met PBS. </li><li> Zaad neutrofielen op 96-putjes bij een dichtheid van 100.000 cellen / putje in 100 pl assaymedium en stimuleren netvorming. Incubeer cellen: 4 uur 37 ° C. </li><li> Voer een beperkte DNase spijsvertering door toevoeging van 2 U / ml DNase neutrofielen supernatanten, meng ze goed. Houd ze bij RT. </li><li> Stop de DNase na 15 min door het toevoegen van 11 pi 25 mM EGTA (eindconcentratie 2,5 mm). Goed mengen. Verzamel supernatants in schone microfugebuizen. Spin monsters kwijt celresten bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Transfer hun supernatanten in schone microcentrifuge buizen. Houd ze op ijs pas klaar. </li><li> Gebruik een hoeveelheid van een eerder bereide &quot;NET standaard&quot;. Opmerking: De NET-standaard is een mix van DNase gedigereerd supernatanten van PMA-gestimuleerde neutrofielen verkregen uit ten minste 5 verschillende, onafhankelijke menselijke donors. <ol><li> Op hetzelfde niveau gedurende lange tijd, verzamelen en aliquot een grote hoeveelheid neutrofielen supernatanten van elke donor. Verzamelen bijvoorbeeld 2 ml DNase-gedigereerde supernatanten van PMA-gestimuleerde neutrofielen zal resulteren in 200 monsters (10 pl elk) genoeg 200 ELISA platen. Kenmerkende gegevens NET norm in figuur 5. </li><li> Stimuleer menselijke neutrofielen met 100 nM PMA gedurende 4 uur en van toepassing DNase verteren hun supernatanten volgens stappen 3,4-3,5. </li><li> Verzamel, zwembad, monster (10 pl) en gratisZE (-20 ° C) neutrofiel supernatanten. </li><li> Om de &quot;NET-standaard&quot; voor te bereiden, dooi een portie / donor verkregen uit ten minste vijf afzonderlijke donors, meng ze en houd ze op ijs. </li><li> Gooi ontdooide monsters en het gebruik van verse die voor het volgende experiment. </li><li> Bereid een 1: 2 seriële verdunning van de NET-standaard in PBS + EGTA. </li></ol></li><li> Verdun DNase1-verteerd samples (standaard en onbekende supernatanten) 20-voudig in PBS + EGTA en aliquot ze op ELISA-platen bekleed met capture antilichamen. </li><li> Incubeer ELISA platen overnacht bij 4 ° C en wassen driemaal met PBS. </li><li> Solliciteer detectie antilichaam-oplossing (100 ul / putje): mierikswortelperoxidase geconjugeerd anti-DNA antilichaam (1: 500, muis). Incubeer gedurende 1 uur in het donker. </li><li> Na vier wassingen met PBS toe te voegen TMB peroxidasesubstraat: 100 ul / well, 30 min. Blauw kleuring is een indicatie voor peroxidase activiteit (NET aanwezig). </li><li> Stop reactie door het toevoegen van 100 ul / putje 1 M HCl. Deblauw oplossingen zullen geel (figuur 5A) draaien. </li><li> Lees absorptie bij 450 nm onder toepassing van een microplaat fotometer. </li><li> Voor gegevensanalyse Bereken de hoeveelheid MPO-DNA of HNE-DNA complexen in vergelijking met de standaard NET. <ol><li> Aftrekken van de achtergrond optische dichtheidswaarde van het testmedium van alle monsters. </li><li> Zet de absorptiewaarden (X-as) van de verdunde standaardmonsters op hun relatieve netto inhoud (Y-as) (figuur 5A). </li><li> Met behulp van de nonsaturated bereik van deze norm curve opzetten van een trendlijn (gebruik best exponentiële fit van de gebruikte software) (Figuur 5A). De vergelijking van deze trendlijn is bepalend voor de omzetting van de OD-waarden bedragen van NET kwantitatief. </li><li> Plaats de gemeten OD-waarden van de onbekenden in de tendens-lijn vergelijking van 3.13.3 dat het bedrag van NET in het onbekende monster als percentage van de netto-standaard (figuur 5A) zal geven. </li><li> Berekenengemiddelden van herhalingen (drie exemplaren) en de definitieve gegevens te presenteren als &quot;hoeveelheid MPO-DNA of HNE-DNA-complexen (% van de norm)&quot; (figuur 5C). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

NET&#39;s vertegenwoordigen een fascinerend nieuw mechanisme waarmee neutrofielen doden pathogenen. 1 Hoewel de literatuur van de netten is voortdurend uit te breiden in de afgelopen tien jaar sinds hun ontdekking, een aantal belangrijke vragen met betrekking tot hun rol in de biologie, mechanisme en regelgeving onduidelijk blijven. Passende methode moet worden ontwikkeld om NET&#39;s, dit zeer unieke antimicrobiële mechanisme meten. Dit artikel beschrijft methoden die kunnen worden gebruikt voor NET kwantifi...

NET-vorming is een nieuw mechanisme waarmee neutrofielen pathogenen bestrijden.1 Het hart van NETs is nucleair DNA.1 Dit DNA-netwerk is geassocieerd met neutrofiele korrelproteïnen en histonen.1 De belangrijkste vorm van NET-vorming vereist de dood van neutrofielen, gekenmerkt door chromatine decondensatie, verdwijning van korrelige en nucleaire membranen, translocatie van neutrofielen elastase naar de kern, citrullinering van histonen en uiteindelijk het overstromen van DNA-gebaseerde NETs.2 NETs vangen en doden een breed scala aan microben en zijn een essentieel onderdeel van het repertoire van aangeboren immuunwapens. Ongecontroleerde NET-vorming is echter in verband gebracht met talrijke auto-inflammatoire ziekten.3,4 Ondanks hun steeds grotere relevantie, is er weinig bekend over het mechanisme en de regulatie van NET-vrijlating. 
Neutrofielen die afsterven door het vrijgeven van NETs zijn anders dan apoptotische of necrotische neutrofielen.3,5 NET-vrijstellende neutrofielen vertonen verschillende kenmerken die kenmerkend zijn voor NET-vorming. Korrelcomponenten zijn geassocieerd met DNA in NETs.1 Myeloperoxidase (MPO) en humaan neutrofiel elastase (HNE) worden beide gevonden in primaire korrels in rustende cellen, maar worden getransloceerd naar de kern om zich te binden aan DNA in NETs.1 MPO-DNA en HNE-DNA complexen zijn specifiek voor NETs, komen niet voor in apoptotische of necrotische neutrofielen.1,3,5 Chromatine decondensatie is een ander kenmerk dat typisch is voor NETose.2 NET-vrijlating vereist ook citrullinering van histonen door peptidyl aminase 4 (PAD4).6 Citrullineerde histonen zijn kenmerkend voor neutrofielen die NET-vrijlating hebben ondergaan.6
Hier worden drie methoden geïntroduceerd die in combinatie uitstekende hulpmiddelen bieden om NETs op een grootschalige te kwantificeren. De eerste test is op het veld gebruikt met verschillende wijzigingen en kwantificeert de extracellulaire DNA-vrijlating in een microplaatformaat. De tweede en derde tests bieden bevestiging van NETs door NET-specifieke MPO-DNA en HNE-DNA complexen te meten.

<table><tbody><tr><td>Anti-Human Neutrophil Elastase&nbsp; Rabbit Ab&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2.000x gecoat</td></tr><tr><td>Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2.000x gecoat</td></tr><tr><td>DNase-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181;g/ml gebruikt voor digestie</td></tr><tr><td>20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cell death detection ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Eon Microplate Spectrophotometer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 All-in-One microplate software</td><td>Biotek</td><td></td><td>analtisch hulpmiddel (ELISA)</td></tr><tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0,2% eindconcentratie/volume</td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>Gebruik 10 mM eindconcentratie.</td></tr><tr><td>1 M glucose</td><td>Sigma</td><td></td><td>Gebruik 5 mM eindconcentratie.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 nM eindgebruik</td></tr><tr><td>ELISA Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes 15 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes 50 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (pH 8,5-9,5)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>Natriumchloride, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Spectrum</td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 well assay plate zwarte plaat met heldere bodem</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput meting van extracellulaire dna los en kwantitatieve net formation in menselijke neutrofielen<em&gt; in vitro</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrofiele granulocyten zijn de meest voorkomende leukocyten in het menselijk bloed. Neutrofielen zijn de eersten die aankomen op de plaats van infectie. Neutrofielen ontwikkelden verschillende antimicrobiële mechanismen, waaronder fagocytose, degranulatie en vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NETs). NETs bestaan uit een DNA-skelet versierd met histonen en verschillende korrelmarkers, waaronder myeloperoxidase (MPO) en humane neutrofiele elastase (HNE). NET-release is een actief proces dat kenmerkende morfologische veranderingen van neutrofielen met zich meebrengt, wat leidt tot de uitdrijving van hun DNA naar de extracellulaire ruimte. NETs zijn essentieel om microben te bestrijden, maar ongecontroleerde afgifte van NETs is geassocieerd met verschillende aandoeningen. Om meer te leren over de klinische relevantie en het mechanisme van NET-vorming, is er behoefte aan betrouwbare tools die in staat zijn tot NET-kwantificering.
Hier worden drie methoden gepresenteerd die NET-afgifte van humane neutrofielen in vitro kunnen beoordelen. De eerste is een hoogdoorvoertest om de extracellulaire DNA-afgifte van menselijke neutrofielen te meten met behulp van een membraan-impermeable DNA-bindende kleurstof. Bovendien worden twee andere methoden beschreven die in staat zijn om de vorming van NETs te kwantificeren door het meten van niveaus van NET-specifieke MPO-DNA en HNE-DNA complexen. Deze op microplaat gebaseerde methoden in combinatie bieden geweldige tools om de mechanismen en regulatie van NET-vorming van menselijke neutrofielen efficiënt te bestuderen.

De cijfers in dit manuscript beschrijven de wijze van neutrofielen isolatie, voor experimenten en presenteren representatieve resultaten met uitleg van gegevensanalyse. Figuur 1 toont de opeenvolgende stappen van humaan neutrofiel preparaat. Dit protocol vertegenwoordigt slechts één mogelijke manier van neutrofielen isolement. Het levert grote hoeveelheden rustende neutrofielen kunnen vrijgeven netten na stimulatie. Figuur 2 toont hoe de fluorescentie ge...

Er worden high throughput-assays gepresenteerd die in combinatie uitstekende tools bieden om NET-afgifte van humane neutrofielen te kwantificeren.

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van neutrofiele extracellulaire traps, of NETs, die op een high-throughput schaal worden afgegeven door menselijke neutrofielen. De hier gepresenteerde methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van inflammatie en het beïnvloeden van inflammatoire ziekten door de studie van het mechanisme en de regulatie van in vitro vorming van neutrofiele extracellulaire traps in menselijke neutrofielen. De implicaties van deze techniek omvatten de identificatie van centrale NET-bemiddelende signaleringspaden en NET-remmende of NET-stimulerende moleculen.Om neutrofielen uit bloed te isoleren, verdeelt u 20 milliliters menselijk bloed in 250 milliliter conische buizen. Voeg 10 milliliters 6% dextran toe, meng vervolgens voorzichtig en laat de oplossingen 20 minuten bij kamertemperatuur staan. Draag de leukocytenrijke bovenfase voorzichtig over naar schone 50 milliliter conische buizen en vul de buis tot aan de rand aan met steriele PBS.Centrifugeer het monster vervolgens bij 400 ×g gedurende tien minuten en gebruik 15 mL steriele PBS om de pellet opnieuw te suspenderen. Herhaal deze wasstap nog één keer. Bereid vervolgens Percoll-gradiënten met vijf stappen van 85%, 80%, 75%, 70% en 65% voor in kegelvormige buizen van 215 mL en breng twee mL van de leukocytensuspensie aan bovenop elke gradiënt.Centrifugeer vervolgens de gradiënten 30 minuten bij 800 ×g met de rem uitgeschakeld. Verzamel na centrifugatie de cellen in de lagen bij de interfaces van 75-80% en 70-75%. Was de cellen twee keer met PBS en tel de cellen vervolgens met een hemocytometer.Om de kinetiek van de extracellulaire DNA-vrijgave te meten, bereidt u een suspensie van neutrofielen in assaymedium voor met een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter. Voeg 5 µmol/L SYTOX orange toe, een membraan-impermeabele DNA-bindende kleurstof, en meng dit voorzichtig. Verdeel de menselijke neutrofielen in steriele zwarte transparant-bodem microplaten met 96 wells, waarbij u erop let dat het assaymedium de gehele bodem van de well bedekt.Indien dit niet het geval is, tik dan voorzichtig tegen de zijkant van de plaat. Warm de plaat 10 minuten lang op bij 37 °C. Gebruik ondertussen assaymedium bij 37 °C om oplossingen voor te bereiden die stimuli bevatten in een dubbele concentratie van de uiteindelijke concentratie die gebruikt zal worden.Bereid als positieve NET-controle 100 nanomolar phorbolmyristaatacetaat, of PMA, voor om menselijke neutrofielen gedurende vier uur te behandelen om een maximale NET-afgifte te induceren. Bereid vervolgens de microplaatfluorometer voor op meting. Stimuleer de neutrofielen door 50 microliter stimulusoplossing toe te voegen aan 50 microliter neutrofielsuspensies.Voeg een eindconcentratie van 0.5 mg/mL saponine toe aan één well om het maximale DNA-vrijmakingssignaal te meten. Plaats de plaat in de reader en meet de veranderingen in fluorescentie met intervallen van twee minuten gedurende vier uur zonder te schudden. Bereken voor de data-analyse de genormaliseerde toenames in fluorescentie over de tijd door de basislijnfluorescentie af te trekken van de eindwaarden voor alle wells, inclusief die met saponine.De toename in saponine-fluorescentie moet het hoogste signaal zijn en wordt aangeduid als de maximale DNA-vrijgave. Bereken het gemiddelde van de resultaten van de herhalingen en presenteer deze als percentage van de maximale DNA-vrijgave. Om de NET-vorming te kwantificeren met MPO-DNA en HNE-DNA ELISA-assays, voegt u anti-MPO- of anti-HNE-vangstantilichamen toe aan 96-well ELISA-platen met een hoge bindingscapaciteit en incubeert u deze een nacht om de platen te coaten.Was de volgende ochtend de ELISA-platen drie keer met 200 µL PBS per well. Gebruik vervolgens 200 µL van 5% bovine serumalbumine (BSA) en 0,1% humaan serumalbumine (HSA) om de wells twee uur lang bij kamertemperatuur te blokkeren. Zaai ondertussen neutrofielen in 100 µL assaymedium op een 96-wells plaat met een dichtheid van 100.000 cellen per well en induceer de vorming van NETs na toevoeging van stimuli door vier uur te incuberen bij 37 °C.Voer vervolgens een beperkte DNase-digestie uit door twee eenheden per milliliter DNAse toe te voegen aan de supernatanten van de neutrofielen, meng dit vervolgens goed en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Stop daarna de reactie door 15 µL 25 mM EGTA toe te voegen en meng goed. Verzamel de supernatanten in schone microcentrifugebuisjes en centrifugeer de monsters bij 300 ×g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten om celresten te verwijderen.Het verzamelen van NETs zonder beperkte digestie leidt tot inconsistente gegevens. De stap van beperkte DNA-digestie is cruciaal voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. Daarom zijn de concentratie van het DNase I-enzym en de duur van de digestie geoptimaliseerd.Breng het supernatant over naar schone microcentrifugebuisjes en bewaar deze op ijs. Bereid vervolgens, met behulp van een aliquot van eerder geprepareerde NET-standaard, een verdunning van één op twee in PBS en EGTA. Gebruik nu PBS met EGTA om de met DNase I behandelde monsters twintig keer te verdunnen en breng aliquots hiervan aan op ELISA-platen die zijn gecoat met capture-antilichamen.Incubeer de platen overnacht bij 4 °C. Breng 100 µL per well van een detectie-antilichaamoplossing aan, zoals mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-DNA-antilichaam, en incubeer een uur in het donker voordat de platen drie keer met PBS worden gewassen. Voeg na vier wasbeurten met PBS 100 µL TMB-peroxidesubstraat per well toe en incubeer gedurende 30 minuten.Een blauwe kleur duidt op peroxidase-activiteit en de aanwezigheid van NETs. Voeg om de reactie te stoppen 100 µL van één molair HCl toe. De blauwe oplossingen zullen geel worden.Meet de absorptie bij 450 nanometer met een microplaat-fotometer. Om de hoeveelheid gemeten MPO-DNA- of HNE-DNA-complexen te vergelijken met de NET-standaard, trekt u de achtergrond-optische dichtheid af van alle monsters en zet u de absorptiewaarden van de verdunde standaardmonsters uit tegen hun relatieve NET-gehalte. Stel met behulp van het niet-verzadigde bereik van deze standaardcurve een trendlijn vast met de beste exponentiële fit van de gebruikte software.Voeg de gemeten OD-waarden van de onbekende monsters in de trendlijnvergelijking in om de hoeveelheid NETs in het onbekende monster te bepalen als percentage van de NET-standaard. Bereken tot slot de gemiddelden van de herhalingen en presenteer de uiteindelijke gegevens als de hoeveelheid MPO-DNA of HNE-DNA complexen. Hier worden representatieve gegevens getoond van een fluorescentiegebaseerde DNA-vrijgave-assay van humane neutrofielen die niet zijn gestimuleerd of zijn geactiveerd met PMA of P-aeruginosa.P-aeruginosa triggert de vorming van NETs in humane PMN's. Deze grafiek illustreert dat de gemiddelden van de toename in fluorescentie van herhaalde wells worden berekend, genormaliseerd op de maximale fluorescentie en worden uitgedrukt als DNA-afgifte. Deze fluorescentiebeelden representeren neutrofielen die onbehandeld zijn gebleven of gestimuleerd zijn met PMA.Hier worden immunofluorescentiebeelden getoond van niet-gestimuleerde, met PMA en met PA01 geactiveerde menselijke neutrofielen uit een MPO-DNA en HNE-DNA ELISA-assay. Extracellulair DNA vertoont de typische NET-morfologie en colokaliseert met MPO en gecitrullineerd histon H4, een marker voor NET-vorming. Dit experiment toont de afgifte van MPO-DNA en HNE-DNA in menselijke neutrofielen met behulp van dezelfde assay.De NET-standaard bevat gemiddeld 19,5 µg/mL extracellulair DNA, 399 ng/mL MPO en 103,4 ng/mL HNE. Op basis van de molecuulgewichten van MPO en HNE, en het feit dat één µg DNA 9,91 × 10¹⁴ nucleotiden bevat, bevat de NET-standaard 109 HNE-moleculen en 147 MPO-moleculen per 1.000 nucleotiden. Ten slotte tonen experimenten met tweevoudige seriële verdunningen van de NET-standaard aan dat de dynamische bereiken van zowel de MPO-DNA- als de HNE-DNA-ELISA-assays tussen 19 en 609 ng/mL DNA liggen.Zodra de methode onder de knie is, kan het SYTOX orange-gebaseerde zuur eenvoudig en snel binnen één uur worden samengesteld, wat de volgende dag tot resultaten leidt. De NET-kwantificeringsassay is ook eenvoudig uit te voeren en levert de volgende dag gegevens op als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe naturalase in menselijke neutrofielen op een high-throughput manier kan worden gekwantificeerd.

high-throughput-measurement-extracellular-dna-release-quantitative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an in vitro technique to generate and isolate neutrophil extracellular traps (NETs). Neutrophils are isolated from peripheral blood and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) to produce NETs. During incubation, the neutrophils undergo a process of cell death (NETosis) to release NETs comprising decondensed chromatin mixed with granular cytoplasmic proteins.

An In Vitro Technique to Generate Human Neutrophil Extracellular Traps

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor...

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

Neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) zijn netwerken van DNA, histonen en neutrofielen eiwitten. Hoewel een deel van de aangeboren immuunrespons zijn NET betrokken bij autoimmuniteit en trombose. Dit protocol beschrijft een eenvoudige werkwijze voor honden neutrofielen isolatie en kwantificering van netten met een microplaat fluorescentie assay.

A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging

We beschrijven de methoden om te isoleren canine neutrofielen van volbloed en visualiseren van netto vorming in levende neutrofiele granulocyten met behulp van fluorescentie microscopie. Ook beschreven zijn protocollen te kwantificeren netto vorming en citrullinated Histon H3 (citH3)-expressie met immunofluorescentie microscopie.

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Dit protocol beschrijft een zeer gevoelige en hoge doorvoer neutrofiele extracellulaire val (NET) assay voor de semi-automatische kwantificering van ex vivo NET vorming door immunofluorescentie driedimensionale confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het evalueren van de netto vorming en afbraak na verschillende prikkels en kan worden gebruikt voor het bestuderen van potentiële NET-gerichte therapieën.

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

We presenteren een protocol voor een gemodificeerde sandwich enzym-gebonden immunosorbent assay techniek om kwantitatief twee componenten van neutrofiele extracellulaire val restanten, myeloperoxidase geconjugeerd-DNA en neutrofiele elastase geconjugeerd-DNA complexen, afgeleid van geactiveerde neutrofielen.

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

We laten zien, hoe twee-foton microscopie gebruikt voor de observatie van de dynamiek van neutrofiele granulocyten in de longen besmet terwijl ze fagocyteren pathogenen of produceren neutrofielen extracellulaire vallen (NET).

Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

Leer hoe je NET-vorming in menselijke neutrofielen kwantitatief meet met high-throughput methoden. Deze technieken helpen bij het onderzoek naar inflammatoire ziekten en signaleringsroutes.

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen

Meer video's verkennen