Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters
10 mei 2015
Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de activiteit van de ubiquitine-enzymen in cellen te visualiseren. Dit wordt bereikt door cellen te kweken tot een hoge dichtheid en ze te oogsten om de productie van een geconcentreerd lysate als tweede stap te vergemakkelijken. Zachte mechanische lyses wordt gebruikt om een lysaat te produceren dat een metabolisch beeld van het cytoplasma van de cel behoudt.
Vervolgens worden de enzymen geïncubeerd met hemagglutinine-afgeleide sondes om de de-ubiquitine-enzymen te labelen door te reageren met de actieve plaats-cysteïnerest, de resultaten tonen de activiteitsprofielen van veel de-ubiquitine-enzymen op basis van Western blotting en daaropvolgende chemiluminescente detectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals reguliere western blotting, is dat het de gebruiker in staat stelt de activiteiten van meerdere enzymen te visualiseren. In één experiment, bereid celkweekmedia voor door Ali, citerend 30 milliliter dobe docos, gemodificeerd eagles medium of DMEM plus 10% foetaal bovien serum in een 50 milliliter conische buis om te kweken.
De cellen voor het experiment overbrengen bevroren M 17 of he A cellen van vloeibaar stikstofopslag naar een kleine beker met lauw water. Breng vervolgens de cellen over naar de 50 milliliter conische buis met 30 milliliter media. Voeg vervolgens wat media toe aan de cellenbuis en breng de gesuspendeerde cellen binnen vijf seconden na ontdooien over.
Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 450 Gs om een celpellet te verkrijgen. Voeg vervolgens 20 milliliter media toe aan een T 75 fles. Verwijder het media van de cellen met behulp van zuiging.
Voeg vijf milliliter vers media toe aan de celpellet en resuspendeer. Breng de vijf milliliter celsuspensie over naar de 20 milliliter media in de T 75 fles en incubeer bij 37 graden Celsius. Ververs het media om de drie dagen om de cellen te oogsten.
Verwijder het media via zuiging, wees voorzichtig om de cellen niet aan te raken. Was de cellen met vijf milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossing of PBS. Verwijder PBS met behulp van zuiging.
Voeg vervolgens drie milliliter tripsin EDTA toe aan de T 75 fles en incubeer gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na incubatie zes milliliter vers media toe aan de fles en resuspendeer de cellen.
Breng de suspensie over naar een 15 milliliter conische buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 290 Gs, verwijder het supernatant en voeg vijf milliliter PBS toe. Tik zachtjes op de bodem van de buis om de pellet te breken voordat centrifusie gedurende vijf minuten bij 290 Gs plaatsvindt. Na het drie keer herhalen van de PBS-was, verwijder het oude PBS en resuspendeer de cellen in één milliliter vers PBS.
Breng vervolgens de cellen over naar een einorbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 290 GS. Om cellyse uit te voeren, meet het geschatte volume van de pellet met behulp van een pipette en weeg glazen kralen en een massa-volumeverhouding van een-op-een af. Voeg lysebuffer toe aan de pellet bij twee keer het volume van de pellet.
Voeg vervolgens de glazen kralen toe aan de pellet en lyse. Lyseer de cellen in de einorbuis gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius door te voort te draaien in een koude ruimte. Centrifugeer kort gedurende 30 seconden bij 200 GS.
Om de kralen te laten bezinken en het supernatant te verzamelen. Voeg dezelfde hoeveelheid glazen kralen toe als eerder aan het supernatant voor het voortdraaien, opnieuw bij maximale agitatie gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius na kortdurende centrifusie gedurende 30 seconden bij 200 Gs. Om de glazen kralen te laten bezinken, verzamel het supernatant.
Centrifugeer tenslotte gedurende vijf minuten bij 5.030 GS. Om de kernen, membranen en ongebroken cellen te verwijderen, verzamel het supernatant, dat het cellysaat is voor weefselderivatisatie, uitgevoerd door Cinco nimic zuur of BCA-analyse. In een 96-wellplaat om de eiwitconcentratie van het lysaat te bepalen met behulp van een chole metrische 96-wellplaatlezer zoals gespecificeerd in het BCA-eiwitanalysekitprotocol.
Na bepaling van de eiwitconcentratie, breng een aliquot overeenkomend met 20 microgram totaal eiwit naar 50 microliter met behulp van gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens twee microliter 1.35 micromolair van HAUB vinylceltelefoon toe aan de oplossing. Het resultaat is 20 microgram lysaat naar 50 nanomolair van sonde in de uiteindelijke reactiemengsel.
Dit is in grote molaire overmaat. Om het markeren van functionele de-ubiquitine-enzymen of dubs te waarborgen, laat de oplossing gedurende één uur incuberen bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens laly-monsterbuffer toe aan de oplossing.
Voor een reactievolume van 52 microliter gebruik 26 microliter van twee keer monsterbuffer, 13 microliter van vier keer monsterbuffer of 8,87 microliter van zes keer monsterbuffer. Incubeer het monster gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius. Koel op ijs.
Voordat het gel wordt geladen om de western blot uit te voeren, laad eerst een 12-well vier tot 20% trisglycinegel met 40 microliter van het bereide monster. Laat het gel lopen bij 95 volt totdat de ionenfront het onderste bereikt. Voer vervolgens een overnachtelijke overdracht van het gel uit op een polyvinyl difluoride of PVDF-membraan volgens de volgende stappen.
Overdracht. Incubeer eerst het membraan in de AMDO zwarte vlek en scan het membraan om een afbeelding te verkrijgen die de hoeveelheid eiwit in elke baan laat zien. Bewaar vervolgens het membraan en incubeer in 5% melk in PBS gedurende één uur om te blokkeren. Incubeer vervolgens het membraan in het primaire anti-HA-antilichaam met een concentratie van één op 10.000 in 5% melk in PBS, hetzij overnacht bij vier graden Celsius of gedurende vier uur bij kamertemperatuur.
Na incubatie voer drie wasbeurten uit gedurende vijf minuten
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het visualiseren van de activiteit van deubiquitinerende enzymen in cellen met behulp van gespecialiseerde probes. De techniek maakt de detectie van meerdere enzymactiviteiten mogelijk, wat inzicht biedt in potentiële therapeutische doelwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Deubiquitinerende enzymen spelen een cruciale rol in cellulaire processen.
- Inzicht in hun activiteit kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën.
- Huidige methoden kunnen mogelijk meerdere enzymactiviteiten niet effectief visualiseren.
- Dit protocol is bedoeld om deze beperkingen aan te pakken.
Doel van de studie
- Om de activiteit van deubiquitinerende enzymen in gekweekte cellen te visualiseren.
- Om detectiemethoden voor enzymactiviteitsprofielanalyse te verbeteren.
- Om potentiële therapeutische doelwitten te identificeren via analyse van de enzymactiviteit.
Gebruikte methoden
- Cellen worden gekweekt tot een hoge confluentie en geoogst.
- Er wordt een milde mechanische lysis uitgevoerd om een geconcentreerd lysaat te produceren.
- Enzymen worden geïncubeerd met probes afgeleid van hemagglutinine.
- De activiteit wordt beoordeeld middels Western blotting en chemiluminescentie-detectie.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt de visualisatie van meerdere deubiquitinerende enzymactiviteiten mogelijk.
- Activiteitsprofielen worden gegenereerd op basis van Western blot-resultaten.
- De resultaten tonen de effectiviteit van de techniek aan in vergelijking met traditionele methoden.
- Via deze benadering kunnen potentiële nieuwe therapeutische doelwitten worden geïdentificeerd.
Conclusies
- Dit protocol biedt een robuuste methode voor het bestuderen van deubiquitinerende enzymen.
- Het verbetert het vermogen om enzymactiviteiten in cellulaire contexten te visualiseren.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het meten van de activiteit van deubiquitinerende enzymen maakt doelwitvalidatie mogelijk in neurodegeneratieve en oncologische pathways waarbij dysregulatie van het ubiquitine-proteasoom betrokken is. Deze assay biedt een snelle, gemultiplexte uitlezing van functionele enzymtoestanden, wat vroege hypothesetesten en mechanistische risicoreductie ondersteunt. Door activiteitsprofielen over verschillende cellijnen vast te leggen, biedt het informatie voor portfolio-triage en inspanningen voor lead-identificatie in ziektegebieden met een overvloed aan potentiële doelwitten.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door enzymactiviteit te koppelen aan ziekterelevante fenotypen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe visualisatie van de binding aan de actieve site.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door actieve van inactieve enzympools in complexe lysaten te onderscheiden.
- Operationele waarde: Versnelt targettriage door meerdere deubiquitinerende enzymen te profileren in een enkel assayformat.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde lysaatsystemen voor voor downstream compound-screening tegen deubiquitinerende enzymactiviteit.
- Operationele waarde: Genereert kwantitatieve, reproduceerbare activiteitsmetingen die compatibel zijn met detectieplatforms voor Western blot.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert assay-standaardisatie door gebruik te maken van actieve site-gerichte probes die functionele enzymtoestanden rapporteren.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare evaluatie mogelijk van compound-effecten op enzymactiviteit over meerdere targets tegelijkertijd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt activiteitsmetingen in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door middel van vergelijkingen tussen ziekterelevante cellijnen.
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door geconserveerde activiteitspatronen over verschillende modellen heen te identificeren.
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door enzymactiviteit te monitoren als functionele readout van pathwaymodulatie.
- Operationele waarde: Levert gegevens voor mechanistische risicoreductie die de doelwitselectie voor IND-ondersteunende studies informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het genereren van hypothesen over targets tot de identificatie van leads, wat screenings op basis van activiteit en validatiecascades mogelijk maakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door differentiële enzymactiviteit tussen ziekte- en controlemodellen aan te tonen.
- Screening: Levert assay-klare lysaten met kwantificeerbare activiteitsuitkomsten voor de evaluatie van verbindingenbibliotheken.
- Analytics: Genereert chemiluminescente signaalintensiteiten die een vergelijkende analyse van enzymactiviteitstoestanden mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt vroege activiteitsprofielen met preklinische continuïteit via cross-model validatie in neuronale cellijnen en kankercellijnen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het profileren van deubiquitinerende enzymactiviteit over diverse therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door ambiguïteit in het doelmechanisme van actie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde probe-gebaseerde labelings- en lysisprocedures.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege functionele validatie van targets te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van meetbare activiteitsveranderingen in ziekte-modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek, lysis-optimalisatie en Western blot-detectie.
- Afhankelijk van toegang tot actieve site-probes afgeleid van hemagglutinine en chemiluminescente imaging-systemen.
- Maakt standaardisatie van de samenstelling van de lysisbuffer en het gebruik van protease-remmers tussen teams noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor adaptatie met betrekking tot de toegankelijkheid van probes in weefselmonsters versus gekweekte cellen.
- Beperkt door de specificiteit van de probe en potentiële off-target labeling onder suboptimale incubatiecondities.
