Name: Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van Streptococcus iniae Infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Leer micro-injectie van Streptococcus iniae in de otische vesikel van zebravislarven voor niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons met confocale microscopie en fotolabeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag lab leden bedanken voor de zebravis verzorging en onderhoud. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 aan EA Harvie en NIH R01GM074827 aan Anna Huttenlocher.

Volwassen en embryonale zebravis werden onderhouden in overeenstemming met de Universiteit van Wisconsin-Madison Research Animal Resources Center. 1. Voorbereiding Microinjection Naalden <ol><li> Bereid dunne wand glazen capillaire injectienaalden (1,0 OD / 0.75 ID) met behulp van een micropipet trekker apparaat met de volgende instellingen: luchtdruk 200, warmte 502, trek 90, snelheid 80, tijd 70, zendtijd aan het begin van pull 5, zendtijd aan het einde van pull 5. </li><li> Met behulp van fijne pincet, afbreken van de punt van de naald getrokken, zodat de tip opening heeft een diameter van ongeveer 10 micrometer. </li></ol> 2. Voorbereiden van Larvale Injectie Gerechten <ol><li> Spoel een gel kam met lane breedte van ongeveer 4-5 mm in steriel water en laten drogen. </li><li> Bereid een 1,5-2% hoge smelt agaroseoplossing in E3 medium 19 en magnetron totdat de oplossing helder is. Eenmaal afgekoeld, giet wat van de agarose in een petrischaal (100 x 15 mm) en werveling,toevoegen net genoeg agarose volledig te bedekken de bodem van de schaal. </li><li> Nadat de agarose is gestold laag, plaats de gewassen en gedroogde gel kam boven zodat de niet-gekamde einde slechts rust op de top van de petrischaal en gekamd uiteinde raakt de agarose. Zorg ervoor dat de kam zo horizontaal mogelijk, waardoor een 30 ° hoek ten opzichte van de onderste agaroselaag. </li><li> Giet een extra kleine hoeveelheid agarose aan het grensvlak tussen de kam en onderste agarose laag, zodat de verse agarose laag bedekt de putjes van de kam. Laat volledig afkoelen voordat u de kam. Met behulp van een pipet tip, verwijder eventuele overhangende stukken van agarose uit de putten. </li><li> Giet E3 medium bovenop de injectie schimmel en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Voor elk gebruik, te vervangen door vers medium en warm injectie hellingbanen bij 28,5 ° C gedurende ten minste een uur voor de injectie. </li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan injectie, vervangen E3 op de injectie helling metE3 medium dat 200 ug / ml ethyl 3-aminobenzoaat (tricaïne). </li></ol> 3. Voorbereiden van S. iniae Inoculum <ol><li> Bereid en autoclaaf Todd Hewitt bouillon medium aangevuld met 0,2% gistextract en 2% proteosepepton (THY + P): 30 g / l Todd Hewitt, 2 g / l gistextract, 20 g / l proteosepepton. Voor agarplaten, voeg 14 g / l agar. </li><li> Bereid bacterieculturen de avond voor infecties door pipetteren een 100 ul aliquot van bevroren bacteriële bouillon in 10 ml van THY + P bouillon in een afgesloten buis van 15 ml. Incubeer overnacht zonder roeren bij 37 ° C. Na 14-16 uur van groei, gebruik maken van de &#39;s nachts cultuur ofwel diepvries voorraden te maken of voor te bereiden voor gebruik in injecties. </li><li> Voeg vriezer voorraden door het plaatsen van 1 ml van de overnacht cultuur in 500 pi 80% glycerol in een 1,7 ml centrifugebuis. Om vries-dooi-cycli te vermijden, moet 100 pi één aliquots van dit mengsel en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Voor S. iniae gebruikt in infections, verdunnen de overnacht cultuur 1: 100 voor een totaal volume van 10 ml cultuur door het toevoegen van 0,1 ml &#39;s nachts cultuur tot 9,9 ml van THY + P bouillon. Kweek bij 37 ° C zonder schudden gedurende ongeveer 4-5 uur. Controleer de optische dichtheid (OD) bij 600 nm met een spectrofotometer Nanodrop en oogst de bacteriën in mid-logaritmische fase wanneer de OD600 nm bereikt 0,250-0,500. Een OD600 nm van 0,250 overeen met ongeveer 10 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml. </li><li> Pellet 1 ml van de bacteriekweek in een 1,7 ml centrifugebuis bij 1500 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in 1 ml vers PBS en herhaal. Meet de OD600 nm van de bacteriën in PBS, pellet en resuspendeer in PBS om de gewenste concentratie te bereiken. </li><li> Om te helpen bij het visualiseren van micro-injectie, toe fenolrood om de bacteriële suspensies voor injectie voor een uiteindelijke concentratie van 0,1%. </li><li> Voor experimenten met de injectie van hitte gedode bacteriën, verwarm de bacteriën in PBS bij 95 ° C gedurende 30 min.Controleer of de warmte dodingsproces verminderde het aantal levensvatbare bacteriën detecteerbare niveaus door bekleden een injectie (ongeveer 1 nl) op vaste THY + P agarplaten en overnacht incuberen bij 37 ° C. </li></ol> 4. Labeling S. inia e met een CellTracker rode fluorescerende kleurstof <ol><li> Labelen levende bacteriële cellen, bereiden een voorraad oplossing van een CellTracker fluorescente kleurstof of gelijkwaardig. Aangezien de gebruikte kleurstof komt 20 x 50 ug hoeveelheden poeder en moet worden geresuspendeerd in DMSO, voeg 7,3 pl DMSO aan de buis een 10 mM voorraad concentratie te verkrijgen. </li><li> Test verschillende kleurstof concentraties (bijvoorbeeld 0,5-25 pM) op de bacteriën aan de laagste optimale concentratie dat de cellen kleurt bepalen. Snel delende cellen en meer experimenten kunnen een hogere concentratie aan kleurstof vereisen. <ol><li> Pellet 1,0 ml bacteriecultuur in een 1,7 ml buis door centrifugeren zoals hierboven (deel 3) beschreven. Resuspendeer de pellet in 1ml verse PBS en voeg de juiste hoeveelheid kleurstof om de bacteriecultuur. </li><li> Incubeer zonder roeren bij 37 ° C gedurende 30 min. Spin beneden de bacteriën en resuspendeer in 1 ml voorverwarmde THY + P bouillon en geïncubeerd zonder roeren gedurende nog 30 min bij 37 ° C. </li><li> Spin down de bacteriën en was twee keer in PBS voor het meten van de OD600 nm en verdunnen van de bacteriën voor micro-injectie, zoals hierboven (deel 3) beschreven. We injecteren doorgaans ongeveer 100 CFU in 1 nl injectie volume voor onze studies van leukocytaantrekking en fagocytose. </li></ol></li></ol> 5. Voorbereiding van de zebravis Larven voor Infecties <ol><li> Opgezet broedparen de avond tevoren en het verzamelen van embryo&#39;s, zoals beschreven door Rosen et al. 27 Incubate embryo&#39;s in E3 medium bij 28,5 ° C tot klaar om te infecteren. </li><li> Voor zebravis die worden afgebeeld, om de ontwikkeling van pigment (melanisatie) door toevoeging van N-fenylthioureum (PTU) aan deE3 medium bij 24 uur na de bevruchting (HPF) voor een eindconcentratie van 0,2 nM. </li><li> Voor infecties met embryo&#39;s in de leeftijd 2 dpf, dechorionate embryo&#39;s handmatig met een paar fijne pincet. Alternatief dechorionate embryos E3 verwijderen en te vervangen met pronase (2 mg / ml) gedurende 5 minuten of totdat zacht pipetteren breekt embryo uit het chorion. De meeste larven moeten op natuurlijke wijze zijn uitgebroed door 3 dpf. </li><li> Verdoven zebravis enkele minuten voorafgaand aan een infectie door het plaatsen van dechorionated larven in E3 medium dat 200 ug / ml tricaïne. </li></ol> 6. Otic Vesicle Injectie van S. iniae in drie dagen oude larven <ol><li> Zet de microinjector en stel de tijd scala aan &quot;milliseconde&quot;. Open de klep op de kooldioxide tank te laten gas in de lijn. De druk van de microinjector moet ongeveer 20 PSI lezen. Stel de druk in de microinjector eenheid door het rechtsom draaien van de zwarte gekartelde knop voor incrverlicht druk of linksom te draaien voor verminderde druk. </li><li> Vortex de bereide S. iniae cultuur in fenol rood en PBS en gebruik een microloader tip om 2-3 ul van de cultuur te laden in een getrokken capillaire injectienaald. </li><li> Monteer de geladen naald op een micromanipulator aangesloten op een magnetische standaard en plaats onder een stereomicroscoop zodat de naald in ongeveer 45-65 ° hoek ten opzichte van de basis van de microscoop. </li><li> Druk op het voetpedaal van de microinjector tot een daling van het inoculum afgeven op de punt van de naald. Meet de diameter van de druppel met de schaalbalk in de oculaire lens van de microscoop. <ol><li> Alternatief, de mogelijke diameter van de druppel door het injecteren van een volume in een druppel minerale olie op een microscoopglaasje met een schaalbalk. De diameter van de druppel moet ongeveer 0,10 mm, dat is ongeveer 1 nl volume. </li><li> Pas de druppelgrootte door het aanpassen van de tijdsduur instellen opde microinjector of door knippen meer af van de naald met fijne pincet. Merk op dat de injectietijd moet tussen 20 - 35 msec te voorkomen dat te veel weefselschade. </li></ol></li><li> Met een plastic overdracht pipet, overdracht 12 geanesthetiseerd larven in elk putje van de spuitgietmatrijs. </li><li> Gebruik een glazen staaf, haar loop, of plastic tip om voorzichtig de positie van de larven, zodat de hoofden zijn gericht naar de achterkant van de microscoop en de dooierzakken zijn tegen de linkerkant van de put. Richt het linkeroor van de larve naar het plafond. </li><li> Kijkend door de oculaire lens van de stereomicroscoop, gebruikt u de knoppen op de micromanipulator aan line-up de geladen naald met de otic blaasje zodat beide zijn in hetzelfde gezichtsveld. Pierce de buitenste epitheellaag van de otic blaasje met de naald, zodat de naald tip is net binnen het blaasje. </li><li> Druk op het voetpedaal om 1 nl van de gewenste dosis van S. te injecteren iniae. Zorg ervoor dat u een te gebruikenlaag genoeg druk om niet de holte scheuren. Als de injectie is voltooid, de otic blaasje, maar niet het omringende weefsel moeten vullen met het fenolrood inoculum (figuur 1 Ai). Verwijder onmiddellijk alle mis-geïnjecteerde vis uit de injectie plaat. </li><li> Trekken voorzichtig de naald uit de larve en beweeg de injectie plaat met de hand, zodat de volgende larve is in zicht. Doe dit onder 5x vergroting. Opmerking: terugtrekken van de naald kan leiden tot de afzetting van sommige bacteriën buiten het otisch blaasje, die overleving en leukocytaantrekking resultaten scheef. Om dit te voorkomen, is het raadzaam om fluorescerende kleurstof-gelabelde bacteriën te injecteren en visueel scannen geïnjecteerd larven onder een tl-microscoop om eventuele larven waar dit heeft plaatsgevonden verwijderen. Een correct ingespoten larve wordt getoond in (figuur 1 Bi). </li><li> Om het injectievolume / inoculum gelijk blijft in de loop van het experiment injecteren een druppel van de bacteriële suspension in een 1,7 ml centrifugebuis bevattende 100 pi steriel PBS na elke 48ste embryo. Plate 100 ul op THY + P agarplaten bij 37 ° C overnight CFU bepalen het injectievolume. </li><li> Als de hele groep van 12 larven op de injectie oprit is geïnjecteerd, zorgvuldig gebruiken een plastic overdracht pipet om de larven uit de bronnen te verwijderen en plaats ze in een nieuwe petrischaal (35 x 10 mm 2). Verwijder de tricaïne oplossing en te vervangen door ongeveer 2 ml vers E3 medium om de larven te herstellen. </li><li> Pipet geïnjecteerd larven in afzonderlijke putjes van een plaat met 96 putjes en incubeer bij 28.5 ° C. Monitor larven in de tijd om te overleven in deze platen of later te verwijderen voor de beeldvorming of CFU telt. </li></ol> 7. Sudan Black kleuring van neutrofielen Opmerking: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur in een kleine petrischaal (35 x 10 mm2) op een rondschudapparaat tenzij otherwise vermeld. Voor elke stap is de hoeveelheid toegepaste reactant is ongeveer 2 ml per schaal, met slechts voldoende vloeistof volledig bedekken de larven. <ol><li> Voor bevestiging van geïnfecteerde larven, gebruik dan een glas Pasteur pipet om E3 medium te verwijderen en te vervangen door een ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS oplossing. Onmiddellijk plaats de vis bij 4 ° C te euthanaseren. Fix overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was 3 maal in PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Vlek met Sudan Black (0,18% stock verdund 1: 5 in 70% ethanol, 0,1% fenol) gedurende 30 minuten tot 5 uur. Gebruik een stereomicroscoop om te controleren of neutrofielen korrels tot de vlek hebben genomen. </li><li> Voer een reeks van 5 min wassingen ab één wassen in 70% ethanol gevolgd door een spoeling van een 1: 1 verhouding van 70% ethanol en PBS, gevolgd door een laatste wasbehandeling in PBS. </li><li> Rehydrateren in PBS plus 0,1% tween (PBT). </li><li> Om pigment verwijderen uit de larven, wassen in 1% kaliumhydroxide / 1% waterstofperoxide gedurende ongeveer 6-10 minuten. Bewaken van de steekproef Closely en na ongeveer 5 minuten, controleer dan de larven onder een stereomicroscoop om te zien hoeveel van het pigment is verdwenen. Als de oplossing overblijft te lang, zal de dooierzakken zwellen en barsten. </li><li> Was 3 maal gedurende 5 minuten elk met PBS. </li><li> Bewaar de monsters in ofwel PBS of PBT bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week tot klaar om imago en tellen. </li><li> Om het beeld Sudan Black-gekleurde larven, de overdracht van de vis in de PBT en vervolgens in 80% glycerol en plaats op een enkele holte depressie dia. Positie vast larven onder een stereomicroscoop met een pipet tip. Afbeelding met behulp van een kleuren digitale camera op een stereomicroscoop (figuur 1 Aii-iv). </li></ol> 8. Bepaling van het aantal levende bacteriën uit Infected Larven <ol><li> Euthanaseren larven op de gewenste tijden na infectie in een ijskoude 200-300 mg / l oplossing van tricaïne in E3 medium. </li><li> Pipet geëuthanaseerd larven in 1,7 ml centrifuge buizen. Verwijder de tricaïne oplossing en vervangen door 100 pl van 0,2%Triton X-100 in PBS (PBSTx). </li><li> Homogeniseren larven door het passeren van op en neer 10 keer door een 27 G naald. </li><li> Maak seriële verdunningen van homogenaten in steriele PBS. Als bijvoorbeeld de infectieuze dosis van 100 CFU Pipetteer 100 ul van het homogenaat in 900 pi steriel PBS. Met behulp van een nieuwe pipet tip, overdracht 100 ul van de verdunde homogenaat in 900 pi steriel PBS. </li><li> Plaat 100 pl van de verdunningen op Columbia agar CNA voor selectieve isolatie van gram-positieve bacteriën, en incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur. Dit medium zal grotere selectie opleveren dan de THY + P agarplaten, die de groei van zowel gram-negatieve en gram-positieve bacteriën ondersteunt. </li><li> Bij platen met minder dan 500 afzonderlijke kolonies Tel het aantal kolonies en vermenigvuldigen met de verdunningsfactor het aantal CFU te bepalen. </li></ol> 9. Bevestiging van Larven for Imaging <ol><li> Fix larven in een ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS-oplossing als debeschreven in paragraaf 7. </li><li> Bij kamertemperatuur was 3 maal gedurende 5 minuten elk in PBS voor de beeldvorming. </li></ol> 10. Voorbereiding van Larven for Live Imaging <ol><li> Bereid een 1,5% laag smeltpunt agarose oplossing E3 door verwarmen in de magnetron totdat de oplossing helder is. </li><li> Plaats agarose oplossing in een 55 ° C waterbad te laten afkoelen, maar niet te harden. </li><li> Tricaïne Aan de agarose tot een eindconcentratie van 0.016%. </li><li> Met behulp van een plastic transferpipet, plaatst 4-5 verdoofd larven in een glazen bodem schotel op het podium van een stereomicroscoop. </li><li> Verwijder de tricaïne en agarose oplossing van 55 ° C waterbad en laat afkoelen op kamertemperatuur gedurende 1-2 min. Terwijl de agarose wordt koeling, verwijder zoveel vloeistof uit de verdoofde larven mogelijk. </li><li> Giet de afgekoelde agarose in de schaal tot ongeveer de helft van het oppervlak beslaan. Zwenk de schotel naar de agarose verspreiden. Merk op dat als de agarosete warm is, zal de larven te doden. Ook als teveel agarose wordt toegevoegd aan de schotel, de objectieflens van de microscoop kan de bodem van de schotel al tijdens het scherpstellen door agarose. </li><li> Met behulp van een transferpipet, halen de larven die hebben gedreven aan de zijkanten van de schotel en pipet ze terug naar het centrum. </li><li> Onder de stereomicroscoop, zachtjes de positie van de larven naar wens met een haar loop, een lange pipet tip of een glazen staaf. Voor beeldvorming van de otic blaasje, plaatst de larven zodat de linker otic blaasje plat tegen de bodem van de schaal. </li><li> Laat de agarose koel ongeveer 10 minuten voordat u het gerecht. De larven kunnen posities verschuiven als de agarose is niet vast. Voorzichtig pipet enkele tricaïne en E3 oplossing naar de top van de agarose laag om het vochtig te houden. </li></ol> 11. confocale Imaging van infectie <ol><li> Plaats de glazen bodem schotel met larven op het podium van een omgekeerde microscoop met een FV-1000 laser scanning confocal systeem. </li><li> Stel de pinhole tot 200-300 micrometer en met een numerieke opening van 0,75 / 20X objectief, set z-stacks met 3-6 micrometer plakjes. </li><li> Gebruik doorlopende lijn scannen naar het laservermogen en de detector te krijgen voor elk kanaal aan te passen. </li><li> Met behulp van sequentiële lijn scannen voor elk fluorescentie kanaal (bijvoorbeeld 488 en 543 nm) en differentieel interferentie contrast (DIC), voert een time lapse film van de linker otic blaasje elke 3 min voor 2-6 uur tot indienstneming, fagocytose door neutrofielen te observeren en macrofagen. Voor langere tijd cursussen, plaats een deksel op de petrischaal om verdamping en uitdroging van de agar te voorkomen. </li><li> Acquire foto van vaste (figuur 1B) of live (figuur 2) larven op 20x of 40x vergroting. </li></ol> 12. Photoconversion van Dendra2 gelabelde leukocyten in de otic Vesicle Opmerking: Dendra2 kan worden photoconverted van groen naar rood fluorescentiedoor focusseren van een 405 nm laser (50-70% laservermogen moet voldoende zijn) op het gebied van belang (ROI) gedurende 1 min. Hieronder is de stap-voor-stap protocol voor de FV-1000 laser scanning confocale systeem: <ol><li> Visualiseer het monster met behulp van een z-stack scan met de 488 nm en 543 nm lasers. Gebruik doorlopende lijn scannen naar het laservermogen en de detector bij te stellen. Controleren om ervoor te zorgen dat er geen ongeluk photoconverted rode fluorescentie. </li><li> Op het venster &quot;Image Acquisition Control&quot;, selecteer onder &quot;Stimulus Instelling&quot; de &quot;Use Scanner&quot; tool en kies &quot;hoofd&quot;. Selecteer de 405 nm laser en zet deze op 70% vermogen. Met behulp van de optie cirkel, bepalen de ROI in de otic blaasje. </li><li> Onder &quot;Stimulus Start instellen&quot; selecteer &quot;Activering in serie&quot; met een pre-activatie van 1 frame en een activatie tijd van 60.000 msec. Op het venster &quot;Acquisitie Instelling&quot; onder de &quot;Time Scan rubriek&quot;, kies 2 intijdsinterval van 0:01:00 (één voor pre- en één voor post- photoconversion). Opmerking: Na de time lapse serie scan voltooid is, moet de Dendra2 zijn photoconverted om zijn rode fluorescerende toestand. </li><li> Scan het monster door een z-stack met de 488 nm en 543 nm lasers om de photoconverted rode fluorescentie alsmede alle resterende groene fluorescentie (figuur 3) zichtbaar. </li></ol>

<ol><li>Agnew, W., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+iniae%3A+An+aquatic+pathogen+of+global+veterinary+significance+and+a+challenging+candidate+for+reliable+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination.</a> Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).</li>
<li>Danilova, N., Steiner, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+develop+in+the+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">B cells develop in the zebrafish pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).</li>
<li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+a+gene+expression+profiling%2C+in+situ+hybridization+and+immunological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li>
<li>Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hematopoiesis+and+Developing+Lymphoid+Organs+in+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish.</a> Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).</li>
<li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).</li>
<li>Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus-Zebrafish+Model+of+Bacterial+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis.</a> Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).</li>
<li>Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+gene+family+and+TIR-domain+adapters+in+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio.</a> Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).</li>
<li>Meijer, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+Toll-like+receptor+and+TIR+domain+adaptor+families+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+immunol%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish.</a> Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).</li>
<li>Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Complement+Factor+B-Like+cDNA+clone+from+the+Zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+immunol%22%5BJournal%5D)">A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio).</a> Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).</li>
<li>Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+respiratory+burst+assay+using+zebrafish+kidneys+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos.</a> J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).</li>
<li>Yoo, S. K., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+photolabeling+of+neutrophil+trafficking+during+inflammation+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).</li>
<li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Screen+for+Tuberculosis+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16779(2011).</li>
<li>Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Optimization+of+a+High+Throughput+Setup+to+Study+Staphylococcus+epidermidis+and+Mycobacterium+marinum+Infection+as+a+Model+for+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signaling+mechanisms+mediate+neutrophil+attraction+to+bacterial+infection+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury.</a> Cell. Microbiol. , (2012).</li>
<li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+Inhibits+Neutrophil+Recruitment+during+the+Early+Stages+of+Streptococcus+pyogenes+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVolhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate%2C+migrate%2C+produce+melanin%2C+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).</li>
<li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li>
<li>Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Zebrafish+to+Probe+the+Divergent+Virulence+Potentials+and+Toxin+Requirements+of+Extraintestinal+Pathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathog. 5 (12), e1000697(2009).</li>
<li>Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immune+Response+to+Streptococcus+iniae+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae.</a> Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).</li>
<li>Haddon, C., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Ear+Development+in+the+Embryo+of+the+Zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio.</a> J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).</li>
<li>Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish inner ear.</a> Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), (2009).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De infectie hier gebruikte methode is bruikbaar voor de studie van de gastheer immuunrespons op een aanvankelijk gelokaliseerde infectie in 2-3 dpf embryo&#39;s en larven. De focus van een inflammatoire stimulus, zoals infectie, in een gesloten ruimte zoals de otic blaasje maakt de studie van neutrofielen en macrofagen chemotaxis en fagocytose. Een waarschuwing injecteren bacteriën in de otic blaasje is dat het vermogen van neutrofielen efficiënt fagocyteren bacteriën in met fluïdum gevulde holtes kan afhankelijk van de...

Streptococcus iniae is een belangrijke aquatische ziekteverwekker die kan veroorzaken systemische ziekte bij zowel vissen als mens 1. Terwijl S. iniae is verantwoordelijk voor grote verliezen in de aquacultuur is ook een potentiële zoönotische pathogenen, kunnen veroorzaken ziekte bij immunogecompromitteerde menselijke gastheren met klinische pathologieën vergelijkbaar met die veroorzaakt door andere streptokokken menselijke pathogenen. Gezien de overeenkomsten met humane pathogenen, is het belangrijk S. bestuderen iniae pathogenese van de ziekte in het kader van een natuurlijke gastheer. Een volwassen zebravis model van S. iniae infectie bleek robuuste infiltratie van gastheer leukocyten naar de gelokaliseerde plaats van de infectie, evenals een snelle tijd tot de dood te hosten, een tijd te kort om het adaptieve immuunsysteem 7 betrekken. Om te winnen een diepgaande kijk in de aangeboren immuunrespons tegen S. iniae infectie in vivo, moet een model dat meer vatbaar n gebruikenon-invasieve live beeldvorming. De larvale zebravis heeft een aantal voordelen dat het een steeds aantrekkelijker gewervelde model voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties te maken. Zebravis zijn relatief goedkoop en gemakkelijk in gebruik en onderhoud in vergelijking met zoogdieren modellen. Adaptieve immuniteit is niet functioneel volwassen tot 4-6 weken na de bevruchting, maar larven hebben een sterk geconserveerd gewervelde aangeboren immuunsysteem met complement, Toll-like receptoren, cytokinen en neutrofielen en macrofagen met antimicrobiële mogelijkheden, waaronder fagocytose en respiratoire burst 2-6, 8-11. Bovendien, de genetische traceerbaarheid en optische transparantie van de embryonale en larvale stadia van ontwikkeling mogelijk maken de vorming van stabiele transgene lijnen met fluorescent gelabelde immuuncellen waardoor gastheer-pathogeen interacties in real time in vivo onderzocht. De generatie van deze transgene lijnen met een photoconvertible eiwit zoals Dendra2 maakt het volgen van afzonderlijke gastheercel oorsprong en het lot in de loop van de infectie 12. Bij de ontwikkeling van een zebravis larvale infectie model, zal de gekozen locatie van micro-injectie te bepalen of er een infectie is in eerste instantie gelokaliseerde of systemische. Systemische bloed infecties in de caudale ader of Duct van Cuvier worden meestal gebruikt om microbiële ziekteverwekkers in de zebravis te bestuderen en zijn nuttig voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en microbiële cellen, cytokine reacties, en verschillen in virulentie tussen ziekteverwekker stammen. Voor langzamer groeiende micro-organismen kunnen vroeg injectie in de dooierzak van een embryo in de 16-1,000 cellig stadium worden gebruikt om een systemische infectie 13,14 verwekken, optimale ontwikkelingsstadium voor micro-injectie van een langzaam groeiende micro-organisme blijkt tussen de 16-128 cellig stadium 15. Echter, dooierzak injecties van veel microben in latere stadia van de gastheer ontwikkeling neiging dodelijke aan t te zijnhij gastheer te wijten aan de voedselrijke omgeving voor de microbe en gebrek aan infiltreren leukocyten 16-18. Een gelokaliseerde infectie resulteert meestal in gerichte migratie van leukocyten naar de plaats van infectie die gemakkelijk kan worden gekwantificeerd met niet-invasieve beeldvorming. Dit type infectie kunnen zorgen voor dissectie van de mechanismen die leukocytenmigratie evenals onderzoek naar verschillende trekkende en phagocytic mogelijkheden van diverse leukocyten bevolkingsgroepen bemiddelen. Gelokaliseerde infecties zijn ook nuttig bij het onderzoek van de verschillen in virulentie tussen bacteriestammen evenals het bestuderen van microbe invasie mechanismen sinds fysieke host barrières moeten worden gekruist voor een gelokaliseerde infectie aan systemische geworden. Zebravis worden typisch verhoogd bij temperaturen van 25-31 ° C 19, maar zij kunnen ook bij temperaturen tot 34-35 ° C voor studies van de invasiviteit van bepaalde menselijke ziekteverwekkers strenge eisen temperatuur gehandhaafdvoor virulentie 20, 21. Veel verschillende locaties zijn gebruikt om een aanvankelijk gelokaliseerde bacteriële infectie met inbegrip van de achterhersenen ventrikel 22, rug- staart spier 18, pericardiale holte 23 en otic blaasje (oor) 5, 16, 24 genereren. Er is echter gevonden dat injectie van bacteriën in de staart spier weefselbeschadiging en ontsteking onafhankelijk van de bacteriën, die resultaten scheef bij onderzoeken leukocyt reactie 13 veroorzaken. Hoewel minder schade wordt geassocieerd met injectie in de achterhersenen en hoewel het aanvankelijk verstoken van leukocyten in jonge embryo&#39;s, de achterhersenen ventrikel gestaag krijgt meer immuuncellen in de tijd als microglia te gaan wonen. De achterhersenen ventrikel is ook een moeilijker locatie om de afbeelding. De otic blaasje is een gesloten holte met geen directe toegang tot het vaatstelsel 25, 26. Het is gewoonlijk zonder leukocytes, maar leukocyten kan worden aangeworven om de otic blaasje in reactie op inflammatoire stimuli zoals een infectie. Het is ook een gewenste plaats van micro-injectie van bacteriën in zebravis leeftijd 2-3 dagen na de bevruchting (dpf) vanwege het gemak van beeldvorming en de visualisatie van de injectie. Daarom hebben we gekozen voor de otic blaasje als onze site van gelokaliseerde bacteriële infectie.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &frac12; in. needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Fine tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gel comb</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4.2 mm breedte, 1.5 mm dik</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td></td><td></td><td>Op maat gemaakt door een gat van 16 - 18 mm in het midden van de bodem van een 35 mm weefselkweekbakje te boren en een rond dekglas nr. 1 van 22 mm in het gat te plaatsen en te verzegelen met een dunne laag Norland Optical Adhesive 68 uitgehard door UV-licht.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>High melt agarose</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>met FV-1000 systeem</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthioureum (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenold rood</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Proteïnepepton</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Kleine weefselkweekbakje</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Dünndwandige glas capillaire injectienaalden</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoaat)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>Fluka Biochemika</td><td>92144</td><td></td></tr></tbody></table>

niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven model van<em&gt; streptococcus iniae</em&gt; infectie

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

De aquatische ziekteverwekker, Streptococcus iniae, is verantwoordelijk voor meer dan 100 miljoen dollar in jaarlijkse verliezen voor de aquacultuursector en kan veroorzaken systemische ziekte bij zowel vis en de mens. Een beter begrip van S. iniae pathogenese van de ziekte vereist een geschikt modelsysteem. De genetische volgzaamheid en de optische transparantie van de vroege ontwikkelingsstadia van zebravis oog op het genereren en niet-invasieve beeldvorming van transgene lijnen met fluorescent gelabeld immuuncellen. Het adaptieve immuunsysteem is niet volledig functioneel tot verscheidene weken na bevruchting, maar zebravis larven een geconserveerd gewervelde aangeboren immuunsysteem zowel neutrofielen en macrofagen. Aldus, het genereren van een larvale infectiemodel maakt het onderzoek mogelijk van de specifieke bijdrage van aangeboren immuniteit in de controle S. iniae infectie. De site van de micro-injectie zal bepalen of er een infectie issystemische of aanvankelijk gelokaliseerd. Hier presenteren we onze protocollen voor otic blaasje injectie van zebravis leeftijd van 2-3 dagen na de bevruchting, evenals onze technieken voor tl confocale beeldvorming van infectie. Een gelokaliseerde infectie site laat observatie van de eerste microbe invasie, de aanwerving van gastheercellen en de verspreiding van de infectie. Onze bevindingen met behulp van de zebravis larvale model van S. iniae infectie aan dat zebravis kan worden gebruikt om de verschillende bijdragen van ontvangst neutrofielen en macrofagen in gelokaliseerde bacteriële infecties onderzocht. Verder beschrijven we hoe fotomarkering van immuuncellen kunnen worden gebruikt om individuele gastheercel lot volgen tijdens het verloop van de infectie.

Micro-injectie van S. iniae in de otic blaasje (figuur 1 en figuur 2) resulteert in een aanvankelijk gelokaliseerde gastheer respons. Wanneer correct geïnjecteerd, moet de bacteriën alleen gezien in de otic blaasje en niet in het omringende weefsel of bloed. Dit kan worden gevisualiseerd in micro-injectie met fenol rode kleurstof (Figuur 1A). Als alternatief, als het label bacteriën worden geïnjecteerd, een quick scan van geïnfecteerde larven onmiddellijk injec...

Hier presenteren we een protocol voor de generatie en beeldvorming van een gelokaliseerde bacteriële infectie in het oticum van de zebravis.

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Het algemene doel van deze procedure is om zebravislarven te micro-injecteren met de bacteriële pathogeen streptococcus IEA voor live non-invasieve beeldvorming van de immuunrespons van de gastheer. Dit wordt bereikt door eerst de micro-injectienaald te vullen met een bacteriële suspensie en de geanestheseerde zebravislarven uit te lijnen op de agarose injectievorm. Vervolgens wordt de bacteriële suspensie in de otische blaas van de larven geïnjecteerd.Daarna worden de geïnjecteerde larven ingebed in laagsmeltende agarose. Ten slotte worden de immuuncellen van de gastheer fotogemarkeerd voor eenvoudige tracking en wordt de infectie in beeld gebracht met een confocale microscoop. Uiteindelijk worden micro-injectie van streptococcus IEA in de otische vesikel en de daaropvolgende fotomarkering en confocale microscopie gebruikt om de immuunrespons van zebravislarven te bestuderen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals injectie in de caudale vene, is dat injectie in de otische vesikel een gelokaliseerde bacteriële infectie veroorzaakt, waardoor niet-invasieve beeldvorming van interacties tussen gastheer en pathogeen mogelijk is in de transparante zebravislarve. Begin met het bereiden van een 1,5 tot 2% high melt agarose-oplossing in E3-medium en verhit deze in de magnetron totdat de oplossing helder is. Giet na afkoeling een hoeveelheid agarose in een Petrischaal, precies genoeg om de bodem van de schaal te bedekken, en draai de schaal rond.Zodra de aros is gestold, plaatst u een gespoelde en gedroogde gelkam erop, zodanig dat het vaste uiteinde net op de bovenkant van de petrischaal rust en het gekerfde uiteinde de aros raakt. Zorg ervoor dat de kam zo horizontaal mogelijk ligt, met een hoek van 30 graden ten opzichte van de onderste aros-laag. Giet een kleine extra hoeveelheid aros op de overgang tussen de kam en de onderste aros-laag, zodat de verse aros-laag de putjes van de kam bedekt.Laat het volledig afkoelen voordat u de kam verwijdert. Verwijder vervolgens met een pipetpunt eventuele uitstekende stukjes agarose uit de putjes. Giet E three medium over de injectievorm en bewaar dit bij vier graden Celsius.Nadat het SNEA-inoculum en de zebravislarven voor de injecties zijn voorbereid volgens het tekstprotocol, schakelt u de micro-injector in en stelt u het tijdsbereik in op milliseconden. Open het ventiel van de koolstofdioxidecilinder om gas in de leiding te laten stromen. De druk van de micro-injector moet ongeveer 20 PSI aangeven; vortex de voorbereide SNEA-cultuur in fenolrood en PBS en gebruik een microloader-tip om twee tot drie µL van de cultuur in een uitgetrokken capillaire injectienaald te laden. Monteer de geladen naald op een micromanipulator die is verbonden met een magnetische standaard en positioneer deze onder een stereomicroscoop, zodat de naald zich in een hoek van ongeveer 45 tot 65 graden bevindt ten opzichte van de voet van de microscoop.Breek eerst de punt van de naald af met een fijn pincet en druk op het voetpedaal van de micro-injector om een druppel van het inoculum op de naaldpunt te dispenseren. Gebruik de schaalverdeling in het oculair van de microscoop om de diameter van de druppel te meten. De diameter van de druppel moet ongeveer 0.10 millimeter zijn, wat overeenkomt met een volume van ongeveer één nanoliter.Om de druppelgrootte aan te passen, kan de duurinstelling van de micro-injector worden gewijzigd of kunnen er fijne pincetten worden gebruikt om meer van de naaldpunt af te knippen. De injectietijd moet tussen de 20 en 35 milliseconden liggen om overmatige weefselschade te voorkomen. Plaats vervolgens met een plastic transferpipet één vis per putje in elk van de 12 putjes van de injectievorm.Positioneer de larven vervolgens voorzichtig met een glazen staafje, een haarloop of een plastic tip, zodanig dat de koppen naar de achterkant van de microscoop zijn gericht en de dooierzakken tegen de linkerzijde van het putje rusten. Richt het linkeroor van de larven omhoog naar het plafond. Wanneer de larven klaar zijn voor injectie, gebruik dan de knoppen op de micromanipulator om de gevulde naald uit te lijnen met de otische vesikel, zodat beide in hetzelfde gezichtsveld liggen.Doorboor met de naaldpunt de buitenste epitheellaag van de otische vesikel, zodat de punt net binnen de vesikel is. Gebruik vervolgens een druk die laag genoeg is om te voorkomen dat de holte scheurt, en druk op het voetpedaal om één nanoliter van de gewenste dosis SNEA te injecteren. Als de injectie succesvol is, moet de otische vesikel, maar niet het omringende weefsel, zich vullen met een fenolrood inoculum.Trek de naald voorzichtig uit de larven en verschuif bij een vergroting van vijf x de injectieplaat handmatig zodat de larve in beeld is. Indien er fluorescentie-gelabelde bacteriën worden geïnjecteerd onder een fluorescentiemicroscoop, scan de geïnjecteerde larven dan visueel en behoud alleen die larven waarbij de depositie van bacteriën uitsluitend binnen het otische vesikel heeft plaatsgevonden, om ervoor te zorgen dat het injectievolume gedurende het experiment gelijk blijft. Injecteer na elke 48ste embryo een druppel bacteriële suspensie in een centrifugebuis van 1,7 milliliter die 100 microliters steriele PBS bevat.Plate vervolgens de 100 µL op THY plus P auger-platen en incubeer deze gedurende één nacht bij 37 °C. Om de CFU in het injectievolume te bepalen, nadat een volledige groep van 12 larven op de injectieramp is geïnjecteerd, worden de larven voorzichtig met een plastic transferpipet uit de putjes verwijderd en in een nieuwe Petrischaal geplaatst. Verwijder de trica-oplossing en vervang deze door ongeveer twee milliliter vers E3-medium om de larven te laten herstellen.Incubeer de embryo's volgens het tekstprotocol. Nadat de aro's met trica zijn voorbereid volgens het tekstprotocol op het plateau van de stereomicroscoop, gebruik een transferpipet om vier tot vijf geanestheseerde larven in een schaaltje met glazen bodem te plaatsen. Verwijder de trica- en aro-oplossing uit het waterbad van 55 °C en laat deze één tot twee minuten afkoelen op kamertemperatuur.Verwijder ondertussen zoveel mogelijk vloeistof uit de geanestheseerde larven. Giet vervolgens de afgekoelde agarose in de schaal totdat ongeveer de helft van het oppervlak bedekt is. Draai daarna met de schaal om de agarose te verspreiden.Verwijder de larven die naar de zijkanten van de schaal zijn gedreven en pipetteer ze terug naar het midden. Positioneer de larven vervolgens onder de stereomicroscoop met een lange pipetpunt voorzichtig in de gewenste positie voor beeldvorming. Voor de positie van de otische vesicle moeten de larven zo worden geplaatst dat de rechter otische vesicle naar boven is gericht en de linker otische vesicle plat tegen de bodem van de schaal ligt.Laat de aros ongeveer 10 minuten afkoelen voordat u het schaaltje verplaatst. Pipetteer vervolgens voorzichtig wat trica- en E drie-oplossing bovenop de aros-laag om deze vochtig te houden. Om de monsters te visualiseren, gebruikt u een Zack-scan met de 488 nanometer en 543 nanometer lasers.Gebruik continue lijnenscanning om het laservermogen en de detectorversterking aan te passen. Controleer in het venster voor beeldacquisitie-controle of er geen per ongeluk fotogECONverteerde rode fluorescentie aanwezig is. Selecteer onder stimulusinstellingen de tool 'use scanner' en kies 'main', selecteer de 405 nanometer laser en stel deze in op 70% vermogen.Definieer vervolgens met de cirkeloptie het interessegebied in de odische vesikel. Selecteer bij de instelling voor het begin van de stimulus de optie 'activation in series' met een pre-activatie van één frame en een activatietijd van 60.000 milliseconden in het acquisitievenster. Kies onder de kop 'time scan' twee intervallen van elk één minuut, één voor vóór en één voor na de fotoconversie. Start de time-lapse serie om de fotoconversie van het gedefinieerde interessegebied te initiëren.Scan tot slot het monster met een Zack en de 488 en 543 nanometer lasers. Om de gefotoconverteerde rode fluorescentie, evenals eventueel resterende groene fluorescentie te visualiseren: microinjectie van SNEA in fenolrood in de otische vesikel resulteert in een aanvankelijk gelokaliseerde gastrespons die, bij een correcte injectie, alleen in de otische vesikel zichtbaar zou moeten zijn en niet in het omliggende weefsel of bloed. Alternatief kan, indien gelabelde bacteriën worden geïnjecteerd, een snelle scan van geïnfecteerde larven direct na de injectie bevestigen dat de bacteriën zich alleen in de otische vesikel bevinden en niet in het omliggende weefsel.Microinjectieplaatsen van een initieel gelokaliseerde infectie zijn nuttig voor het bestuderen van leukocytenchemotaxis, zoals hier wordt aangetoond. De rekrutering van leukocyten kan worden gekwantificeerd door Sudan black-kleuring van neutrofiele granulocyten of door formaldehydefixatie van fluorescerende transgene lijnen, met gebruik van transgene zebravislijnen die het groen fluorescerende eiwit tot expressie brengen. Dendra 2, specifiek in macrofagen of neutrofielen, onthulde dat injectie van NEA in de otische vesikel leidde tot de rekrutering van neutrofielen en macrofagen en fagocytose van bacteriën binnen 60 minuten na infectie.In deze figuur werden twee gelabelde macrofagen, die vijf uur na infectie naar de otische vesikel waren gerekruteerd, gefotoconverteerd en vervolgens gedurende de volgende 24 uur gevolgd. Hoewel sommige gefotoconverteerde cellen in de otische vesikel of de hoofregio blijven, waren er ook cellen aangetroffen die verspreid waren over het hele lichaam van de larven, zoals hier te zien is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe Streptococcus n EEA in de otische vesikel van zebravissen van drie dagen na bevruchting moet worden gemicro-injecteerd.Dit omvat ten eerste het uitlijnen van geanestheseerde larven op de injectiemaal en het laden van de naald met het bacteriële inoculum. Ten tweede het micro-injecteren van bacteriën in de otische vesikel. Ten derde het monteren van geïnfecteerde larven in laagsmeltende agarose, en ten vierde het gebruik van een confocale microscoop om gastheerleukocyten te fotolabelen en interacties tussen leukocyten en pathogenen in vivo in beeld te brengen.

non-invasive-imaging-innate-immune-response-zebrafish-larval-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Transparante zebravis embryo's hebben hun nut bewezen model hosts te visualiseren en functioneel onderzoek naar interacties tussen aangeboren immuunsysteem cellen en intracellulaire bacteriële pathogenen,...

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op...

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Source: Zhang, X., et al. A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates fluorescence imaging of zebrafish embryos injected with Staphylococcus aureus, enabling quantification of infection progression and bacterial distribution to assess the impact of biomaterial microspheres on host-pathogen interactions in vivo.

 Fluorescence Imaging of Biomaterial-Associated Bacterial Infection in Zebrafish Embryos

Source: Zhang, X. et. al., A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a zebrafish embryo model for studying infections linked to implanted biomaterials. Injecting Staphylococcus aureus with polystyrene microspheres enhances bacterial survival, confirming the infection-promoting role of implanted materials.

In Vivo Analysis of Implant-Associated Bacterial Infections Using Zebrafish Embryos

This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes' migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

The video demonstrates a zebrafish wounding and entrapment device technique for observing fluorescently labeled fungal pathogen infection in zebrafish larvae. Initial infection attracts macrophages, and as infection persists, neutrophil recruitment progresses at the injection site.

A zWEDGI Technique to Visualize Fungal Pathogen-Infected Zebrafish Larvae

De aangeboren immuunrespons beschermt organismen tegen pathogene infectie. Een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons, de fagocyt respiratory burst, genereert reactieve zuurstofradicalen die binnendringende micro-organismen te doden. We beschrijven een respiratoire burst test die reactieve zuurstofradicalen geproduceerd wanneer de aangeboren immuunrespons chemisch geïnduceerd kwantificeert.

Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis

Het bestuderen van de vroegste gebeurtenissen van preneoplastische cel progressie en aangeboren immuunsysteem interactie cel is cruciaal om te begrijpen en behandelen van kanker. Hier beschrijven we een methode om epitheelcellen transformaties en de daaropvolgende live beeldvorming van aangeboren immuunsysteem interactie cel met HRAS G12V uiten huidcellen in de zebravis larven voorwaardelijk induceren.

Live-Imaging van aangeboren immuunsysteem en preneoplastische cel interacties Met behulp van een Inducible Gal4 / UAS Expression System in larvale zebravis Skin

Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In zebravis embryo&#39;s

Systemische en lokale infectiemodellen met zebravissen voor humaan influenza A-virus worden gedemonstreerd. Met behulp van een systemisch infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om antivirale geneesmiddelen te screenen. Met behulp van een lokaal infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om reacties van gastheer immuuncellen te karakteriseren.

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

De huidige studie beschrijft een zebravis embryo model voor in vivo visualisatie en intravital analyse van biomaterial-geassocieerde infectie na verloop van tijd op basis van fluorescentie microscopie. Dit model is een veelbelovende aanvulling op zoogdieren dierlijke modellen zoals Muismodellen voor het bestuderen van de biomaterial-geassocieerde infecties in vivo.

Een zebravis Embryo Model voor In Vivo visualisatie en Intravital analyse van Biomaterial-geassocieerde goudhoudende Stafylokok infectie

Leer micro-injectie van Streptococcus iniae in de otische vesikel van zebravislarven voor niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons met confocale microscopie en fotolabeling.

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van

Meer video's verkennen