Name: Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Leer een zachte transfectiemethode voor RAW264.7 macrofaagcellen met luciferasereportergenen zonder immuunrespons te activeren. Dit protocol optimaliseert genexpressieonderzoek in macrofagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd gefinancierd door een subsidie van Canadian Institutes for Health Research (CIHR). STC ontvangt een doctoraatsonderzoeksbeurs van de CIHR en de Michael Smith Foundation. EYS ontvangt een CIHR-beurs. Het CIHR Transplantation Training Program heeft ook afgestudeerde beurzen verstrekt aan STC, EYS en SS.

1. Plasmide DNA Purification <ol><li> Extraheer plasmide-DNA met een maxiprep kit volgens het protocol van de fabrikant. Resuspendeer plasmide DNA in 500 pl TE buffer. </li><li> Voer een fenol: chloroform: isoamylalcohol extractie en isopropanol precipitatie om resterende bacteriële verontreinigingen te verwijderen. De aanwezigheid van LPS verstoort transfectie 9. <ol><li> Voeg 500 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1, pH 8) met het plasmide-DNA en schud krachtig gedurende 15 seconden. Fenol veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en is een verdoving, zodat brandwonden worden niet altijd gevoeld totdat er zware schade. Voer fenol: chloroform: isoamyl extractie in de zuurkast en wees voorzichtig. </li></ol></li><li> Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Transfer 350 ul van de bovenste waterige fase in een nieuwe 1,5 ml collectie buis. </li><li> Voeg 350 ui TE-buffer om de buis die de onderste organische fase bevat. Schud krachtig gedurende 15 sec. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Transfer 350 ul van de bovenste waterige fase naar dezelfde 1,5 ml collectie buis. </li><li> Voeg 70 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en meng. Voeg 700 ul 100% isopropanol. Meng goed en incubeer 10 min bij RT. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 Minat 4 ° C. Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 500 pl 75% ethanol aan de pellet. Vortex monsters te mengen en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. DNA in de pellet. </li><li> Open de dop van de buis en de lucht droog de pellet bij kamertemperatuur 5-10 min. De pellet moet doorzichtig geworden. Voeg 500 ui TE-buffer om de DNA pellet te resuspenderen. Verhit bij 50 - 60 ° C gedurende 10 minuten om het DNA pellet lossen. </li><li> Meet de absorptie bij 260 nm (A260) en 280 nm (A280) met een spectrometer. Bereken de concentratie van DNA door de A260 waarde te vermenigvuldigen met 50 ng / ul. Beoordelen van de kwaliteit van het DNA door calculating van de A260 / A280-verhouding. 2.0 - DNA met een hoge kwaliteit moet een A260 / A280-verhouding van 1,8 te geven. </li></ol> 2. Cel Kweken en zaaien <ol><li> Culture RAW264.7 cellen in DMEM aangevuld met 9% foetaal kalfsserum (DMEM / 9% FCS) in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Tijdens elke passage, los van de cellen van de plaat door het continu pipetteren met een Pasteur pipet. Passage van de cellen om de 2 dagen, en zaad 1,5-2.000.000 cellen op een 10 cm weefselkweek behandeld gerecht als de voorraad. Ontdooi een nieuwe voorraad van cellen elke 5 - 6 weken. </li><li> Op de dag van transfectie zaad 200.000 cellen per putje in een 24-wells plaat in een volume van 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer de cellen gedurende 4 uur in 37 ° C incubator. </li><li> Transfecteren cellen hetzij de lipide gebaseerde reagens (stap 3,1) of het eiwit / polyamine gebaseerde reagens (stap 3.2). </li></ol> 3. Transfectie <ol><li> Lipide-gebaseerde transfectie: <ol><li> Warmen de transfectie reagent Rt in het donker. Opwarmen serumvrij medium en DMEM / 9% FCS tot 37 ° C. </li><li> Voeg 0,5 ug plasmide DNA met 50 gl serumvrij medium in een 1,5 ml buis. Voeg 2 pl transfectie reagens met de pipetpunt onder het oppervlak van de vloeistof. Vortex voor 6 sec. </li><li> Laat het reagens / DNA mengsel in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Tijdens de 30 minuten incubatie, verwijder de media uit de put en voeg 250 ul van verse DMEM / 9% FCS aan elk putje. </li><li> Na 30 min, voeg 250 pl DMEM / 9% FCS aan het serum / DNA mengsel. Meng goed door en neer te pipetteren. </li><li> Voeg 300 pi van het verdunde mengsel in elk putje. Incubeer 2-4 uur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li><li> Verwijder transfectie-oplossing en voeg 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer gedurende 24 - 48 uur op 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor celstimulatie. </li></ol></li><li> Protein / polyamine-gebaseerde transfectie: <ol><li> Warmen serumvrijmedium en DMEM / 9% FCS tot 37 ° C. </li><li> Voeg 0,75 pl transfectie reagens 18,75 gl serumvrij medium. Vortex kort te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 0,5 ul van 1 ug / ul DNA in de getransfecteerde verdunde reagens. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Tijdens de 10 minuten incubatie, verwijder media uit elk putje van de 24-well plaat en voeg 250 ul vers DMEM / 9% FCS aan elk putje. </li><li> Na 10 min, voeg 250 pl DMEM / 9% FCS in het reagens / DNA mengsel. </li><li> Voeg 270 ul van de verdunde mengsel aan de put. Incubeer in een 37 ° C en 5% CO2 incubator gedurende 2-4 uur. </li><li> Verwijder transfectie-oplossing en voeg 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer gedurende 24 - 48 uur op 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li></ol></li></ol> 4. cel stimulatie en Luciferase Assay <ol><li> Vervang media in de put met 250 ul vers DMEM / 9% FCS. </li><li> Voeg 50 ul van LPS of LPS + IL-10 Bij de gewenste concentraties aan de put. Zet de plaat om de 37 ° C, 5% CO2 incubator. Stimuleer voor 2-6 uur. </li><li> Verwijder stimulatie oplossing door aspiratie, wassen met ijskoud PBS, en voeg 200 ul 1x Passive Lysis Buffer. Rock bij RT gedurende 30 min. Schraap af en breng het lysaat 1,5 ml buisjes en verwijderen celresten door centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Overdracht 40 ul geklaard lysaat (supernatans) om een ​​witte, heldere bodem 96-well plaat voor de bepaling van luciferase signalen volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Lees de luciferase signaal met een luminometer in het gehele zichtbare lichtspectrum. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Bereken de vuurvlieg: Renilla verhouding door deling van de afzonderlijke waarden van vuurvlieg luciferase door de waarden van Renilla luciferase uit elk putje. </li><li> Bereken de vouw verandering door de vuurvlieg te verdelen: Renilla verhouding van de goed behandeld doordat van de onbehandelde put. </li></ol>

<ol><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).</li>
<li>Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+transient+transfection+of+a+murine+macrophage+cell+line+RAW+264.7%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7.</a> Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).</li>
<li>Kim, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+ingest+and+are+activated+by+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA.</a> Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).</li>
<li>Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+activation+of+the+RAW264.7+macrophage+cell+line+by+transfected+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA.</a> Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).</li>
<li>Jiang, W., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+HMGB1+release+from+RAW+264.7+cells+by+transfected+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA.</a> Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).</li>
<li>Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+inducible+gene+expression+by+signal-dependent+transcriptional+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation.</a> Cell. 138 (1), 129-147 (2009).</li>
<li>Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+inhibits+lipopolysaccharide+induced+miR-155+precursor+stability+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation.</a> PLoS One. 8 (8), e71336(2013).</li>
<li>Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+technical+reports.+Effects+of+lipopolysaccharide+on+transfection+efficiency+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells.</a> Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).</li>
<li>Berghaus, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).</li>
<li>Fiszer-Kierzkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+DNA+carriers+may+induce+cellular+stress+response+and+change+gene+expression+pattern+in+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hier beschreven is niet alleen richten op transfectie-efficiëntie, maar streeft naar een balans tussen efficiëntie en het behoud van de fysiologische toestand van de cellen te slaan. Specifiek onze procedure slaagt het minimaliseren van de toxiciteit van transfectie reagens en het maximaliseren luciferase-signaal. Een kritische stap in het protocol is de gezondheid van de cellen. Overwoekerd culturen niet geschikt voor transfectie hun fysiologie veranderingen en continu kweken v...

Transfectie van nucleïnezuren in cellen heeft een gevarieerde toepassing in het wetenschappelijk onderzoek. Voorbeelden omvatten (1) reporter genen tot de rol van verschillende genen elementen in genexpressie te bestuderen, (2) proteïne-expressieplasmiden om het eiwit van interesse tot overexpressie, en (3) kleine interfererende RNA genexpressie te downreguleren. Door het manipuleren van de expressie van bepaalde genen en het meten van het differentiële effect van dergelijke manipulaties kunnen onderzoekers de genfuncties in het gekozen biologische systemen afleiden. Niet alle transfectie werkwijzen dezelfde transfectie efficiënties, en zelfs dezelfde transfectie methode niet gelijkmatig 1 transfecteren alle celtypes. Vandaar dat verschillende transfectie werkwijzen ontwikkeld zoals calciumfosfaat methode, DEAE dextran, kationisch lipide transfectie, kationische niet lipide polymeer transfectie, elektroporatie, en nucleofectie 2,3. Transfectie in macrofagen is especieel moeilijk te wijten aan het feit dat macrofagen professionele fagocyten die zeer gevoelig zijn voor vreemde materialen waaronder bacteriën afgeleide (gemethyleerd) DNA 4. Inbrengen van vreemd DNA activeert de Toll-like receptor 9 (TLR9) traject leidt tot de productie van cytokines en stikstofoxide 5,6. Deze geactiveerde macrofagen kan dan minder te reageren op behandeling die de onderzoekers gaan onderzoeken. Ons laboratorium routinematig transfects de RAW264.7 macrofaag cellijn met luciferase reporter genen, en we hebben een protocol dat is ongevoelig luciferase signaal significant hoger dan de achtergrond zijn ontwikkeld, maar ook zacht genoeg om macrofagen in de rust toestand blijven. Het gedrag van de getransfecteerde cellen werden beoordeeld door een vuurvlieg luciferase reporter gen herbergt het promotorgebied van IκBζ (pGL3 IκBζ). IκBζ expressie opgereguleerd door de bacteriële celwand component lipopolyssacharide (LPS) 7,8 en neerwaarts gereguleerd door de anti-inflammatoire cytokine, interleukine-10 (IL-10) 8. Om rekening te houden transfectie variatie tussen putten, we co-transfecteren een controle-plasmide dat het Renilla luciferasegen (bv phRL-TK) voor normalisatie doeleinden. De beschreven protocol wordt geoptimaliseerd na het testen van verscheidene parameters waaronder timing van transfectie type transfectie reagentia, hoeveelheden transfectie reagentia en plasmide-DNA, en verhouding van transfectiereagens tot DNA plasmide. De twee transfectie reagentia in dit protocol zijn (1) een lipide-gebaseerde transfectie reagens en (2) een eiwit / polyamine gebaseerde transfectie reagens.

<table><tbody><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210007</td><td>Elk maxiprep-kit werkt</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td><td>Life Technologies</td><td>15593-049</td><td>Molecular Biology Grade. Fenol is giftig, dus werk indien mogelijk in de afzuigpunt. Gebruik de onderste heldere organische laag als er twee vloeistoflagen in de container ontstaan.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30243.01</td><td>Verwarm in een waterbad van 37 &deg;C voor gebruik.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td>Geïnactiveerd in een waterbad van 56 &deg;C gedurende 45 min voor gebruik.</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Verwarm tot minimaal kamertemperatuur voor gebruik.</td></tr><tr><td>XtremeGene HP DBA-transfectie reagens</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Verwarm tot kamertemperatuur voor gebruik.</td></tr><tr><td>GeneJuice</td><td>EMD Millipore</td><td>70967</td><td>Verwarm tot kamertemperatuur voor gebruik.</td></tr><tr><td>5x Passive Lysis Buffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>30 ml is inbegrepen in het Dual Luciferase Reporter Assay System</td></tr><tr><td>Dual Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr></tbody></table>

transfecteren raw264.7 cellen met een luciferasereportergen

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfectie van gewenste genetische materialen in cellen is een onvermijdelijke procedure in biomedische onderzoeksstudies. Hoewel er talrijke methoden zijn beschreven, zijn bepaalde celtypen resistent tegen veel van deze methoden en leveren een lage transfectie-efficiëntie1 op, wat mogelijk onderzoek bij die celtypen belemmert. In dit protocol presenteren we een geoptimaliseerde transfectieprocedure om luciferase reportergenen als een plasmide-DNA in de RAW264.7 macrofagencellijn te introduceren. Er worden twee verschillende soorten transfectie-reagentia beschreven (op lipiden gebaseerd en op polyaminen gebaseerd) en er worden belangrijke opmerkingen gedurende het hele protocol gegeven om ervoor te zorgen dat de RAW264.7 cellen minimaal worden gewijzigd door de transfectieprocedure en dat alle verkregen experimentele gegevens de directe resultaten zijn van de experimentele behandeling. Hoewel de transfectie-efficiëntie mogelijk niet hoger is in vergelijking met andere transfectiemethoden, is de beschreven procedure robuust genoeg om het luciferase-signaal in RAW264.7 te detecteren zonder de fysiologische reactie van de cellen op stimuli te veranderen.

Figuur 1 vergelijkt de transfectie-efficiëntie van de twee transfectie reagentia RAW264.7. De lipide-gebaseerde reagentia gaf typisch ongeveer 25% transfectie terwijl de eiwit / polyamine-gebaseerde transfectie resulteerde in ongeveer 5% efficiency (figuur 1A). Het verschil in transfectie-efficiëntie werd ook waargenomen in luciferase signalen in RAW264.7 cellen getransfecteerd met de pGL3-IκBζ promotor reporter (Figuur 1B). Toevoeging van LPS aan deze getransfecteerde ...

Transfectie in de macrofagencellijn, RAW264.7, is moeilijk vanwege de natuurlijke reactie van de cel tegen vreemde materialen. We beschrijven hier een zachte maar robuuste procedure voor het transfecteren van luciferase-reportergenen in RAW264.7-cellen.

Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Het algemene doel van deze procedure is om Luciferase-reporterconstructen in RAW 264.7-cellen te transfecteren zonder de cellen te activeren. Dit wordt bereikt door eerst RAW 264.7-cellen van een stockplaat te oogsten via voorzichtig pipetteren en de cellen uit te zaaien in een weefselkweek-behandelde 24-wellplaat. De tweede stap is de cotransfectie van het Firefly luciferase-reporterplasmid en het controle-Renilla luciferase-plasmid in de cellen.Deze plasmiden moeten vrij zijn van endotoxinen. Vervolgens worden de cellen gestimuleerd met de gewenste behandelingen, gevolgd door cellyse en overdracht naar een witte 96-wellplaat met een transparante bodem. De laatste stap is het bepalen van de vuurvlieg-luciferaseactiviteit, waarna de Renilla-luciferaseactiviteit wordt bepaald om de ratio van vuurvlieg- tot Renilla-luciferase te berekenen.Uiteindelijk wordt de fold change ten opzichte van de ongestimuleerde controle gebruikt om het effect van stimuli op de Lucifer-reporter aan te tonen, wat gecorreleerd is aan het expressieniveau van het gen van belang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele overnight transfectie, is dat

transfecting-raw2647-cells-with-a-luciferase-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en...

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Deze methode beschrijft de hoge opbrengst in vitro synthese van zowel gecapte als ongecapte mRNA vanuit een gelineariseerd plasmide dat het Gaussia luciferase (GLuc) gen bevat. Het RNA wordt gezuiverd en een fractie van het ongecapte RNA wordt enzymatisch gecapt met behulp van het capping-enzym van het Vaccinia virus. In de laatste stap wordt het mRNA getransfecteerd in HeLa-cellen en worden de supernatanten van de celcultuur geanalyseerd op luciferase-activiteit.

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

This video demonstrates an assay to study the translation regulation in poxvirus-infected cells. Uninfected and virus-infected cells were co-transfected with mRNAs encoding for firefly luciferase (Fluc) and Renilla luciferase (Rluc), with the Fluc mRNA containing a 5' Poly(A) leader sequence. Upon adding bioluminescent substrates on lysed cells, measure the signal from both the luciferases to identify the translational advantage of the Fluc mRNA in virus-infected cells, conferred by the leader...

A Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-Infected Cells

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

We presenteren een protocol om mRNA vertaling verordening in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen met behulp van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay studie. De analyse kan voor het bestuderen van Vertaal regelgeving door CIS-elementen van een mRNA worden gebruikt, met inbegrip van 5 '-onvertaalde regio (Utr) en 3 '-UTR. Verschillende Vertaal initiatie modi kunnen ook worden onderzocht met behulp van deze methode.

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

Hier beschrijven we een methode voor celgebaseerde visualisatie, subcellulaire lokalisatie en kwantitatieve analyse van poly(ADP-ribose) (PAR) verrijkte foci in vaste zoogdiercellen. Deze test maakt het mogelijk om plaatsen te kwantificeren van door DNA-schade veroorzaakte PARP-activatie, inclusief die geassocieerd met basenexcisieherstel of enkelstrengbreukreparatie, in de kernen van aan genotoxine blootgestelde cellen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van door genotoxine geïnduceerde PARP1/PARP2-activatie in cellen met behulp van een op fluorescent fusie eiwit gebaseerde reporter

Leer een zachte transfectiemethode voor RAW264.7 macrofaagcellen met luciferasereportergenen zonder immuunrespons te activeren. Dit protocol optimaliseert genexpressieonderzoek in macrofagen.

Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen

Meer video's verkennen