Name: Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T15:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer hoe u klinisch geschikte CMV-specifieke T-cellen isoleert voor adoptieve immunotherapie met een volledig geautomatiseerd cytokine-capturesysteem. Deze methode vereist geen GMP-faciliteit en verbetert de toegankelijkheid van celtherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Miltenyi Biotec, Duitsland voor het verstrekken van reagentia en CliniMACS Prodigy apparatuur voor evaluatiestudies. We danken George T. McNamara (Pediatrische afdeling, MD Anderson Cancer Center) voor het lezen van het manuscript. Subsidieondersteuning: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children's Foundation.

1. Voorbereiding van de materialen onder steriele omstandigheden (zie materialen en apparatuur Table) <ol><li> Bereid 3 L PBS / EDTA-buffer, aangevuld met humaan serumalbumine (HSA) tot een eindconcentratie van 0,5% (w / v). </li><li> Bereid 1 L zakje klinische kwaliteit 0,9% natriumchloride (NaCl) oplossing en 2 L van GMP gehalte celkweekmedium. </li><li> Bereid 60 nmol van CMV-specifieke peptide antigen cocktail door reconstitutie van een flesje van CMV pp65 met 8 ml steriel water. </li><li> Transfer CMV pp65 peptide cocktail in een 50 ml volume bevriezen zak met behulp van een Luer / Spike interconnector en klem met vergrendeling tang om verdere verspreiding van de cocktail in de slang set vermijden. Open cel verrijking slangen set (TS 500) onder steriele omstandigheden. </li><li> Met behulp van steriele slangen lasser, sluit peptide cocktail bevriezing zak in de buis aansluiting voor klep 2 buis set TS 500. Laat de peptide cocktail zakklem niet open op dit moment. </li><li> Verwijder 1 x 10 9 TNC starten cellulaire product en op te schorten in PBS / EDTA-buffer met 2,5% HSA tot een totaal volume van 50 ml. Injecteer de cellulaire product in een 150 ml overdracht zak. </li></ol> 2. Voorbereiding en gebruik van geautomatiseerde Cell Enrichment System (zie materialen en apparatuur Table) <ol><li> Schakel de cel verrijking systeem (Figuur 1B) en kies het programma &quot;CCS_IFN-γ verrijking&quot;. Observeren een gebruikersinterface toont schermen met instructies en foto&#39;s van de operator begeleiden door de procedure. </li><li> Voer de parameter &quot;Operator&quot; en &quot;Tubing Set P / N Nee&quot;. Vervolgens installeert u de Tubing Set 500 geautomatiseerde cel verrijking apparaat volgens de instructies weergegeven op het interactieve beeldscherm. </li><li> Volg de stap voor stap instructies op het scherm om het medium en buffers om het apparaat aan te sluiten. Record catalogusnummer en het lotnummer van de reagentia voor connecting om het instrument. </li><li> Na de laatste controle van de buis set, opent de klem van het peptide cocktail tas. Open het medium zak en start automatisch priming van de buis set. </li><li> Na de priming stap is voltooid, aanvulling HSA (2,5%) NaCl in buffer in het reservoir (200 ml) met behulp van de steriele buis lasser. Breng de start cellulaire product in de &quot;Application zak&quot; met behulp van de steriele slangen lasser. </li><li> Sluit CCS (IFNy) reagentia in respectievelijke slang via adapters. Voer gewenste tijd tot een fractie van celmateriaal verzamelen voordat verrijkingsproces. Review en de juistheid van de gegevens / parameters ingevoerd. Start het proces. </li><li> Voor de start van de geautomatiseerde cel verrijkingsproces, verwijder de Quality Control Bag (QCB, origineel fractie (ori) bevat ongeveer 1,3 ml van 100 ml kamer inhoud verdund met PBS / EDTA buffer). Verzegeling van de QCB, wegen, en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Start de enrichment proces. Aan het eind van het proces zullen doelcellen worden geëlueerd met een geschatte volume elutiebuffer het reservoir. </li><li> Verzegeling van de Non Target Cell Bag (NTCB, negatieve fractie = neg) en Target Cell Bag (TCB, positieve fractie = pos) en weegt elke zak. De gewichten worden later gebruikt voor de berekening van het aantal cellen. </li><li> Onmiddellijk na de verrijkingsprocedure verzamelen twee aliquots per fractie voor flowcytometrie-analyse, en opslaan van de rest van de monsters bij 4 ° C. Gebruik een monster portie voor celgetal vastberadenheid en het andere monster monster voor de verrijking prestatie-analyse (tabel 1). </li><li> Verwijder het instellen van de cel verrijking instrument tubing. Transfer het logbestand op een USB-schijf voor toekomstig gebruik. LET OP: Alle reagentia moeten bereid onder steriele omstandigheden. Het gebruik van een bioveiligheid type II kap wordt sterk aanbevolen. Gebruik steady-state aferese cellulaire product (niet-gemobiliseerd) geïsoleerd van een gezondeCMV seropositieve donor CMV antigeen-specifieke T-cellen te verrijken. Slechts FDA licentie HSA worden gebruikt. De buffer voor mobiele preparaat zijn bij 19 ° C worden bewaard tot 25 ° C lagere of hogere omgevingstemperaturen resulteert in verminderde zuiverheid en een verminderde opbrengst van de doelcellen. </li></ol> 3. celgetal Bepaling <ol><li> Neem monsters van QCB, NTCB en TCB voor celtellingen zoals getoond in tabel 1. Voeg CD45-VoBlue elk aliquot (titer 01:11) en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 1,5 ml vers bereide rode bloedcellen lysis oplossing (1x) naar de oorspronkelijke fractie en negatieve fractie, 450 ul vers bereide rode bloedcellen lysisoplossing de positieve fractie en alle fracties incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Net voor analyse toe propidiumjodide tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ml (1: 100 verdunning van 100 ug / ml). Gebruik automatische celgetalmeter te tellen en vi cel bepalenbekwaamheid. Gebruik celgetalmeter apparaat aanbevolen software voor flowcytometrieanalyse. Bepaal de absolute tellingen van leukocyten voor originele, negatieve en positieve fracties. Opmerking: De telling van levensvatbare cellen leukocyten per ml genomen celgetal analysemonsters wordt bepaald met de cel analyzer aanbevolen software. </li><li> Stel de regio zoals getoond in figuur 2 (regio 5, levensvatbare leukocyten). Gebruik de volgende gating strategie om celgetal te bepalen. Een levensvatbare leukocyten in originele fractie wordt getoond in figuur 2. </li><li> De aangegeven gebieden (figuur 2, 1-6) zijn hiërarchisch als volgt: 1: Tijd poort → 2: Single cellen → 3: CD45 + cellen → 4: Leukocyten (puin uitgesloten) → 5: Levensvatbare leukocyten → 6: Levensvatbare lymfocyten </li><li> Herhaal dezelfde stappen naar cel telt voor negatieve en positieve fracties te bepalen. Bereken het aantal cellen van de gehele fractiedoor te overwegen het verdunningsmiddel factor van het monster en de totale omvang van de fractie (tabel 2). </li></ol> 4. Onderzoek van de Scheiding Prestatie <ol><li> Was de fracties van QCB, NTCB en TCB fractie cellen met pre-gekoelde PBS / EDTA buffer / 0,5% AB serum. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en zuig de supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 pi antilichaam fluorochroom kleuring mengsel dat: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue en anti-IFNy-PE (titer 01:11) en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 1 ml vers bereide rode bloedcellen lysis oplossing (1x) en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en zuig de supernatant. Resuspendeer de cellen in een geschikt volume PBS / EDTA buffer / 0,5% AB serum. </li><li> Voeg propidiumjodide tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ml juist voor analyse (1: 100 dilutiop van 100 ug / ml). Voer flowcytometrie analyse om de zuiverheid van het monster te evalueren. </li><li> Gebruik de volgende gating strategie om de CD3 + T-cellen in levensvatbare leukocyten Gating strategie berekenen voor het bepalen van de CD3 + T-cellen wordt getoond in positieve fractie na CCS verrijkingsproces. De aangegeven gebieden (figuur 3A en 3B, 1-6) zijn hiërarchisch als volgt verbonden: 1: Tijd poort → 2: Single cellen → 3: CD45 + cellen → 4: Cellen (puin uitgesloten) → 5: Levensvatbare leukocyten → 6: Levensvatbare CD3 + cellen bevolking </li><li> Bepaal de frequentie van CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + en CD8 + IFN-γ + T-cellen na CCS verrijkingsproces (tabel 2). </li><li> Gebruik de gating strategie om de frequentie van CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + en CD8 + IFN-γ + T cellen onder f weergegeven bepalenof een origineel en verrijkt (captured) positieve fractie na het CCS-proces. De aangegeven gebieden zijn hiërarchisch verbonden en benoemd als volgt: 1: Tijd poort → 2: Single cellen → 3: CD45 + cellen → 4: Cellen (puin uitgesloten) → 5: Levensvatbare Leukocyten → 6: Levensvatbare CD3 + cellen → 7: CD4 + cellen → 7a: CD4 + IFN-γ + cellen (box) → 8: CD8 + cellen → 8a: CD8 + IFN-γ + cellen (box) </li></ol> Opmerking: De eerste 6 aangegeven gebieden van de hiërarchie verbindingen zijn hetzelfde als figuur 3, (1-6) en de laatste 2 gebieden worden getoond in Figuur 4 (6-8a).

<ol><li>Syed, B. A., Evans, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+Analyst%27s+Couch+Stem+Cell+Therapy+Market%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).</li>
<li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Immunotherapy+for+Cancer+or+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses.</a> Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+T+cells+to+target+carbohydrate+to+treat+opportunistic+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automating+the+manufacture+of+clinically+appealing+designer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Treatment+Strategies-BMT%22%5BJournal%5D)">Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells.</a> Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/">http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/</a> 55-59 (2014).</li>
<li>Einsele, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+CMVpp65-peptide+loaded+DCs+to+improve+CMV-specific+T+cell+reconstitution+following+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 100 (11), 214a-214a(2002).</li>
<li>Blyth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+CMV-specific+T+cells+reduce+the+requirement+for+CMV-directed+pharmacotherapy+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).</li>
<li>Gerdemann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+efficacy+of+rapidly-generated+trivirus-directed+T+cells+as+treatment+for+adenovirus%2C+EBV%2C+and+CMV+infections+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant.</a> Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).</li>
<li>Meij, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+refractory+CMV+reactivation+after+allogeneic+stem+cell+transplantation+with+in+vitro-generated+CMV+pp65-specific+CD8%2B+T-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines.</a> J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).</li>
<li>Lee Buckler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enal+Razvi%2C.+Rise+of+Cell-Based+Immunotherapy+%3A+Personalized+Medicine+Takes+Next+Step+Forward%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+%26+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).</li>
<li>Apel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Clinical+Scale+Manufacturing+System+for+Cellular+Products+Derived+by+Magnetic+Cell+Separation%2C+Centrifugation+and+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chem-Ing-Tech%22%5BJournal%5D)">Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture.</a> Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-Cell+Therapy+of+a+Lung+Transplanted+Patient+with+Severe+CMV+Disease+and+Resistance+to+Antiviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy.</a> Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Feuchtinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+grade+generation+of+hexon-specific+T+cells+for+adoptive+T-cell+transfer+as+a+treatment+of+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).</li>
<li>Peggs, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+selected+cytomegalovirus-reactive+donor+T+cells+confer+rapid+and+safe+systemic+reconstitution+of+virus-specific+immunity+following+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation.</a> Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Tischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+clinical-grade+antiviral+T+cells%3A+selection+of+suitable+T-cell+donors+and+GMP-compliant+manufacturing+of+antiviral+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336(2014).</li>
<li>Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Costs+after+Allogeneic+Haematopoietic+Sct+Are+Associated+with+Major+Complications+and+Re-Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).</li>
<li>Leen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+of+banked+third-party+virus-specific+T+cells+to+treat+severe+viral+infections+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).</li>
</ol>

Beide MD Anderson Cancer Center en Dr Cooper een financieel belang in ZIOPHARM Oncology, Inc., en Intrexon Corporation. Op 7 mei 2015, Dr. Cooper werd benoemd tot Chief Executive Officer bij ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper is nu een Visiting Scientist bij MD Anderson. Dr. Cooper opgericht en bezit InCellerate, Inc. Hij heeft patenten met Sangamo BioSciences met kunstmatige nucleasen. Hij overlegt met Targazyme, Inc. (voorheen American Stamcellen, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals en Bristol-Myers Squibb. Hij is op de Wetenschappelijke Adviesraad van Cellectis. Hij ontvangt honoraria van Miltenyi Biotec.

Adoptieve T-celtherapie heeft ontpopt als een haalbare optie voor B-cel maligniteiten 4 behandelen. Het therapeutisch potentieel is afhankelijk infuseren het gewenste aantal doelwitantigeen specifieke T-cellen die replicatieve senescentie 2 ontberen. Dit kan worden bereikt door het uitzoeken van een zuivere populatie van antigeen-specifieke T-cellen van geëxpandeerde T-cellen in overeenstemming met de huidige good manufacturing practices. Twee sorteren procedures worden veel gebruikt, namelijk, flu...

Hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) 1 te combineren met adoptieve T-celtherapie verbeteren graft-versus-tumor effect en immuniteit voor opportunistische infecties 2. Genereren van antigenspecifieke donor afgeleide T-cellen voor infusie verleden vereiste geschoold personeel en het gebruik van gespecialiseerde faciliteiten die GMP-compliant zijn. De levering van de T-cellen heeft geleid tot een resolutie van opportunistische infecties 3, alsmede de behandeling van de onderliggende maligniteit 4. Onlangs hebben onderzoekers aangetoond dat de adoptieve overdracht van slechts enkele duizenden virus-specifieke T-cellen (1 x 10 ~ 4 - 2,5 x 10 5 cellen / kg lichaamsgewicht van de ontvanger) kan met succes opportunistische CMV infecties na allogene HSCT 5-9 behandelen. Een beperkt aantal GMP faciliteiten met bijbehorende geschoolde productievereisten en de hoge kosten in verband met celproductie is echter restricted patiënt toegang tot veelbelovende T-cel therapieën 10. Een benadering voor het isoleren van antigeen-specifieke T-cellen is gebaseerd op de CCS met een bi- specifiek reagens voor CD45 en IFN-γ herkennen. Zoals wordt getoond, kan deze methode worden gebruikt om de klinische kwaliteit CMV-specifieke T-cellen toepassing van een geautomatiseerde celverrijking CCS inrichting (figuur 1B) te genereren. CMV-specifieke T-cellen worden gegenereerd door het incuberen van overlappende peptiden van CMV pp65 antigen met leukaferese totale nucleaire cellen (TNC) van CMV seropositieve donoren. Deze peptiden, weergegeven in de context van humane leukocyt antigeen (HLA), activeert de CMV pp65-specifieke T-cellen in de TNC IFN-γ scheiden. Deze T-cellen kunnen vervolgens worden &quot;gevangen&quot; en magnetisch gescheiden. De werking van de eerste generatie cel verrijking inrichting (figuur 1A) vereiste personeel bekwaam in celkweek onder GMP condities en coördinatie van personeel voor de meervoudige s ondernemenTEPS noodzakelijk een &quot;gevangen&quot; product te genereren. De procedure vereist gewoonlijk 10 tot 12 uur van continue werking, en daarom waarschijnlijk personeel moet werken dan twee verschuivingen in de GMP faciliteit. Deze beperkingen zijn nu ondervangen door de invoering van een tweede-generatie-inrichting (figuur 1B). Dit apparaat verbindt magnetische verrijking, vergelijkbaar met de eerste generatie apparaat, maar automatiseert andere aspecten van de CCS een unbreached benadering. Dit vermindert de belasting van de GMP-team als de meeste van de stappen kan zonder toezicht door het personeel worden uitgevoerd. Aangezien de inrichting werkt als een gesloten systeem, de antigen-specifieke T-cellen kan worden opgevangen en verwerkt op stationaire behalve de stappen van leukaferese isolatie en bereiding van materialen voordat het instrument. Details van de volledige instrumentatie en functionaliteit van deze tweede generatie cel verrijking apparaat zijn pubsteld 11. Hier beschrijven we de stappen CMV pp65-specifieke T-cellen te verrijken door een steady-state aferese product de geautomatiseerde celverrijking CCS systeem. Eenmaal geïsoleerd kunnen deze CMV-specifieke T-cellen direct worden toegediend in een patiënt.

<table><tbody><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>700-29</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-182</td><td></td></tr><tr><td>5 L waste bag</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>110-004-067</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>279-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumin (Human) 25%&nbsp;</td><td>Grifols</td><td>58516-5216-2</td><td></td></tr><tr><td>Luer/Spike Interconnector</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-701</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % NaCl Solution (1 L)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-109</td><td></td></tr><tr><td>Water for injections</td><td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td><td>NDC-0409-4887-10</td><td></td></tr><tr><td>MILLEX GV Filter Unit 0.22 &mu;m&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Medium 2 L bag</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-306</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-301</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS Freezing Bag 50</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Syringes, sterile</td><td>BD, Laagstraat, Temse, Belgium</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CMV sero positive apheresis product</td><td>Key Biologics, LLC, Memphis</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Materials</td><td>Manufacturer</td><td>Catalog number</td><td></td></tr><tr><td>AB Serum, GemCell</td><td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-080-401</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-033</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-065</td><td></td></tr><tr><td>CD14-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-072</td><td></td></tr><tr><td>CD20-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-077</td><td></td></tr><tr><td>CD45-VioBlue</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-136</td><td></td></tr><tr><td>aIFN-&gamma;-PE, human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-940</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-374</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution (100 &micro;g/ml)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Manufacturer</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Device&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-075-301</td><td></td></tr><tr><td>Software V1.0.0.RC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Software 2.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R&nbsp;</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer K2</td><td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td><td>LB-001-0016</td><td></td></tr><tr><td>Sterile tubing welder SCDIIB</td><td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td><td>7811</td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde cel verrijking van cytomegalovirus-specifieke t-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

De adoptieve overdracht van pathogeen-specifieke T-cellen kunnen worden gebruikt ter voorkoming en behandeling van opportunistische infecties zoals cytomegalovirus (CMV) infecties optreden na allogene hematopoietische stamceltransplantatie. Viraal-specifieke T-cellen van allogene donoren, met inbegrip van derden donoren, kan worden vermeerderd ex vivo in overeenstemming met de huidige goede fabricagepraktijken (cGMP), het gebruik van herhaalde rondes van antigeen-gedreven stimulatie om de gewenste T-cellen selectief te propageren. De identificatie en isolatie van antigeen-specifieke T-cellen kunnen ook worden uitgevoerd op basis van de cytokine beeldverwerkingssysteem van T-cellen die zijn geactiveerd met gamma-interferon (IFN-γ) afscheiden. Echter verbreide toepassing van het cytokine beeldverwerkingssysteem (CCS) voor het herstel van immuniteit beperkt als het productieproces is tijdrovend en vereist een ervaren operator. De ontwikkeling van een tweede generatie cel verrijking apparaat zoals CliniMACS Prodigy nustelt onderzoekers virus-specifieke T-cellen met behulp van een geautomatiseerde, minder arbeidsintensief systeem genereren. Dit apparaat scheidt magnetisch gemerkte cellen van niet-gemerkte cellen met behulp van magnetische geactiveerd celsortering technologie van klinische kwaliteit producten genereren, is ontworpen als een gesloten systeem en kan worden benaderd en uitgevoerd op de benchtop. We tonen de werking van dit nieuwe geautomatiseerde celverrijking apparaat CMV verkregen van een steady-state aferese verkregen uit een CMV seropositieve donor pp65-specifieke T-cellen produceren. Deze geïsoleerde T-cellen kunnen vervolgens direct worden toegediend in een patiënt onder institutionele en federale regelgeving toezicht. Alle stappen bioprocessen inbegrip van verwijdering van rode bloedcellen, wordt stimulatie van T-cellen, afscheiding van antigen-specifieke T-cellen, zuivering en wassen volledig geautomatiseerd. Apparaten zoals deze verhogen de mogelijkheid dat T-cellen voor toepassing op de mens buiten gewijd goede fabricagemethoden (GMP kan worden vervaardigd) Faciliteiten en in plaats daarvan worden geproduceerd in het bloed bancaire faciliteiten waar het personeel geautomatiseerde protocollen kunnen begeleiden om meerdere producten te produceren.

In deze studie, een geautomatiseerde celverrijking CCS System werd gebruikt voor de geautomatiseerde productie van CMV pp65-specifieke T-cellen. CMV-specifieke T-cellen werden verrijkt uit drie aferese celproducten. De steady-state aferese product werd geoogst meer dan 2 uur van een CMV-seropositieve donor en genereerde 10 10 totale nucleaire cellen (TNC). 10 9 TNC werden vervolgens geactiveerd met CMV-pp65 afgeleide peptiden (60 nmol) gedurende 4 uur en de IFN-γ-uitscheidende T-cellen werden geïso...

Het doel van dit protocol is om pathogeen-specifieke klinische graad T-cellen te produceren met behulp van een tafelblad, geautomatiseerde, tweede generatie celverrijkingsapparaat dat een gesloten cytokine-opvangsysteem bevat en geen toegewijd personeel of gebruik van een GMP-faciliteit vereist. De gegenereerde cytomegalovirus pp65-specifieke T-cellen kunnen direct aan patiënten worden toegediend.

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Het doel van deze procedure is het isoleren van klinische antigeenspecifieke T-cellen voor adoptieve immunotherapie met behulp van een cytokinenvangsystem. Dit wordt bereikt door eerst mononucleaire cellen, verkregen van een CMV-positieve donor, te incuberen met een panel van overlappende peptiden afgeleid van CMV PP 65 om de T-cellen te activeren. Vervolgens worden de geactiveerde antigeenspecifieke CD 45-positieve IFN gamma-expresserende T-cellen geïsoleerd via cytokinenvang.Het aantal en de zuiverheid van de CMV-specifieke T-cellen worden vervolgens bepaald via flowcytometrie. Uiteindelijk kan met dit cytokine-capturesysteem een hoog percentage CD4- en CD8-positieve, IFN-gamma-expresserende CMV-specifieke T-cellen worden geoogst. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zijn dat deze volledig geautomatiseerd is en dat er geen faciliteit die voldoet aan de goede productiepraktijken (GMP) vereist is om de gevangen klinische T-cellen te isoleren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen binnen het vakgebied van adoptieve celtherapie, zoals de vraag hoe de kosten die verbonden zijn aan celproductie kunnen worden verla

automated-cell-enrichment-cytomegalovirus-specific-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Circulerende tumorcellen worden geïsoleerd uit het bloed van patiënten met kanker kan brengen zonder dat cellulaire schade. Isolatie van tumorcellen vindt plaats via een bimoleculaire oppervlak van E-selectine naast antilichamen tegen epitheliale markers. Een nanobuis coating bevordert specifiek kankercellen hechting resulteert in een hoge capture zuiverheden.

Snelle Isolatie van Viable circulerende tumorcellen van de patiënt Blood Samples

This video describes T-cells enrichment from the spleen of a mouse by negative selection using a magnetic separator. The technique involves targeting the other cells in the sample for depletion using antibodies or ligands directed against specific cell surface antigens.

T-Cell Enrichment: A Technique to Isolate T-Cells from Mixed Cell Population by Magnetic Separation

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn prognostische in verschillende uitgezaaide tumoren. Dit manuscript beschrijft de gouden standaard CellSearch systeem (CSS) CTC opsomming platform en hoogtepunten gemeenschappelijke misclassificatie fouten. Daarnaast worden twee aangepast protocollen beschreven gebruiker gedefinieerde marker karakterisering van CTCs en CTC opsomming in preklinische muismodellen van metastase met deze technologie.

Aanpassing van semiautomated doorgeven Tumor Cell (CTC) Testen voor Klinisch en preklinisch onderzoek naar toepassingen

Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Hier presenteren we een geïntegreerde workflow om fenotypische en moleculaire kenmerken te identificeren die circulerende tumorcellen (CTCs) karakteriseren. Wij combineren levende immunokleuring en robotachtige micromanipulatie van enige en geclusterde CTCs met enige cel-gebaseerde technieken voor stroomafwaartse analyse en beoordeling van metastasen-zaait capaciteit.

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Hier presenteren we een protocol om de isolatie en uitbreiding van perifere bloedmononucleaire cellen-afgeleide cytokine-geïnduceerde CD3+CD56+ killer cellen uit te voeren en hun cytotoxiciteitseffect tegen hematologische en vaste kankercellen te illustreren met behulp van een in vitro diagnosestroom cytometriesysteem.

Isolatie en uitbreiding van cytotoxische Cytokine-geïnduceerde Killer T-cellen voor kankerbehandeling

De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC's) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.

Klinisch microfluïdisch chipplatform voor de isolatie van veelzijdige circulerende tumorcellen

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

Dit protocol beschrijft een schaalbare methode voor de uitbreiding van Adoptive Cell Therapies (ACT)-producten, namelijk Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-cellen en Cytokine-Induced Killer (CIK)-cellen, met behulp van gaspermeable Rapid expansion (G-Rex) apparaten, waarmee efficiënte en robuuste groei wordt aangetoond in een klinisch relevante omgeving.

Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Leer hoe u klinisch geschikte CMV-specifieke T-cellen isoleert voor adoptieve immunotherapie met een volledig geautomatiseerd cytokine-capturesysteem. Deze methode vereist geen GMP-faciliteit en verbetert de toegankelijkheid van celtherapieën.

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem (Video) | JoVE Journal

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

Meer video's verkennen