Name: Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys 2 -Zijn 2 Zinkvinger Domeinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Leer hoe u functionele eiwitten levert aan zoogdiercellen met behulp van doorlaatbare zinkvingerdomeinen. Deze methode omvat plasmidegeneratie, expressie in bacteriën, zuivering en incubatie met cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DP1CA174426 naar Carlos F. Barbas) en ShanghaiTech University, Shanghai, China (naar JL). Moleculaire graphics werden gegenereerd met behulp van PyMol.

1. Klonen <ol><li> Verkrijgen-alanine vervangen met twee vingers ZIF domeinen die zijn sub-gekloond in de dierenwinkel-28 expressie vector systeem en zijn beschikbaar op aanvraag (PET-2F-ZIF) beschikbaar. 34 </li><li> PCR versterken EmGFP uit het plasmide Emerald-pBAD met de primers 5 &#39;XmaI-EmGFP (5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;; XmaI site in vet) en 3 &#39;Sacl-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3&#39; ; Sac I-plaats in vet). <ol><li> Gebruik 5 ng template DNA, 10 ui 10X polymerasebuffer, 1 Units (U) van Taq DNA-polymerase, 0,2 mM van elke dNTP en 0,2 uM van elke primer in 100 ul oplossing met de resterende hoeveelheid uit gedestilleerd / gedeïoniseerd water . Gebruik de cycling condities: 95 ° C gedurende 5 min; 30 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 10 min. Zuiver het PCR product door gel extractiop en bepaal DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer meet Abs 260 x 50 pg / ml. </li></ol></li><li> Digest pET-2F-ZIF en het insert codeert EmGFP met de restrictie-enzymen Xmal en SacI in aangeraden buffer gedurende 3 uur bij 37 ° C met 10 U enzym per 1 ug DNA. Visualiseer DNA door agarose gelelektroforese met een fluorescerende intercalerende kleurstof zoals ethidiumbromide. </li><li> Zuiver het gedigereerde DNA door gelextractiekit en bepaal DNA-concentratie door een spectrofotometer meet Abs 260 x 50 pg / ml. </li><li> Afbinden de gezuiverde EmGFP coderende DNA in 50-100 ng pET-2F-ZIF met 1 U van T4 DNA Ligase gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Voor de beste resultaten, presteren de ligeringsreactie met een 6: 1 insert-to-vector molverhouding. </li><li> Dooi 50 ul van een chemisch bevoegde XL-1 Blue Escherichia coli-cellen op ijs en meng voorzichtig met 10-20 ng geligeerd pET-2F-ZIF-EmGFP. </li><li> Keep on ice voor 30 min. Heat shock het mengsel bij 42 ° C gedurende 90 sec en herstellen de cellen in 2 ml Super Optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden. </li><li> Verdeel 100 ui herstel cultuur op lysogenie bouillon (LB) agar plaat met 50 ug / ml kanamycine en geïncubeerd O / N bij 37 ° C. </li><li> De volgende dag, enten 6 ml Super Broth (SB) of LB kweek die 50 ug / ml kanamycine met een kolonie van de LB agar plaat en cultuur O / N bij 37 ° C. Opmerking: Kolonie PCR met de primers 5&#39;-Xmal EmGFP en 3&#39;SacI-EmGFP kan worden gebruikt om positieve klonen voor Miniprep identificeren. </li><li> Zuiver pET-2F-Zif-EmGFP door miniprep en bevestig plasmide door DNA-sequentiebepaling met T7 promoter (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;). </li></ol> 2. Expressie en zuivering <ol><li> Ontdooi 50 ui chemisch competente BL21 E. coli-cellen op ijs en meng voorzichtig met 100 ng PET-2F-ZIF-EmGFP plasmid. Transformeren zoals beschreven in de stappen 1,7-1,8. </li><li> De volgende dag, enten 10 ml LB medium dat 50 ug / ml kanamycine met een enkele kolonie en kweken O / N bij 37 ° C onder schudden. </li><li> De volgende dag Verdun 10 ml O / N kweek in 1 liter LB medium aangevuld met 50 ug / ml kanamycine, 0,2% glucose en 100 uM ZnCl2. Groeien de kweek bij 37 ° C onder schudden tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,8 en induceren eiwitexpressie met 2 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Na 6 uur groei bij 37 ° C, oogst cellen door centrifugatie bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Opmerking: Inductie omstandigheden zeer variabel en afhankelijk van de stabiliteit van de eiwitten tot expressie. Controleer de OD 600 elke 30 minuten totdat een OD600 van 0,8 is bereikt. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 5 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 pM ZnCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM MgCl2, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 10 mM imidazool, pH 8,0). Lyse de cellen op ijs door sonicatie met de volgende instelling: 50% vermogen, 4 min proces tijd met 5 sec aan / 10 sec uit intervallen. Oververhitting van de oplossing. </li><li> Centrifugeer het cellysaat bij 25.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en breng het supernatant naar een nieuwe verzamelbuis. Voor de beste resultaten, presteren alle volgende stappen bij 4 ° C. </li><li> Voer de bovenstaande vloeistof op een kolom vooraf gepakt met 1 ml geëquilibreerd Ni-NTA slurry. Spoel de hars met 20 ml wasbuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 en 30 mM imidazool, pH 8,0). </li><li> Elueer het eiwit met 5 ml elutiebuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 en 300 mM imidazool, pH 8,0). </li><li> Bufferuitwisseling het geëlueerde eiwit met opslagbuffer (50 mMTris-HCl, 500 mM NaCl, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 en 10% glycerol, pH 8,0) en concentreer het eiwit ten minste 40 uM met een spin concentrator door centrifugatie volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Bepaal eiwitconcentratie door BCA of Bradford assay. Meng 2 pl gezuiverde eiwitten met 2 pl 2 x SDS-PAGE loading dye, kookt bij 95 ° C gedurende 10 min en vervolgens oplossen van 4% -20% Tris-Glycine SDS-PAGE eiwit zuiverheid (figuur 2) te evalueren. </li></ol> 3. Eiwit Opslag <ol><li> Aliquot de geconcentreerde proteïneoplossing, flash bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Voor EmGFP fusie-eiwitten omvatten de buis met aluminiumfolie om het eiwit te beschermen tegen licht. </li><li> Vermijd herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van de eiwitoplossing. Opmerking: Zif-gefuseerde eiwitten onder deze omstandigheden stabiel gedurende ten minste 1 maand. Ongepaste of&gt; 4 maanden opslag kan leidenom eiwitprecipitatie of fotobleking van EmGFP. </li></ol> 4. eiwittransductiedomein <ol><li> Handhaaf HeLa-cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) dat 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycoticum bij 37 ° C in een volledig bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. Opmerking: Cellen gepasseerd meer dan 30 keer worden niet aanbevolen voor eiwittransductiedomein. </li><li> Pre-coat een 24-wells plaat met 500 ul van 50 ug / ml poly-lysine 30 tot 60 min bij 25 ° C. Zaad cellen op een 24-wells plaat met een dichtheid van 2 x 10 5 cellen per putje. Op 24 uur na het uitzaaien, of wanneer cellen 80% -90% confluent Verwijder media uit elk putje en wassen met 500 ul voorverwarmde serumvrij DMEM (SFM). </li><li> Aan elke well 250 ul van SFM die 2 uM Ziv-EmGFP eiwit en 100 uM ZnCl2. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: ZIF domeinen te voeren cellen primarily door macropinocytose, 34 dat is een energie-afhankelijk mechanisme. Daarom moeten de cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C voor een efficiënte eiwit internalisatie. </li><li> Verwijder media uit cellen en was driemaal met 500 ul van calcium- en magnesium vrij Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) aangevuld met 0,5 mg / ml heparine. Opmerking: Heparine moet oppervlak gebonden eiwit dat stroomafwaarts analyses kunnen compliceren verwijderen. </li><li> (Optioneel) Herhaal behandelingen tot drie maal voor een betere levering. </li><li> Isoleer behandelde cellen direct na heparine was door digestie met 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 2 min. Resuspendeer losgemaakte cellen in 0,5 ml DPBS aangevuld met 1% FBS. </li><li> Meet de fluorescentie-intensiteit van elk monster door flowcytometrie 35 met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) kanaal (figuur 3). Pas de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) aan de bevolking van plaatsenrente op schaal, zodat populaties met verschillende eigenschappen worden opgelost van elkaar. </li><li> Verzamel 10.000 live evenementen voor elk monster en de gegevens met behulp van flowcytometrie data-analyse software. 36 Normaliseren fluorescentie van HeLa-cellen behandeld met ZIF-EmGFP om die cellen alleen behandeld met SFM analyseren. </li></ol>

<ol><li>Berg, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domain+delivery+of+therapeutic+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).</li>
<li>Lindsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+cell+delivery%3A+application+in+protein+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA delivery systems.</a> Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).</li>
<li>Guo, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+nonviral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in nonviral vectors for gene delivery.</a> Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55, 1189-1193 (1988).</li>
<li>Elliott, G., O'Hare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+trafficking+and+protein+delivery+by+a+herpesvirus+structural+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.</a> Cell. 88, 223-233 (1997).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).</li>
<li>Smith, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+cationic+cell-permeable+miniature+proteins+via+alpha-helical+arginine+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).</li>
<li>Daniels, D. S., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+cell-permeable+miniature+proteins+based+on+a+minimal+cationic+PPII+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).</li>
<li>Karagiannis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+biomimetic+cell+penetrating+peptide+library%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library.</a> ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).</li>
<li>Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+cell+penetrating+peptide+identified+using+a+plasmid+display-based+functional+selection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform.</a> ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+grafting+to+endow+cell+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Arginine grafting to endow cell permeability.</a> ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+delivery+of+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo+using+a+supercharged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.</a> ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).</li>
<li>Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery+to+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).</li>
<li>Zelphati, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+with+a+new+lipid-mediated+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.</a> J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Voelkel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+from+retroviral+Gag+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein transduction from retroviral Gag precursors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).</li>
<li>Sinha, V. R., Trehan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+microspheres+for+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable microspheres for protein delivery.</a> J. Control Release. 90, 261-280 (2003).</li>
<li>Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+TALEN+proteins+via+bioconjugation+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering.</a> PLoS One. 9, e85755(2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyarginine+as+a+multifunctional+fusion+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Polyarginine as a multifunctional fusion tag.</a> Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).</li>
<li>Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+protein+transduction+is+cell+type-dependent+and+is+enhanced+by+dextran+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate.</a> J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).</li>
<li>Al-Taei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+traffic+and+fate+of+protein+transduction+domains+HIV-1+TAT+peptide+and+octaarginine.+Implications+for+their+utilization+as+drug+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors.</a> Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cell-penetrating+peptide-mediated+peptide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.</a> Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188, 773-782 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+by+direct+delivery+of+zinc-finger+nuclease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins.</a> Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).</li>
<li>Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+zinc+finger+proteins%3A+the+advent+of+targeted+gene+regulation+and+genome+modification+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies.</a> Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in targeted genome editing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+human+proteins+that+deliver+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo.</a> Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+Cys2-His2+zinc-finger+domains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains.</a> ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).</li>
<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basics of flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).</li>
<li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li>
<li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Aart%2C+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide%2C+bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier is een stap-voor-stap protocol voor eiwit aflevering met behulp van cel-permeabele zinkvinger (ZIF) domeinen gepresenteerd. De ZIF domein niet de activiteit van gesmolten enzymatische lading 34 te verminderen; maakt de productie en zuivering van eiwitten in opbrengsten nagenoeg identiek aan die waargenomen met ongemodificeerde eiwit; en kunnen eiwitten en enzymen in diverse celtypen te transporteren met rendementen traditionele celpenetrerende peptide of eiwit transductie domein te boven gaat. Samen vorm...

Zeer efficiënte en veelzijdige eiwit levering strategieën zijn van cruciaal belang voor veel fundamenteel onderzoek en therapeutische toepassingen. De directe afgifte van gezuiverde eiwitten in cellen vormt een van de veiligste en eenvoudigste methoden om dit. 1,2 Unlike strategieën afhankelijk genexpressie van nucleïnezuren, eiwitten 5/3 levering geen gevaar dat mutagenese, onafhankelijk van de cellulaire transcriptie / translatie machines en zorgt voor een onmiddellijk effect. Echter, het ontbreken van eenvoudige en generaliseerbaar methoden voor begiftigt celpenetrerende activiteit op eiwitten routinematig verwart hun directe binnenkomst in cellen. Huidige werkwijzen voor intracellulair eiwit levering faciliteren zijn gebaseerd op het gebruik van natuurlijk voorkomende 6-8 of gemaakt cel penetrerende peptiden 9-12 supercharged transductie domeinen 13,14 nanodeeltjes 15 en liposomen, 16 virusachtige partikels 17,18 </sup&gt; en polymere microsfeer materialen. 19 Helaas zijn veel van deze benaderingen worden gehinderd door lage cellulaire opname prijzen, 20,21 slechte stabiliteit, 22 onbedoelde celtype specificiteit, 23 lage endosomale ontsnapping eigenschappen 24 en toxiciteit. 25 Bovendien zijn veel eiwitten transductie technologieën verminderen de biologische activiteit van de geleverde eiwitten. 14 Ons laboratorium eerder aangetoond dat zink-vinger nuclease (ZFN) eiwitten - chimeer beperking endonucleases bestaande uit een programmeerbare Cys 2 -Zijn 2 zinkvinger DNA-bindende eiwitten en de splitsing domein van de FokI restrictie endonuclease 26-28 - zijn inherent cel- doorlaatbaar. 29 Dit verrassende celpenetrerende activiteit werd aangetoond dat het een intrinsieke eigenschap van de op maat ontworpen zink-vinger domein van een DNA-bindende platform dat heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor gerichte genoom en zijngineering, 30-32 en als het resultaat van de constellatie van zes positief geladen resten op het eiwit oppervlak. Inderdaad hebben verscheidene DNA-bindende eiwitten, waaronder c-Jun en de N-DEK blijkt een aangeboren vermogen om celmembranen bezitten. 33 Recentelijk ons laboratorium breidde deze resultaten en toonde dat de cel penetrerende werking van zink vinger (ZIF) domeinen kunnen worden ingezet voor intracellulaire eiwit levering. Genetische fusie van enkelzijdige of vingers ZIF domeinen specifiek eiwit lading tot efficiëntie dat veel conventionele celpenetrerende peptide afgiftesystemen overschreden opname. 34 Met name Zif-gemedieerde aflevering niet de activiteit van gesmolten enzymatische lading beschadigen en vergemakkelijkt hoge cytosolische levering. Tezamen zijn deze bevindingen tonen het potentieel van de Zif domein die een efficiënte en gemakkelijke afgifte van eiwitten en mogelijk diverse soorten macromoleculen in cellen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol over het implementeren van ZIF technologie voor proteïne levering in zoogdiercellen gepresenteerd. We hebben eerder geconstrueerd een reeks een-, twee-, drie-, vier-, vijf- en zes vingers ZIF domeinen die het vermogen om DNA te binden, door substitutie van elk van de α-helix DNA-bindende residuen missen, maar kunnen leveren eiwitten in cellen 34 (figuur 1). De productie en overdracht van Emerald GFP (EmGFP) in HeLa-cellen met behulp van een twee-vinger ZIF domein wordt beschreven. Dit protocol is uitbreidbaar tot bijna elk eiwit dat oplosbaar expressie in Escherichia coli en bijna elk zoogdier celtype. Verwachte resultaten worden verstrekt en strategieën voor het maximaliseren van de prestaties van dit systeem worden ook besproken.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR system</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose Resin</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Flat Bottom Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, No Calcium, No Magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparan Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000 spectrophotometer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

direct eiwit levering aan zoogdiercellen behulp van cell-permeabel cys<sub&gt; 2</sub&gt; -zijn<sub&gt; 2</sub&gt; zinkvinger domeinen

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Vanwege hun modulariteit en het vermogen om opnieuw geprogrammeerd te worden om een breed scala aan DNA-sequenties te herkennen, zijn Cys2-His2 zink-vinger DNA-bindende domeinen opgekomen als nuttige hulpmiddelen voor gerichte genoom engineering. Net als veel andere DNA-bindende eiwitten, bezitten zink-vingers ook de aangeboren capaciteit om celmembranen te passeren. We hebben onlangs aangetoond dat deze intrinsieke celdoorlaatbaarheid kan worden benut voor intracellulaire eiwitlevering. Genetische fusie van zink-vinger motieven leidt tot efficiënte transport van eiwit- en enzymvracht in een breed scala van zoogdierceltypen. In tegenstelling tot andere eiwittransductietechnologieën, remt levering via zink-vingerdomeinen de enzymactiviteit niet en leidt tot hoge niveaus van cytosolische levering. Hier wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol gepresenteerd voor de implementatie van zink-vinger technologie voor eiwitlevering in zoogdiercellen. Belangrijke stappen voor het bereiken van hoge niveaus van intracellulaire zink-vinger-gemedieerde levering worden benadrukt en strategieën voor het maximaliseren van de prestaties van dit systeem worden besproken.

Twee vingers Zif-EmGFP fusie-eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in E. coli met&gt; 95% homogeniteit en hoge opbrengsten (&gt; 25 mg / ml) (Figuur 2). In het algemeen één of twee vingers kan ZIF fusie-eiwitten worden geproduceerd in hoeveelheden die nagenoeg identiek aan die van wildtype ongemodificeerde proteïne. In sommige contexten, vijf- en zes vingers ZIF fusieproteïnen niet in opbrengsten hoog genoeg voor verdere toepassingen worden geproduceerd. Rec...

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Zijn<sub&gt; 2</sub&gt; Zinkvinger Domeinen

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe zinkvinger-domeinen kunnen worden gebruikt om functionele eiwitten, zoals groen fluorescerend eiwit, in zoogdiercellen af te leveren. Dit wordt bereikt door eerst een expressieplasmide te genereren dat het emerald groen fluorescerend eiwit MGFP translationeel gefuseerd met zinkvinger-domeinen bevat. De tweede stap is het tot expressie brengen van het fluorescente fusie-eiwit in bacteriën.Vervolgens worden de bacteriële cellen gelyseerd en wordt het fluorescente fusie-eiwit gezuiverd. De laatste stap is het incuberen van zoogdiercellen met het gezuiverde fluorescente fusie-eiwit om opname mogelijk te maken. Uiteindelijk kan de fluorescentie van de behandelde cellen worden gekwantificeerd via flowcytometrie om de efficiëntie van de aflevering van het fusie-eiwit in de cellen te bepalen.Het belangrijkste voordeel van thief of andere proteinetransductiedomeinen, zoals het HIV-afgeleide tight-peptide of polyarginine, is dat ze een hoge mate van cytosolische afgifte kunnen faciliteren zonder de activiteit van de enzymatische cargo in het veld in gevaar te brengen. Om de PCR te starten, wordt de emerald GFP- of MGFP-sequentie uit een plasmide geamplificeerd volgens het tekstprotocol; zuiver het PCR-product vervolgens met een gel-extractiekit en bepaal daarna de DNA-concentratie met een spectrofotometer. Verkrijg vervolgens een PET 28-expressievector die de sequentie van alanine bevat.Vervang twee vingers, zinkvingers of twee FZ-domeinen, de digestieve vector en het MG F-P-P-C-R product met de restrictie-enzymen XMA I en SAC I, gebruikmakend van 10 units enzym per microgram DNA, en incubeer de digesten gedurende drie uur bij 37 °C. Zuiver de DNA-fragmenten via gelextractie en meet de concentraties van de vector en het MG F-P-P-C-R product met een spectrofotometer. Combineer het MG F-P-P-C-R product en 50 tot 100 nanogram van de vector in één buis bij een molaire insert-vectorratio van zes op één.Voeg vervolgens één eenheid T4 DNA-ligase toe en incubeer de reactie gedurende één uur bij kamertemperatuur om de bacteriën te transformeren met het geligeerde plasmide. Ontdooi een aliquot van 50 µL chemisch competente e. coli-cellen op ijs. Meng de cellen vervolgens voorzichtig met 10 tot 20 nanogram van het geligeerde DNA en incubeer de cellen met het DNA gedurende 30 minuten op ijs.Na de incubatie worden de cellen 90 seconden lang onderworpen aan een hitteshock bij 42 °C. Voeg twee milliliters SOC-medium toe aan de buis en laat de cellen gedurende één uur herstellen bij 37 °C onder schudcondities om de transformanten te selecteren. Verspreid 100 µL van de cultuur op LB-agarplaten die 50 µg/mL kanamycine bevatten en incubeer de platen de volgende dag gedurende de nacht bij 37 °C.Inoculeer een cultuur van 6 mL LB met 50 µg/mL kanamycin met een geïsoleerde kolonie van de overnight-plaat. Incubeer de cultuur overnight bij 37 °C onder schudcondities. Verzamel de volgende dag de cellen en voer een miniprep uit om het plasmide te isoleren, en bevestig vervolgens het plasmide door sequenering met de primer.Voor de T7-promotor moet het plasmide een N-terminale translationele fusie bevatten van de twee FZ-domeinen met MGFP. Om te beginnen met de eiwitzuivering: transformeer eerst BL21(DE3)-cellen met 100 nanogram van het gezuiverde plasmide.Selecteer de volgende dag op transformanten op LB-agar met kanamycin. Inoculeer een cultuur van 10 milliliter LB-medium met kanamycin met een enkele kolonie van de overnight-plaat en incubeer de cultuur overnight bij 37 °C onder schudding. Verdun de gehele overnight-kolonie in één liter LB-medium, aangevuld met kanamycin, 0,2% glucose en 100 µM zinkchloride. Incubeer de cultuur bij 37 °C onder schudding totdat een optische dichtheid bij 600 nm van 0,8 wordt bereikt, en voeg vervolgens IPTG toe tot een eindconcentratie van 2 mM om de expressie te induceren. Centrifugeer de cultuur na zes uur inductie bij 5.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te oogsten.Resuspendeer de celpellet in vijf milliliter lysisbuffer en lyseer de cellen vervolgens op ijs via sonicatie, met een vermogen van 50% en een cyclus van vijf seconden aan en tien seconden uit gedurende vier minuten. Centrifugeer het cellysaat daarna bij 25.000 ×g gedurende 30 minuten bij vier °C en breng het supernatant over naar een nieuwe opvangbuis op ijs. Om het eiwit te zuiveren, wordt het supernatant geladen op een kolom die vooraf is gevuld met één milliliter nikkel-nitril-azijnzuursuspensie.Nadat het supernatant door de kolom is geleid, wordt de hars gewassen met 20 milliliters wasbuffer. Elueer het eiwit uit de kolom met vijf milliliters elutiebuffer, breng de oplossing vervolgens over in dialysebuisjes, dialyseer het eiwit en bewaar de buffer na dialyse gedurende de nacht. Gebruik een spinconcentrator om het eiwit te concentreren tot ten minste 40 micromolar door één uur lang te centrifugeren bij 3000 ×g.Bepaal de proteïneconcentratie en zuiverheid zoals aangegeven in het tekstprotocol voor opslag. Aliquoteer 200 microliters van de proteïne in 1,5 milliliter centrifugebuisjes en bedek het buisje met folie om MGFP-fusieproteïnen te beschermen tegen fotobleken. Bevries de proteïne vervolgens snel (flash-freeze) in vloeibare stikstof en bewaar deze bij negatief 80 graden Celsius. Om u voor te bereiden op proteïnetransductie, moet u eerst de wells van een 24-wells plaat pre-coaten met 500 microliters van een oplossing van 50 micrograms per milliliter.Polylysine gedurende 30 tot 60 minuten bij 25 °C. Zuig de oplossing uit de wells voordat de celcultuur wordt gezaaid. Laat de cellen herstellen in DMM met 10% FBS en 1% antibioticum-antimycoticum bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide.Oogst de cellen en zaai ze uit op de 24-wells plaat met een dichtheid van 200, 000 cellen per well. Plaats de 24-wells plaat vervolgens in de incubator; na ongeveer 24 uur incubatie zijn de cellen 80 tot 90% confluent. Aspireer het medium uit elke well en was de cellen met 500 microliters voorverwarm serumvrij medium of SFM.Voeg 250 µL SFM met twee µM Z-M-G-F-P-eiwit en 100 µM zinkchloride toe aan elke well en incubeer de cellen vervolgens gedurende één uur bij 37 °C. Aspireer daarna het medium uit de wells en was de cellen drie keer met 500 µL calcium- en magnesiumvrije docos fosfaatgebufferde zoutoplossing, bekend als DPBS, aangevuld met 0,5 mg/mL heparine. Voeg vervolgens 200 µL 0,05% trypsin EDTA toe aan de wells en incubeer gedurende twee minuten bij 37 °C om de cellen van de plaat los te maken.Breng de losgekomen cellen over naar een nieuwe buis en centrifugeer deze 5 minuten lang bij 300 ×g. Resuspendeer de cellen vervolgens in 500 milliliters DPBS aangevuld met 1% FBS en meet de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het monster via flowcytometrie met behulp van het FITC-kanaal zoals eerder beschreven. Stel de forward scatter en side scatter zo in dat de populatie van belang op de schaal wordt geplaatst.Gebruik vervolgens gedefinieerde gating om de controle- en testmonsters te analyseren. Verzamel 10.000 levende cellen per monster en gebruik de flowcytometrie-analysesoftware om de gegevens te verwerken. Normaliseer de fluorescentie-intensiteit van de met proteïne behandelde cellen ten opzichte van de met controleserum behandelde cellen.Zif MGFP-fusie-eiwitten werden geproduceerd in e coli, gezuiverd en geanalyseerd via SDS-page. Deze resultaten tonen aan dat het ZIF MG FP-fusie-eiwit met twee vingers is gezuiverd tot een homogeniteit van meer dan 95%. Wanneer helo-cellen werden behandeld met toenemende concentraties van het ZIFF MG FP-fusie-eiwit.Zij vertoonden een dosisafhankelijke toename in de gemiddelde fluorescentie-intensiteit, gemeten via flowcytometrie; opeenvolgende behandelingen met het Z MG FP-fusie-eiwit bij een concentratie van 2 µM resulteerden in bijna 100% van de cellen met MGFP-fluorescentie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het gebruik van de thief-eiwittranslocatiedomeinen om functionele eiwitten in mycellen af te leveren.

direct-protein-delivery-to-mammalian-cells-using-cell-permeable-cys2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eiwit transductie maakt de directe levering van biologisch actieve eiwitten in cellen. In tegenstelling tot conventionele methoden, zoals DNA-transfectie of virale transductie deze niet-invasieve paradigma maakt zeer efficiënte cellulaire manipulatie in een titreerbare manier te omzeilen cellulaire toxiciteit en het risico van oncogene transformatie door permanente genetische modificatie.

Technische Cel-permeabel Protein

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.

Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

We beschrijven hier een kosteneffectief granzyme-expressiesysteem met behulp van HEK293T-cellen dat hoge opbrengsten produceert van zuivere, volledig geglycoseerde en enzymatisch actieve protease.

Een hoge opbrengst en kosten-efficiënte Expression System van Human granzymen in zoogdiercellen

We beschrijven hoe eiwitten en cel-ondoorlatende kleine moleculen in gekweekte zoogdiercellen kunnen worden afgeleverd door middel van een eenvoudig co-incubatieprotocol met een reagens dat ervoor zorgt dat endocytische organellen lekkend worden.

Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Bestaande methoden voor het modificeren van planten hebben een beperkte toepasbaarheid. De nieuwe peptide-afgeleide technologie die hier wordt voorgesteld, belooft zowel eenvoud als efficiëntie in de introductie van exogeen eiwit of genen in de gewenste intracellulaire compartimenten van intacte planten.

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

Dit is een protocol bij het bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op het systeem van de Biotine-avidin-pull-down met de nieuwigheid van het combineren van cel-penetrating sequenties. Het belangrijkste voordeel is dat de volgorde van de doelgroep is geïncubeerd met levende cellen in plaats van de cel lysates en daarom de interacties in het cellulaire kader zal optreden.

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Leer hoe u functionele eiwitten levert aan zoogdiercellen met behulp van doorlaatbare zinkvingerdomeinen. Deze methode omvat plasmidegeneratie, expressie in bacteriën, zuivering en incubatie met cellen.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys

Meer video's verkennen