Name: Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer hoe u recombinante humane IgG-monoklonale antilichamen genereert uit onsterfelijke B-cellen voor immunologisch onderzoek. Deze methode behoudt de originele zware en lichte ketenparing voor nauwkeurige antilichaamkarakterisering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek contract Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) naar (GN-G.). Fellowship uit Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek &quot;Graduate School Translationele Neurowetenschappen Program&quot; (022005019) tot (CH). Subsidies van het Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) en de Association Française contre les Myopathies naar (PM-M.); alsmede door een Veni Fellowship van Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (916.10.148) een gemeenschap van de Hersenstichting Nederland (FS2008 (1) -28) en het Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (ML ). Wij danken Jozien Jaspers voor haar hulp in de B-celsortering door middel van flowcytometrie.

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
<li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li>
<li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation%3A+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li>
<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

In dit manuscript worden alle stappen voor het genereren van IgG-antilichamen uit humane PBMCs gedetailleerd besproken. Dit protocol bevat een aantal voordelen ten opzichte van eerder gepubliceerde technieken. Eén van de voordelen is dat de aanwezigheid van antilichamen houdt de zware en lichte ketens die overeenkomen met de oorspronkelijke pair in de B-cel kloon. De identificatie van IgG-antilichamen kan worden uitgevoerd in elk type van menselijke donor, en er is geen behoefte aan verergering van de immuunrespons door...

Het doel van dit artikel is in detail te beschrijven een methode voor het genereren en karakteriseren van humane IgG monoklonale antilichamen verkregen uit humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). De belangstelling voor de menselijke antilichamen studeren is gegroeid in veel verschillende gebieden van het onderzoek. Met name veel onderzoeksgroepen zijn geïnteresseerd in de pathologie veroorzaakt door auto-antilichamen 1-3. We hebben gekloneerd en gekarakteriseerd pathogene autoantilichamen 1. De studie van autoantilichamen kunnen helpen om hun doelen te identificeren en therapeutische strategieën te ontwikkelen, bijvoorbeeld door het gebruik deelnemer 4 antilichamen. Bovendien kan de studie van humane antilichamen ook interesse in andere onderzoeksgebieden, dat wil zeggen, om de immuunreactie na vaccinatie te evalueren 5, het antilichaamprofiel van individuen die werden blootgesteld en werd resistent tegen specifieke pathogenen 6 of een studie karakteriseren welke antilichamen inde natuurlijke repertoire 7,12. Verscheidene technieken zijn ontwikkeld om recombinante humane monoklonale antilichamen 8-12 genereren; de meeste van deze te gebruiken faagdisplay en B-cel immortalisatie. Het gebruik van faagdisplay is uitgebreid toegepast voor de ontdekking van nieuwe antilichamen 13. Zij heeft echter een groot nadeel, namelijk dat de zware en lichte keten paren van de humane immunoglobuline wordt gedissocieerd in het proces. Productie van hybridoma&#39;s met humane B cellen of EBV transformatie ondervangt dit bezwaar. We gebruiken infectie van thymus B-cellen met EBV in combinatie met polyklonale B-cel stimulatie via Toll-like receptor 9 (TLR-9) 6,12. In dit artikel beschrijven we in detail de technologie die we gebruiken voor de ontwikkeling van IgG humane antilichamen, met een compleet overzicht van alle stappen van PBMC isolatie om de in vitro antilichaam generatie. Dezeprotocol kan worden gebruikt voor de analyse van elk type humaan IgG profiel. In ons laboratorium hebben B cellen die IgG antilichamen met succes gescheiden van de rest van PBMCs na sortering. Vijftig gesorteerd 8 B-cellen kunnen vervolgens worden uitgeplaat in multi-well platen en geïmmortaliseerd door EBV en TLR-9 activering gedurende de klonale expansie van afzonderlijke B-cellen. Zoals voedingscellen zijn fibroblasten van humane embryonale longweefsel gebruikt, cellijn WI38, waarbij de visualisatie van de geïmmortaliseerde B-cellen vergemakkelijkt. Uit deze B-cellen, kunnen de sequenties van de zware en lichte ketens van het immunoglobuline worden verkregen door PCR, en genen de antilichamen &quot;immunoglobuline G gekloneerd in expressievectoren en in vitro geproduceerd. Met deze techniek kan enige antilichamen met dezelfde antilichaamsequentie in de donor worden bestudeerd.

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>oplossing met polysucrose en natriumdiatrizoaat</td></tr><tr><td>FACSAria II celsorteerder&nbsp;</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 U-bodem microputjes&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>30% v/v EBV-bevattend supernatant van de B95-8 cellijn&nbsp;&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3,4 x 108 kopieën/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38 cellen&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>Interleukine-2</td><td>Roche&nbsp;</td><td>10799068001</td><td></td></tr><tr><td>ELISA platen</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fc&gamma; Fragment Specifiek (ongeconjugeerd)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% vetvrije droge melk (Blotting Grade Blocker)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>HUMAN IgG gezuiverd Immunoglobulin, 5,6 mg/ml</td></tr><tr><td>Goat F(ab)2 antihuman IgG Fc&gamma; (geconjugeerd met peroxidase (PO))</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>ELISA lezer (Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-geconjugeerd AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5&micro;&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Cells Direct cDNA Synthese Systeem&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR Systeem 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High Pure RNA Isolatie Kit&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde transcriptie systeem kit&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Taq DNA Polymerase</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>Primer (2 &mu;l)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR zuiveringskit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 cyclussequentiekits&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>0,1 ml reactieplaat (MicroAMP Optisch 96-putjes)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Genetisch analyaser ABI300&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; competent cellen (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4.493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4.484 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>LB-gebaseerd agarmedium aangevuld met Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB)-gebaseerd vloeibaar medium aangevuld met Zeocin (Fast-Media Zeo TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep kit&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (ND1000 Spectrofotometer)</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-gebaseerd agarmedium aangevuld met Blasticidin (Fast-Media Blast Agar)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB)-gebaseerd vloeibaar medium aangevuld met Blasticidin (Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20.000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0,1-10,0 kb, 1.000 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Thermogevoelige alkalische fosfatase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/µl, in 10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha; competent cellen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

generering van recombinant humaan igg monoclonal antibodies uit onsterfelijk gesorteerde b cells

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Het vinden van nieuwe methoden voor het genereren van humane monoklonale antilichamen is een actief onderzoeksgebied dat belangrijk is voor zowel fundamentele als toegepaste wetenschappen, inclusief de ontwikkeling van immunotherapeutische middelen. De technieken om dergelijke antilichamen te identificeren en te produceren, zijn echter vaak moeizaam en soms worden de zware en lichte ketenparen van de antilichamen gedissocieerd. Hier beschrijven we een relatief eenvoudig, rechtlijnig protocol om humane recombinante monoklonale antilichamen te produceren uit humane perifere bloedmononucleaire cellen met behulp van immortalisatie met Epstein-Barr Virus (EBV) en activering van Toll-like receptor 9. Met een adequate kleuring kunnen B-cellen die antilichamen produceren, worden geïsoleerd voor daaropvolgende immortalisatie en klonale expansie. De antilichaamtranscripten geproduceerd door de geïmmortaliseerde B-celklonen kunnen worden versterkt door PCR, gesequenced als corresponderende zware en lichte kettingparen en gekloond in immunoglobuline-expressievectoren. De antilichamen verkregen met deze techniek kunnen krachtige hulpmiddelen zijn om relevante menselijke immuunresponsen te bestuderen, inclusief auto-immuniteit, en de basis vormen voor nieuwe therapeutische middelen.

Het sorteren gating na kleuren CD22- en IgG positieve cellen wordt getoond in figuur 1 In dit beeld het gebied van de dubbele positieve cellen -. B cellen die IgG antilichamen - is geselecteerd om al deze cellen in een afzonderlijke buis sorteren. In de analyse, ongeveer 1% van de totale PBMC&#39;s overeenkomen met deze dubbele positieve populatie. Het aantal gesorteerde cellen verkregen hangt af van het aantal cellen verkregen in deel 1. De verschillende resultaten na 5 wek...

Synthese van humane monoklonale antilichamen is de eerste stap in studies die gericht zijn op het ontrafelen van de pathofysiologische mechanismen van auto-antilichaam-gemedieerde immuunresponsen. We hebben een protocol ontwikkeld om recombinante humane immunoglobuline G (IgG) monoklonale antilichamen te genereren van uit bloed gesorteerd B-cellen, inclusief B-cel isolatie, antilichaam klonen en in vitro synthese.

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Het algemene doel van deze procedure is het klonen en tot expressie brengen van antilichamen die door B-cellen worden geproduceerd. Dit wordt bereikt door eerst B-cellen te isoleren uit een relevant bronweefsel, zoals bloed of uit de thymus. De tweede stap is het uitvoeren van FACS om de B-celpopulatie te selecteren die positief is voor IgG-productie.Vervolgens worden de cellen geïmmortaliseerd door infectie met het Epstein-Barrvirus, samen met activatie van toll-like receptor negen door C-P-G-O-D-N 2006, en in cultuur gehouden. De laatste stappen zijn het isoleren van RNA uit klonen die positief zijn getest op IgG-productie via Eliza en het genereren van complementair DNA van zowel de lichte als de zware IgG-ketens. Uiteindelijk kunnen de IgG-sequenties worden gekloond in mammaliaanse expressievectoren om grote hoeveelheden monoklonaal humaan IgG te produceren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals phage display-technologie, is dat de oorspronkelijke pairing van de zware en lichte IgG-ketens behouden blijft. Deze methode kan cruciale vragen op het gebied van autoimmuniteit beantwoorden, zoals de ontdekking en functionele karakterisering van pathogene autoantilichamen. Houd er rekening mee dat het werken met patiëntmateriaal en het EBV-virus risicovol kan zijn.Het EB-virus is een menselijk pathogeen en er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals VSL 2 PROE en het dragen van adequate bescherming, bij het uitvoeren van deze stappen. Voordat de PBMC's worden gekleurd, moeten ze in een 25 centimeter fles worden geplaatst met zes milliliters compleet RPMI 1640-medium om gedurende de nacht te herstellen. Nadat de cellen zijn geblokkeerd en gewassen, worden de PBMC's verzameld in een buis met een halve milliliter medium en gecentrifugeerd. Resuspendeer de cellen vervolgens in labelingsbuffer en tel ze.Bereid vervolgens twee fax-buisjes voor met elk 5 miljoen cellen in 200 µL buffer. Voeg 10 µL anti CD 22 P-E-R-C-P of 40 µL anti IgG pe toe en laat deze gedurende 30 minuten op ijs en in het donker incuberen, waarna de cellen gewassen, gefiltreerd en gesorteerd worden. Het doel is om de dubbel-positieve cellen te tellen.Begin met het verdunnen van de gesorteerde P BMC's tot één cel per microliter in RPMI 1640, compleet medium met toevoeging van C PG 2006 en EBV. Zaai vervolgens in een zuurkast 110 microliters van de celverdunning met EBV en CPG 2006 in twee wells van een 96-wells ronde bodemplaat die vooraf is gezaaid met bestraalde WI 38-cellen. De infectie van 50 cellen per well is geoptimaliseerd en vergroot de kans om een monoklonaal antilichaam te verkrijgen.We raden echter aan om dit te bevestigen via een PCR. Inspecteer de cellen na een week incubatie onder een microscoop op de groei van B-cellen. Vervang na twee weken het medium: aspireer langzaam 90 µL medium uit elke well en breng dit over naar een nieuwe plaat.Om de IgG-productie door Eliza te testen. Voeg vervolgens aan elke well 100 µL vers aangevuld medium toe, inclusief IL-2. Controleer de groei van de klonen gedurende hun derde en vierde groeikweekweek.Herhaal de mediumverversing elke week. Raadpleeg het tekstprotocol voor methoden voor clonale expansie. Controleer het supernatant van de mediumverversingen op IgG-productie met een enzyme-linked immunosorbent assay of ELISA.Bereid eerst de ELISA-platen voor door in elke well 50 µL geiten anti-human FC-antilichamen te pipetteren, verdund 1:200 in coatingbuffer. Na incubatie en het wassen van de plaat worden de wells geblokkeerd met 100 µL blokkeringsbuffer per well, waarna de plaat opnieuw wordt geïncubeerd. Na de blokkeringsincubatie wordt de vloeistof uit de plaat op een papieren handdoek geklopt.Zodra de plaat is voorbereid, worden de supernatanten verdund met vier volumes RPMI. Maak vervolgens voor de standaardcontroles een seriële verdunning van menselijke IgG-oplossing in RPMI van 1000 nanogram per milliliter tot 15,6 nanogram per milliliter.Voeg ook een blanco toe. Breng 50 µL van het supernatant of de standaard aan in elke well en incubeer de ELISA-plaat gedurende één uur bij 37 °C op dezelfde wijze; aanvullende ELISA's kunnen worden opgezet om verdere verdunningen van de supernatanten te analyseren om de antibody-affiniteit te testen. Was de plaat na de incubatie.Breng vervolgens in elke put 50 µL incubatiebuffer met peroxidase-geconjugeerde fab twee aan. Na nog een uur incubatie en een volgende wasstap wordt aan elke put 100 µL substraatoplossing met TMB toegevoegd. Incubeer de plaat vervolgens tot 10 minuten, totdat de verschijnende blauwe kleur stabiliseert.Stop vervolgens de reactie en meet de absorptie. Kloonsupernatanten met een gemeten absorbentie van drie standaarddeviaties boven de blanco zijn positief.Voor humane IgG-antilichamen kan de antigene specificiteit worden aangetoond met verdere assays. Begin met het volgen van het tekstprotocol om kopie-DNA te synthetiseren uit de positieve klonen. Stel vervolgens PCR's op voor de IgG-zware keten, kappa- en lambdaketens.Zoek in de resultaten naar de zware keten tussen 400 en 550 basenparen. Zoek naar de lichte keten tussen 300 en 400 basenparen. Indien deze niet aanwezig zijn, gebruik dan een microliter van de producten als template voor een nieuwe PCR.De nieuwe producten moeten zich in het juiste bereik bevinden. Ga vervolgens verder met het kloneren van de beste producten. Sequenceer deze eerst. Hun electroferogrammen moeten schoon zijn en overeenkomen met een enkele immunoglobuline-sequentie.Volg het tekstprotocol. Cloneer het gezuiverde PCR-product in een microgram plasmid DNA. Zorg ervoor dat de ligatie gedurende de nacht plaatsvindt bij 16 °C.Bereid de HX-cellen voor in aangevuld DMEM met behulp van T4 DNA-ligase en kweek deze tot 75% confluentie in kweekkolven van 75 vierkante centimeter. Bereid voor elke transfectie van de zware en lichte keten een mengsel van 1,75 Milliliters serumvrij DMEM, inclusief 4,5 micrograms zware keten-vector, drie micrograms lichte keten-vector en 50 microliters polyethyleenoplossing. Voeg dit mengsel voorzichtig toe aan een plaat met HX-cellen en cirkel de oplossing over de plaat.Incubeer de plaat een nacht en begin vervolgens elke dag met het verzamelen van het kweekmedium. Vervang dit door serumvrij medium. Het medium bevat de antilichamen en kan dagelijks gedurende vier dagen worden verzameld nadat CD 22- en IgG-positieve p BMCs via FACS zijn gesorteerd.Het gebied met de dubbel positieve cellen, B-cellen die IgG-antilichamen produceren, werd afzonderlijk verzameld voor expansie. Ongeveer 1% van de pbmc behoorde tot deze dubbel positieve populatie. Na vijf weken van EBV-immortalisatie en CPG 2006-stimuli werden geïmmortaliseerde klonen geïsoleerd.WI 30-feeder cellen hebben een meer langwerpige fibroblastvorm, en de B-celklonen verschijnen als zeer kleine ronde cellen die in clusters groeien in het midden van de multi-well plaat met ronde bodem. Het supernatant van de groeiende klonen werd getest met een ELISA voor IgG. Een positieve kloon werd gedefinieerd als een kloon met een waarde die drie standaarddeviaties boven de blanco-waarde lag.Ten minste drie supernatanten van een positieve kloon testten positief in de eli. Antilichamen van een positieve kloon werden gesequenced nadat de variabele en constante regio's van het immunoglobuline zware keten- en lambda keten-paar waren gekloond, waardoor de zware en lichte keten konden worden gekarakteriseerd. Volgens deze procedure.Andere methoden, zoals sequencing, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over zaken als antilichaam- en gengebruik, genetische diversiteit, enzovoort. Na deze ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van auto-immuniteit om ziekten, pathologie en relevante therapeutische strategieën voor auto-immuunziekten zoals myasthenia gravis te onderzoeken. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnostiek en therapie van ziekten zoals myasthenia gravis, omdat de ontdekking van pathogene antilichamen kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe behandelingen, zoals concurrerende antilichamen zonder inflammatoire activiteit.

generation-recombinant-human-igg-monoclonal-antibodies-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een high-throughput, geautomatiseerd platform van de productie cellijn ontwikkeling voor de productie van therapeutische eiwitten is beschreven. Uitvoering van de BD FACS Aria Cell Sorter, heeft CloneSelect Imager en Tecan Freedom EVO liquid handling systeem gedemonstreerd aanzienlijk toegenomen verwerkingscapaciteit in cellijn ontwikkeling met verbeterde cellijn kwaliteit en een hoge reproduceerbaarheid.

Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Een geoptimaliseerd protocol wordt gepresenteerd voor de generatie van monoklonale antilichamen op basis van de hybridoma-technologie. Muizen werden geïmmuniseerd met een immunoconjugaat. Miltcellen werden gefuseerd door PEG en een elektrische impuls met onsterfelijke myeloomcellen. Antilichaam-producerende hybridoma-cellen werden geselecteerd door HAT en antigeen-specifiek ELISA-screening.

Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Een efficiënt systeem van de structuur en functie analyse van een gen in...

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

C57BL / 6 muizen werden gebruikt om Hc pathogenese bestuderen en het beste model te bieden. We zijn het verkennen van de potentiële voordelen van humorale immuniteit tegen deze schimmel en genereerde verschillende mAb's [om histon H2B en een heat shock protein 60kDa] die we getest op hun beschermende werking na intraperitoneale toediening.

Passieve Toediening van monoklonale antilichamen tegen H. capsulatum Ea schimmels

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

Leer hoe u recombinante humane IgG-monoklonale antilichamen genereert uit onsterfelijke B-cellen voor immunologisch onderzoek. Deze methode behoudt de originele zware en lichte ketenparing voor nauwkeurige antilichaamkarakterisering.

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Meer video's verkennen