Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Het algemene doel van deze procedure is het klonen en tot expressie brengen van antilichamen die door B-cellen worden geproduceerd. Dit wordt bereikt door eerst B-cellen te isoleren uit een relevant bronweefsel, zoals bloed of uit de thymus. De tweede stap is het uitvoeren van FACS om de B-celpopulatie te selecteren die positief is voor IgG-productie.

Vervolgens worden de cellen geïmmortaliseerd door infectie met het Epstein-Barrvirus, samen met activatie van toll-like receptor negen door C-P-G-O-D-N 2006, en in cultuur gehouden. De laatste stappen zijn het isoleren van RNA uit klonen die positief zijn getest op IgG-productie via Eliza en het genereren van complementair DNA van zowel de lichte als de zware IgG-ketens. Uiteindelijk kunnen de IgG-sequenties worden gekloond in mammaliaanse expressievectoren om grote hoeveelheden monoklonaal humaan IgG te produceren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals phage display-technologie, is dat de oorspronkelijke pairing van de zware en lichte IgG-ketens behouden blijft. Deze methode kan cruciale vragen op het gebied van autoimmuniteit beantwoorden, zoals de ontdekking en functionele karakterisering van pathogene autoantilichamen. Houd er rekening mee dat het werken met patiëntmateriaal en het EBV-virus risicovol kan zijn.

Het EB-virus is een menselijk pathogeen en er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals VSL 2 PROE en het dragen van adequate bescherming, bij het uitvoeren van deze stappen. Voordat de PBMC's worden gekleurd, moeten ze in een 25 centimeter fles worden geplaatst met zes milliliters compleet RPMI 1640-medium om gedurende de nacht te herstellen. Nadat de cellen zijn geblokkeerd en gewassen, worden de PBMC's verzameld in een buis met een halve milliliter medium en gecentrifugeerd. Resuspendeer de cellen vervolgens in labelingsbuffer en tel ze.

Bereid vervolgens twee fax-buisjes voor met elk 5 miljoen cellen in 200 µL buffer. Voeg 10 µL anti CD 22 P-E-R-C-P of 40 µL anti IgG pe toe en laat deze gedurende 30 minuten op ijs en in het donker incuberen, waarna de cellen gewassen, gefiltreerd en gesorteerd worden. Het doel is om de dubbel-positieve cellen te tellen.

Begin met het verdunnen van de gesorteerde P BMC's tot één cel per microliter in RPMI 1640, compleet medium met toevoeging van C PG 2006 en EBV. Zaai vervolgens in een zuurkast 110 microliters van de celverdunning met EBV en CPG 2006 in twee wells van een 96-wells ronde bodemplaat die vooraf is gezaaid met bestraalde WI 38-cellen. De infectie van 50 cellen per well is geoptimaliseerd en vergroot de kans om een monoklonaal antilichaam te verkrijgen.

We raden echter aan om dit te bevestigen via een PCR. Inspecteer de cellen na een week incubatie onder een microscoop op de groei van B-cellen. Vervang na twee weken het medium: aspireer langzaam 90 µL medium uit elke well en breng dit over naar een nieuwe plaat.

Om de IgG-productie door Eliza te testen. Voeg vervolgens aan elke well 100 µL vers aangevuld medium toe, inclusief IL-2. Controleer de groei van de klonen gedurende hun derde en vierde groeikweekweek.

Herhaal de mediumverversing elke week. Raadpleeg het tekstprotocol voor methoden voor clonale expansie. Controleer het supernatant van de mediumverversingen op IgG-productie met een enzyme-linked immunosorbent assay of ELISA.

Bereid eerst de ELISA-platen voor door in elke well 50 µL geiten anti-human FC-antilichamen te pipetteren, verdund 1:200 in coatingbuffer. Na incubatie en het wassen van de plaat worden de wells geblokkeerd met 100 µL blokkeringsbuffer per well, waarna de plaat opnieuw wordt geïncubeerd. Na de blokkeringsincubatie wordt de vloeistof uit de plaat op een papieren handdoek geklopt.

Zodra de plaat is voorbereid, worden de supernatanten verdund met vier volumes RPMI. Maak vervolgens voor de standaardcontroles een seriële verdunning van menselijke IgG-oplossing in RPMI van 1000 nanogram per milliliter tot 15,6 nanogram per milliliter.

Voeg ook een blanco toe. Breng 50 µL van het supernatant of de standaard aan in elke well en incubeer de ELISA-plaat gedurende één uur bij 37 °C op dezelfde wijze; aanvullende ELISA's kunnen worden opgezet om verdere verdunningen van de supernatanten te analyseren om de antibody-affiniteit te testen. Was de plaat na de incubatie.

Breng vervolgens in elke put 50 µL incubatiebuffer met peroxidase-geconjugeerde fab twee aan. Na nog een uur incubatie en een volgende wasstap wordt aan elke put 100 µL substraatoplossing met TMB toegevoegd. Incubeer de plaat vervolgens tot 10 minuten, totdat de verschijnende blauwe kleur stabiliseert.

Stop vervolgens de reactie en meet de absorptie. Kloonsupernatanten met een gemeten absorbentie van drie standaarddeviaties boven de blanco zijn positief.

Voor humane IgG-antilichamen kan de antigene specificiteit worden aangetoond met verdere assays. Begin met het volgen van het tekstprotocol om kopie-DNA te synthetiseren uit de positieve klonen. Stel vervolgens PCR's op voor de IgG-zware keten, kappa- en lambdaketens.

Zoek in de resultaten naar de zware keten tussen 400 en 550 basenparen. Zoek naar de lichte keten tussen 300 en 400 basenparen. Indien deze niet aanwezig zijn, gebruik dan een microliter van de producten als template voor een nieuwe PCR.

De nieuwe producten moeten zich in het juiste bereik bevinden. Ga vervolgens verder met het kloneren van de beste producten. Sequenceer deze eerst. Hun electroferogrammen moeten schoon zijn en overeenkomen met een enkele immunoglobuline-sequentie.

Volg het tekstprotocol. Cloneer het gezuiverde PCR-product in een microgram plasmid DNA. Zorg ervoor dat de ligatie gedurende de nacht plaatsvindt bij 16 °C.

Bereid de HX-cellen voor in aangevuld DMEM met behulp van T4 DNA-ligase en kweek deze tot 75% confluentie in kweekkolven van 75 vierkante centimeter. Bereid voor elke transfectie van de zware en lichte keten een mengsel van 1,75 Milliliters serumvrij DMEM, inclusief 4,5 micrograms zware keten-vector, drie micrograms lichte keten-vector en 50 microliters polyethyleenoplossing. Voeg dit mengsel voorzichtig toe aan een plaat met HX-cellen en cirkel de oplossing over de plaat.

Incubeer de plaat een nacht en begin vervolgens elke dag met het verzamelen van het kweekmedium. Vervang dit door serumvrij medium. Het medium bevat de antilichamen en kan dagelijks gedurende vier dagen worden verzameld nadat CD 22- en IgG-positieve p BMCs via FACS zijn gesorteerd.

Het gebied met de dubbel positieve cellen, B-cellen die IgG-antilichamen produceren, werd afzonderlijk verzameld voor expansie. Ongeveer 1% van de pbmc behoorde tot deze dubbel positieve populatie. Na vijf weken van EBV-immortalisatie en CPG 2006-stimuli werden geïmmortaliseerde klonen geïsoleerd.

WI 30-feeder cellen hebben een meer langwerpige fibroblastvorm, en de B-celklonen verschijnen als zeer kleine ronde cellen die in clusters groeien in het midden van de multi-well plaat met ronde bodem. Het supernatant van de groeiende klonen werd getest met een ELISA voor IgG. Een positieve kloon werd gedefinieerd als een kloon met een waarde die drie standaarddeviaties boven de blanco-waarde lag.

Ten minste drie supernatanten van een positieve kloon testten positief in de eli. Antilichamen van een positieve kloon werden gesequenced nadat de variabele en constante regio's van het immunoglobuline zware keten- en lambda keten-paar waren gekloond, waardoor de zware en lichte keten konden worden gekarakteriseerd. Volgens deze procedure.

Andere methoden, zoals sequencing, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over zaken als antilichaam- en gengebruik, genetische diversiteit, enzovoort. Na deze ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van auto-immuniteit om ziekten, pathologie en relevante therapeutische strategieën voor auto-immuunziekten zoals myasthenia gravis te onderzoeken. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnostiek en therapie van ziekten zoals myasthenia gravis, omdat de ontdekking van pathogene antilichamen kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe behandelingen, zoals concurrerende antilichamen zonder inflammatoire activiteit.