Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Het algemene doel van deze procedure is om stamcellen veilig en effectief in alginate, hydrogelcapsules in te bedden en ze in de capsules te kweken om de aggregatie en micro-omgeving te controleren. Dit wordt bereikt door eerst een gefilterde stamcelsuspensie en een natriumalginate-oplossing te mengen. De mix wordt vervolgens overgebracht naar een spuit en er wordt een coaxiale mondstuk op de spuit geïnstalleerd voordat ze op een spuitpomp worden geplaatst. Vervolgens worden de druppels bereid door de celsuspensie uit te drijven met co-stromend stikstofgas, gevolgd door verzameling en calciumchloride-oplossing.

De capsules worden vervolgens behandeld met poly L lysine om cellulair lekken te voorkomen en EDTA om de binnencapsules te vloeibaar maken voordat de ingekapselde cellen worden gekweekt in een roterende schudconditie. Ten slotte worden de cellen uit de capsules verzameld door EDTA en fysieke vernietiging van het membraan. Uiteindelijk voorkomt alginaat-incapsulatie van pluripotente stamcellen dat de cellen overmatig gaan aggregaten en beperkt het de scheurstress die de cellen in suspensiecultuur ervaren.

Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het biologische en biomedische veld te beantwoorden, zoals grote expansie van celtransplantatie en onderzoek naar stamcelniches. Begin met cel-incapsulatie door de cellen te verzamelen zoals beschreven in het tekstprotocol na centrifugatie bij 160 keer G gedurende drie minuten. Was de geïnduceerde pluripotente stam- of IPS-celpellet door Resus, op te schorsen in heuvels gebufferd zoutje en centrifugeer driemaal na resus, de cellen en heuvels gebufferd zoutje op te schorsen.

Filter de celsuspensie door een 40 micron celstrainer om grote aggregaten te verwijderen, die anders de mondstuk zouden kunnen verstoppen. Meng vervolgens twee milliliters gefilterde celsuspensie en drie milliliters 5% natriumalginate-oplossing. Om een vijf milliliters celsuspensie in 3% natriumalginate te verkrijgen, is de celdichtheid DIR meer dan 1 miljoen cellen per milliliter.

Na het verzamelen van de celsuspensie in een vijf milliliters spuit, installeer een coaxiale mondstuk op de spuit en plaats ze op een spuitpomp. Zorg voor stikstofgasstroom door de buitenste naald van de coaxiale mondstuk en drijven de celsuspensie door de binnenste mondstuk. Verzamel druppels in 250 milliliters 0,5% calciumchloride-oplossing en wacht 10 tot 20 minuten voor stollingstijd terwijl je roert bij 60 tot 90 RPM. Na wassen met heuvels gebufferd zoutje, worden verzamelde capsules gebruikt als naakte capsules om de capsules te behandelen. Calciumalginatecapsules worden geïncubeerd in 0,05%gewicht per volume.

Poly L lysine-oplossing gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met schudden. Na het verzamelen van de capsules in een buis en wassen met heuvels gebufferd zoutje, incubeer ze in DMEM bevattend 10% FBS. Om de elektrische lading op hun oppervlak te neutraliseren, gebruik de resulterende capsules als gecoate capsules om holle capsules te genereren.

Incubeer de capsules in heuvels gebufferd zoutje bevattend 10 millimolar EDTA gedurende vijf minuten. De met EDTA behandelde capsules worden gebruikt als holle capsules. Incubeer de ingekapselde cellen bij 75 RPM met schudden bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 10 dagen na incubatie, verzamel en incubeer de capsules in 10 millimolar EDTA bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 10 minuten.

Verzamel de cellen van de alginatecapsules zonder poly l lycine-behandeling door centrifugatie bij 1000 keer G gedurende drie minuten. Als alginatecapsules worden behandeld met poly L lysine, breek de alginate poly L lysine-membraan door te pipetteren op en neer ongeveer 10 keer met een naald die aan een spuit is bevestigd. De naalddiameter moet lager zijn dan de capsulegrootte, en 25 gauge naalden worden gebruikt in dit experiment.

Na centrifugatie bij 1000 tot 5.000 keer G gedurende vijf minuten, verzamel strikt het celpellet van gebroken alginate poly L lycine-membranen. Als mRNA-monsters worden verzameld uit cellen, merk op dat resterende alginate poly L lycine-membranen mRNA-zuivering kunnen voorkomen zoals gevisualiseerd door een hogesnelheidscamera. De uitgedreven alginate-oplossing vormt onmiddellijk na het uitdrijven een bolvormige vorm. Als de suspensie wordt uitgedreven met een stikstofstromingssnelheid lager dan één liter per minuut, is de grootte van de druppels uniform.

Als de stikstofstroom echter hoger is dan één liter per minuut, breekt de druppel uiteen en wordt de grootte van de druppels heterogeen. Gezien dit, is het moeilijk om druppels kleiner dan 500 microns te bereiden met behulp van deze methode. In het geleerbewerkingsproces vormen natriumalginatedruppels bolvormige calciumalginatecapsules in calciumchloride-oplossing.

Als de concentratie van natriumalginate voldoende hoog is, veroorzaakt een lage concentratie van natriumalginate niet-bolvormige en niet-sferische vormen van capsules, die een probleem veroorzaken in het coderingsproces. Zelfs als de natriumalginate-concentratie niet voldoende is, kunnen bolvormige capsules worden gevormd door de calciumconcentratie te verhogen. Echter, ongeveer 50 millimolar calciumchloride is geschikt voor incapsulatie omdat een te hoge concentratie calciumchloride de cellulaire groei en levensvatbaarheid vermindert.

Ingekapstelde cellen kunnen in de capsules groeien, maar er kan cellulair lekken optreden in capsules zonder de alginate poly L lysine-coating. In het geval van muis IPS-cellen vormen de cellen schijfvormige aggregaten in elke calciumalginatecapsule, terwijl de cellen samenklonteren en enkele bolvormige aggregaten vormen in elke holle capsule. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je cellen kunt inkapselen en kweken tot groottecontrole.

Waterstofvangst zonder enige speciale apparatuur, geen organische absorberende stof.