Name: Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer pluripotente stamcellen inkapselen in alginathydrogel met een co-axiale nozzle. Deze methode minimaliseert celaggregatie en afschuifspanning tijdens suspensiecultuur voor massaproductie en onderzoek naar stamcelniches.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door het S-Innovation project van de Japan Science and Technology Agency (JST), het Graduate Program for Leaders in Life Innovation (GPLLI) van de Universiteit van Tokyo, en de Research Fellowship for Young Scientists van de Japan Society for the Promotion of Science. We danken nac Image Technology Inc. voor het maken van films met behulp van een hi-speed camera.

1. Voorbereiding Materials <ol><li> Bereid 10 mM HEPES buffer. Stel de pH tot 7,0 bij RT en voeg NaCl tot 0,9%. </li><li> Bereid 5% alginaatoplossing en 10 mM EDTA-oplossing door het mengen van HEPES-gebufferde zoutoplossing bereid in 1,1. Stel de pH op 7,0 bij kamertemperatuur. </li><li> Autoclaaf reagentia (1.1, 1.2) gedurende 20 minuten bij 121 ° C. </li><li> Bereid gelatine beklede 60 mm schalen gelaagd met 1,2-2,0 x 10 6 muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen, die als feeder-cellen worden behandeld door incubatie in DMEM dat 10% FBS ES-gekwalificeerd en 10 ug / ml mitomycine C gedurende 90 - 120 min. </li><li> Handhaaf muis geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen op de schaal met de voedingscellen in de aanwezigheid van 5 ml DMEM hoog glucose met 20% van de ES-gekwalificeerde FBS, 50 uM 2-mercaptoethanol, niet-essentiële aminozuren en antibiotica ( 100 eenheden / ml penicilline G natrium, 100 ug / ml streptomycine sulfaat, en 250 ng / ml amphotericin B). </li><li> Seed 4 x 10 5 iPS cellen op een met gelatine beklede 60 mm schaal en incubeer ze op 37 ° C en 5% CO 2. Verander het kweekmedium dagelijks tijdens incubatie. Na 3-4 dagen kweken trypsinize cellen gedurende 1 min aan 500 ui 0,05% Trypsine bevattende 0,02% EDTA bij 37 ° C en 5% CO 2. Na dat, los cellen door de cultuur schotel tien keer te tikken. </li><li> Voeg 2,5 ml DMEM met 10% van de ES-gekwalificeerde FBS en antibiotica (na dissociatie muis iPS cellen in enkele cellen door pipetteren met 1000 pi micropipet drie keer) centrifuge celsuspensie bij 160 x g gedurende 3 minuten en verwijder supernatant en tel de cellen . Na celtelling, reseed de verzamelde cellen op een met gelatine beklede schaal en incubeer gedurende 30 minuten op de iPS cellen te isoleren van de MEF cellen. Na het tellen van de cellen (gewoonlijk 1-3 x 10 6 cellen / schaal kunnen worden verzameld), reseed 4 × 10 5 iPS cellen opde schotel. </li></ol> 2. Cell Encapsulation in Alginate Hydrogel Capsules <ol><li> Verzamel de cellen door hetzelfde in 1.5 en 1.6 beschreven werkwijze. Na centrifugeren bij 160 x g gedurende 3 minuten, was de iPS cel pellet met HEPES-gebufferde zoutoplossing driemaal. Na het opnieuw suspenderen van de cellen in HEPES-gebufferde zoutoplossing, filter de celsuspensie door een 40 um cel zeef om grote aggregaten, die anders het mondstuk zouden kunnen verstoppen. </li><li> Meng 2 ml celsuspensie in HEPES-gebufferde zoutoplossing en 3 ml van 5% Alg-Na oplossing. Tenslotte 5 ml celsuspensie binnen 3% Alg-Na oplossing wordt verkregen. Celdichtheid voorkeur meer dan 10 6 cellen / ml. </li><li> Na het verzamelen van de celsuspensie in een spuit 5 ml, installeert een coaxiale spuitmond (Figuur 1A, B) op de spuit en zet deze op injectiepomp. Zend N 2 gasstroom (minder dan 1 liter / min) door de buitenste naald van de coaxiale spuitmond enverdrijven de celsuspensie door het binnenste mondstuk. </li><li> Verzamel druppels in 250 ml 0,5% CaCl2-oplossing en wacht 10-20 minuten voor geleren onder roeren bij 60-90 rpm. </li></ol> 3. Behandeling van Alginate capsules (optioneel) <ol><li> Incubeer Alg-Ca capsules in 0,05% (w / v) poly-l-lysine (PLL) oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Na wassen van de capsules met HEPES-gebufferde zoutoplossing, incubeer ze in DMEM met 10% FBS om neutraliseren de elektrische lading op het oppervlak. Ze gebruiken als gecoate capsules (figuur 1C). </li><li> Incubeer de capsules in HEPES-gebufferde zoutoplossing bevattende 10 mM EDTA gedurende 5 min. De met EDTA behandelde capsules worden gebruikt als holle capsules (figuur 1C). </li></ol> 4. Cultuur en Verzamel cellen in Alginate Capsules <ol><li> Incubeer de ingekapselde cellen bij 75 rpm met schudden bij 37 ° C en 5% CO 2gedurende 10 dagen. </li><li> Verzamelen en incubeer de capsules in 10 mM EDTA bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 10 minuten. Verzamel cellen van het alginaat capsules zonder PLL behandeling door centrifugatie bij 1000 x g gedurende 3 min. </li><li> Wanneer alginaat capsules worden behandeld met PLL, breken de Alg-PLL membraan door en neer te pipetteren ongeveer tienmaal met een naald bevestigd aan een injectiespuit en Centrifugeer bij 1.000 - 5.000 x g gedurende 5 min. Naalddiameter moet lager zijn dan capsulegrootte en 25 G (260 um) naalden worden gebruikt in dit experiment (600 urn) </li><li> Na centrifugeren, verzamel celpellet strikt uit gebroken Alg-PLL membranen als u wilt mRNA monsters te verzamelen van cellen. Resterende Alg-PLL membranen mogelijk te voorkomen mRNA zuivering. </li></ol>

<ol><li>Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+production+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large scale production of stem cells and their derivatives.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).</li>
<li>Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+microcarrier+properties+affecting+the+expansion+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+Res%22%5BJournal%5D)">Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).</li>
<li>Schroeder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+lineage+selection+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+stirred+bench+scale+bioreactor+with+automated+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control.</a> Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).</li>
<li>Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agitation+can+induce+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+microcarrier+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%22%5BJournal%5D)">Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures.</a> Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+for+testing+controlled+%C3%9F-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments.</a> Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+morphology%2C+and+pluripotency+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+in+three+different+types+of+alginate+beads+for+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production.</a> Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).</li>
<li>Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vascular+endothelial+growth+factor+functionalized+agarose+to+guide+pluripotent+stem+cell+aggregates+toward+blood+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells.</a> Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Production+of+Embryoid+Bodies+in+Microbeads%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).</li>
<li>Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+Preparation+of+Monodispersed+Calcium+Alginate+Microbeads+in+a+Novel+Microfluidic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Technol%22%5BJournal%5D)">Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System.</a> Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).</li>
<li>Sakai, M. P., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Bioactive+Hydrogel+Capsules+for+The+3D+Expansion+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors.</a> Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+effects+of+secreted+soluble+factor+preserve+better+pluripotent+state+of+embry-+onic+stem+cell+culture+in+a+membrane-based+compartmentalized+micro-bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor.</a> Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alternative+fate+other+than+default+neuronal+fate+of+embryonic+stem+cells+in+a+membrane-based+two-chambered+micro-+bioreactor+by+cell-secreted+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Inkapseling cultuur kan worden vergeleken met directe suspensiecultures. Suspensiekweek is een eenvoudiger manier om grote hoeveelheden pluripotente stamcellen dan inkapseling methoden te verkrijgen. Echter, het regelen van de aggregatie van cellen in suspensiekweek blijft een uitdaging. In inkapselingsmethode wordt cellulaire aggregatie beperkt capsules en kan daarom goed worden gecontroleerd. Een eerdere publicatie bleek dat ingekapselde cellen gevormd aggregaten van uniforme grootte, terwijl grote cel klonten v...

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) zijn momenteel de bron van intensief onderzoek vanwege hun rol in de regeneratieve geneeskunde. Echter, enorme hoeveelheden cellen zijn nodig voor weefselregeneratie. Bijvoorbeeld ongeveer een miljard pancreascellen die nodig zijn voor een type 1 diabetespatiënt1. Echter, conventionele schotelcultuur kan slechts 1 × 105 cellen/cm2 verkrijgen, waardoor 1 m2 kweekoppervlak nodig is om voldoende stamcel-afgeleide pancreascellen te verkrijgen om een type 1 diabetespatiënt te behandelen. De ontwikkeling van een systeem voor de massacultuur van pluripotente stamcellen, zoals microcarrier2 en suspensiecultuur, is daarom vereist voor regeneratieve geneeskunde. Suspensiecultuur vertegenwoordigt een veelbelovende methode voor massacultuur, maar het controleren van de aggregatie van cellen is uitdagend in directe suspensieculturen van menselijke iPS-cellen3. Inderdaad, gesuspendeerde cellen worden blootgesteld aan afschuifspanning, wat celbeschadiging3 of differentiatie4 veroorzaakt.
Onderzoek naar hydrogel-gebaseerde incapsulatie is uitgevoerd om problemen met suspensiecultuur op te lossen. In hydrogelcapsules worden cellen beschermd tegen de stroom van het medium. Eerdere rapporten hebben het gebruik van verschillende soorten hydrogel, waaronder agarose5, PEG6 en alginaat (Alg), voor cellulaire incapsulatie gedocumenteerd. Alg-Ca-hydrogel is een van de meest bruikbare hydrogels voor cellulaire incapsulatie omdat Alg-Ca-hydrogel onmiddellijk wordt gevormd na het druppelen van alginaatoplossing in een CaCl2-oplossing en ook gemakkelijk wordt verteerd door enzymen of chelerende reagentia.
Hier hebben we een stabiel alginaat-incapsulatieproces voor iPS-cellen opgesteld met behulp van een co-axiale spuit. Door N2-gasstroom te gebruiken voor het vormen van druppels, is het mogelijk om cellen in uniforme capsules te incapsuleren zonder de noodzaak van andere reagentia zoals olie. In deze methode zijn de stroomsnelheid van N2 en de concentratie van zowel CaCl2 als alginaat de belangrijkste operationele omstandigheden die de grootte, vorm en uniformiteit van capsules beïnvloeden. Dit rapport toont de optimalisatie van deze operationele omstandigheden aan door het gebruik van een hogesnelheidscamera en een microscoop.

<table><tbody><tr><td>Muis embryo fibroblast</td><td>Cel Biolabs</td><td>SNL 76/7</td><td></td></tr><tr><td>Muis geïnduceerde pluripotente stamcel</td><td>RIKEN Bio resource centre</td><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoog-glucose</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>ES gekwalificeerd&nbsp; FBS</td><td>GIBCO</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>Antibacteriële antibiotica</td><td>GIBCO</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuur</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>GIBCO</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO leukemie remmende factor</td><td>Merck Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>26 G/16 G naald</td><td>Hoshiseido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Natrium&nbsp; Chloride</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Alginate</td><td>Wako</td><td>194-09955</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Wako</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000)</td><td>SIGMA</td><td>P7890</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>DOJINDO</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Sylinge pomp</td><td>AS ONE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Hispeed camera</td><td>nac image technology</td><td>Memrecam HX-3</td><td></td></tr></tbody></table>

alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen met behulp van een co-axiale nozzle

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotente stamcellen (PS-cellen) zijn het onderwerp van intensief onderzoek vanwege hun rol in regeneratieve geneeskunde en medicijnscreening. Echter, de ontwikkeling van een massacultuursysteem zou nodig zijn voor het gebruik van PS-cellen in deze toepassingen. Suspensiecultuur is een veelbelovende kweekmethode voor de massaproductie van PS-cellen, hoewel sommige problemen zoals het beheersen van aggregatie en het beperken van schurende stress van het kweekmedium nog steeds onopgelost zijn. Om deze problemen op te lossen, ontwikkelden we een methode voor calciumalginaat (Alg-Ca) encapsulatie met behulp van een coaxiale sproeikop. Deze methode kan de grootte van de capsules gemakkelijk beheersen door N2 gas mee te laten stromen. De beheersbare capsulediameter moet groter zijn dan 500 µm omdat een te hoge stroomsnelheid van N2 gas de opsplitsing van druppels veroorzaakt en dus capsules van heterogene grootte. Bovendien veroorzaakt een lage concentratie van Alg-Na en CaCl2 niet-bolvormige capsules. Hoewel een Alg-Ca capsule zonder coating van Alg-PLL gemakkelijk oplost, waardoor cellen kunnen worden verzameld, kunnen ze ook potentieel lekken uit capsules zonder een Alg-PLL coating. Inderdaad, een alginaat-PLL coating kan cellulair lekken voorkomen, maar is ook moeilijk te breken. Deze technologie kan worden gebruikt voor onderzoek naar de stamcel-niche evenals de massaproductie van PS-cellen omdat encapsulatie het micro-omgeving rondom cellen kan wijzigen, inclusief de extracellulaire matrix en de concentratie van uitgescheiden factoren.

Bij protocol 2.5, de verdreven alginaatoplossing vormt een bolvorm onmiddellijk na uitzetting (Figuur 2A - H). Wanneer de suspensie wordt uitgestoten met een N2-stroom lager is dan 1 l / min, de grootte van de druppeltjes gelijkmatig (figuur 2i). Indien de stroom N2 groter is dan 1L / min, de druppel breekt (figuur 2G, witte arrowed) en de grootte van de druppeltjes heterogeen (Figuur 2J). Op grond hiervan is het moeilijk om druppe...

We hebben een methode ontwikkeld om pluripotente stamcellen (PS-cellen) in alginaathydrogeelkapsels te inkapselen met behulp van een coaxiale mondstuk. Dit voorkomt dat cellen zich overmatig bundelen en beperkt de schuifspanning die cellen in suspensiecultuur ervaren. De techniek is toepasbaar op de massaproductie van PS-cellen evenals op onderzoek naar stamcelniches.

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Het algemene doel van deze procedure is om stamcellen veilig en effectief in alginaat-hydrogelcapsules in te bedden en deze binnen de capsules te kweken om aggregatie en de micro-omgeving te beheersen. Dit wordt bereikt door eerst een gefiltreerde stamcelsuspensie en een natriumalginaatoplossing te mengen. Het mengsel wordt vervolgens overgebracht naar een spuit, waarna een coaxiale spuitmond op de spuit wordt gemonteerd voordat deze op een spuitpomp wordt geplaatst. Vervolgens worden de druppels bereid door de celsuspensie uit te stoten met een co-flow van stikstofgas, gevolgd door opvang in een calciumchloride-oplossing.De capsules worden vervolgens behandeld met poly-L-lysine om celverlies te voorkomen en met EDTA om de binnenste capsules te fluidiseren alvorens de ingekapselde cellen te kweken onder roterende schudcondities. Ten slotte worden de cellen uit de capsules verzameld middels EDTA en fysieke vernietiging van het membraan. Uiteindelijk voorkomt alginaat-inkapseling van pluripotente stamcellen dat de cellen overmatig aggregeren en beperkt het schuifspanningsniveau dat de cellen ervaren in suspensiecultuur.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het biologische en biomedische veld, zoals de grootschalige expansie van celtransplantatie en onderzoek naar de stamcelniche. Begin de celinkapseling door de cellen te verzamelen zoals beschreven in het tekstprotocol na centrifugatie bij 160 ×g gedurende drie minuten. Was het pellet van geïnduceerde pluripotente stamcellen of IPS-cellen door te resuspenderen in HEPES-gebufferde zoutoplossing en centrifugeer dit driemaal na resuspensie van de cellen in HEPES-gebufferde zoutoplossing.Filter de cel-suspensie door een 40 micron celzeef om grote aggregaten te verwijderen, die anders de nozzle zouden kunnen verstoppen. Meng vervolgens twee milliliters van de gefilterde cel-suspensie met drie milliliters van een 5% natriumalginaatoplossing. Om een cel-suspensie van vijf milliliter in 3% natriumalginaat te verkrijgen, is de celdichtheid DIR meer dan 1 miljoen cellen per milliliter.Nadat de celsuspensie in een spuit van vijf milliliter is verzameld, wordt er een coaxiale spuitmond op de spuit gemonteerd. Plaats deze op een spuitpomp, laat stikstofgas door de buitenste naald van de coaxiale spuitmond stromen en drijf de celsuspensie door de binnenste spuitmond. Verzamel de druppels in 250 milliliter 0,5% calciumchlorideoplossing en wacht 10 tot 20 minuten voor gelering onder stirring bij 60 tot 90 RPM. Na het wassen met HEPES-gebufferde zoutoplossing worden de verzamelde capsules gebruikt als naakte capsules; om de capsules te behandelen, worden de calciumalginaatcapsules geïncubeerd in 0,05% gewicht per volume.Poly-L-lysine-oplossing gedurende vijf minuten bij 37 °C en 5% koolstofdioxide onder schudden. Nadat de capsules in een buis zijn verzameld en gewassen met HEPES-gebufferde zoutoplossing, worden ze geïncubeerd in DMEM met 10% FBS. Om de elektrische lading op hun oppervlak te neutraliseren, worden de resulterende capsules als gecoate capsules gebruikt om holle capsules te genereren.Incubeer de capsules gedurende vijf minuten in HEPES-gebufferde zoutoplossing die 10 millimolair EDTA bevat. De met EDTA behandelde capsules worden gebruikt als holle capsules. Incubeer de ingekapselde cellen 10 dagen lang bij 75 RPM met schudden bij 37 °C en 5% koolstofdioxide; verzamel vervolgens de capsules en incubeer deze 10 minuten lang in 10 millimolair EDTA bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.Verzamel de cellen uit de alginaatcapsules zonder poly-L-lysinebehandeling door centrifugatie bij 1000 ×g gedurende drie minuten. Indien de alginaatcapsules zijn behandeld met poly-L-lysine, verbreek dan het alginaat-poly-L-lysine-membraan door ongeveer 10 keer op en neer te pipetteren met een naald die aan een spuit is bevestigd. De diameter van de naald moet kleiner zijn dan de grootte van de capsule; in dit experiment worden naalden van 25 gauge gebruikt.Na centrifugatie bij 1000 tot 5.000 ×g gedurende vijf minuten wordt het celpellet strikt verzameld uit de gebroken alginaat-poly-L-lysine-membranen. Indien mRNA-monsters uit cellen worden verzameld, dient men er rekening mee te houden dat resterende alginaat-poly-L-lysine-membranen de mRNA-purificatie kunnen belemmeren, zoals gevisualiseerd met een hogesnelheidscamera. De uitgestoten alginaatoplossing vormt direct na uitstoting een bolvorm. Indien de suspensie wordt uitgestoten met een stikstofstroomsnelheid van minder dan één liter per minuut, is de grootte van de druppels uniform.Wanneer de stikstofstroom echter hoger is dan één liter per minuut, valt de druppel uiteen en wordt de grootte van de druppels heterogeen. Hierdoor is het moeilijk om met deze methode druppels kleiner dan 500 microns te bereiden. Tijdens het geleringsproces vormen natriumalginaatdruppels sferisch gevormde calciumalginaatkapsels in een calciumchlorideoplossing.Indien de concentratie natriumalginaat echter hoog genoeg is, veroorzaakt een lage concentratie natriumalginaat niet-bolvormige en onregelmatige vormen van de capsules, wat problematisch is in het coderingsproces. Zelfs als de natriumalginaatconcentratie onvoldoende is, kunnen bolvormige capsules worden gevormd door de calciumconcentratie te verhogen. Echter is ongeveer 50 millimol calciumchloride geschikt voor inkapseling, omdat een te hoge concentratie calciumchloride de cellulaire groei en levensvatbaarheid vermindert.Ingekapselde cellen kunnen groeien in de capsules, maar cellulaire lekkage kan optreden in capsules zonder de alginaat-poly-L-lysine-coating. In het geval van muis-IPS-cellen vormen de cellen schijfvormige aggregaten in elke calciumalginaatcapsule, terwijl de cellen in elke holle capsule samenklonteren en enkelvoudige sferische aggregaten vormen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen kunt inkapselen en kweken met controle over de grootte.Waterstofvastlegging zonder speciaal equipment en zonder organisch absorptiemiddel.

alginate-encapsulation-pluripotent-stem-cells-using-co-axial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

We hebben geoptimaliseerd een micro-inkapseling techniek als een effectief 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van embryonale stamcellen endoderm en dopaminerge (DA) neuronen. Het biedt ook een kans voor immuun-isolatie van cellen van de gastheer tijdens de transplantatie. Dit platform kan worden aangepast voor andere celtypen.

Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

De combinatie van monodisperse druppel generatie met traagheid ordening van cellen en deeltjes, beschrijven we een methode om een ​​gewenst aantal cellen of deeltjes in te kapselen in een enkele druppel op kHz tarieven. We laten zien efficiëntie twee maal groter dan die van niet-geordende inkapseling voor enkel-en dubbel-deeltje druppels.

High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie

Hier presenteren we een protocol voor het inkapselen van katabolische cellen, die lipiden consumeren voor warmteproductie in intra-abdominaal vetweefsel en de energiedissipatie bij obese muizen verhogen.

Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

Deze video en manuscript beschrijven een emulsie gebaseerde methode om zoogdiercellen in 0,5% tot 10% alginaatkralen te inkapselen die in grote batches kunnen worden geproduceerd onder gebruikmaking van een eenvoudig geroerd vat. De ingekapselde cellen kunnen in vitro worden gekweekt of getransplanteerd voor toepassingen op het gebied van cellotherapie.

Zoogdiercelcapsulatie in Alginaatkralen Met Een Eenvoudig Verrijkt Vaartuig

Gepresenteerd hier is een eenvoudig te gebruiken, Core/shell, driedimensionale bioprinten set-up voor één stap fabricage van holle steigers, geschikt voor weefsel engineering van vasculaire en andere buisvormige structuren.

Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Dit artikel beschrijft de inkapseling van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) met behulp van een co-axiale stroomfocusapparaat. We tonen aan dat deze microfluïdische inkapselingstechnologie een efficiënte vorming van hPSC-sferoïden mogelijk maakt.

Microfluïdische fabricage van core-shell microcapsules met menselijke pluripotente stamcelsferoïden

Het huidige protocol beschrijft een techniek om op grote schaal en kosteneffectief weefselsferoïden te produceren met behulp van een 3D-geprint stempelachtig apparaat.

Genereren van weefselsferoïden via een 3D-geprint stempelachtig apparaat

Dit werk beschrijft een protocol voor de vrije vorm ingebed 3D-printen van neurale stamcellen in zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrixcomposieten. Het protocol maakt het mogelijk om met hoge getrouwheid patronen te maken van onderling verbonden menselijke neurale weefselconstructies.

Microgel-extracellulaire matrixcomposietondersteuning voor het ingebed 3D-printen van menselijke neurale constructies

Leer pluripotente stamcellen inkapselen in alginathydrogel met een co-axiale nozzle. Deze methode minimaliseert celaggregatie en afschuifspanning tijdens suspensiecultuur voor massaproductie en onderzoek naar stamcelniches.

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Meer video's verkennen