Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Het algemene doel van deze procedure is het meten van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie als reactie op farmacologische middelen. Schat de basale calciumspiegels in en beoordeel de individuele kanaalactiviteit in de podocyten als onderdeel van de volledige, vers geïsoleerde glomerulus. Dit wordt bereikt door eerst het bloed uit ratnieren te verwijderen via spoeling via de abdominale aorta.

Vervolgens worden de nieren geoogst en wordt de nierschors geïsoleerd en fijngehakt met een scheermesje. In de derde stap worden de corticale glomeruli geïsoleerd door middel van differentiële centrifugatie. Daarna kunnen de geïsoleerde, gedecappiteerde glomeruli worden onderworpen aan elektrofysiologische experimenten of worden geladen met fluorescente kleurstoffen voor confocale calciumconcentratiemetingen.

Uiteindelijk stellen deze procedures onderzoekers in staat om acute veranderingen in de intracellulaire calciumhuishouding als reactie op de toediening van diverse reagentia op te lossen, en om de calciumgeleiding op het niveau van enkelvoudige ionkanalen te beoordelen en te manipuleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het ons in staat stelt om podocyten te bestuderen als onderdeel van de gehele geïsoleerde glomerulus. Onze preparatie behoudt het functionele potentieel van de podocyten.

Ze blijven gehecht aan de capillairen en dragen bij aan de homeostase in de omgeving die feitelijk de belangrijkste delen van het filtratieapparaat van de glomeruli kan behouden. De implicaties van deze techniek breiden onze farmacologische screening uit. In normale en pathologische toestanden vervult het mechanisme van calciumhuishouding door de podocyten een essentiële regulerende rol bij de ontwikkeling en preventie van renale complicaties bij ziekten zoals diabetische nefropathie, focale segmentale glomerulosclerose of hypertensie. Het is van groot belang om de responsiviteit van de calciuminstroom in deze cellen op geneesmiddelen waar te nemen, die eenvoudig gescreend kunnen worden.

In deze voorbereiding zal VLA Hunka demonstreren hoe de nier moet worden gespoeld voor de volgende procedures. Ik zal de isolatie van glomeruli en V-clamp elektrofysiologie laten zien, en Dr. GaN zal u begeleiden bij confocale calcium-imaging. Om deze procedure te starten, plaatst u een geanestheseerde rat op de temperatuurgecontroleerde operatietafel. Maak onder de microscoop een midline incisie in de buik om de vena cava en de aorta bloot te leggen.

Plaats vervolgens de ligatuur rond de arteria coeliaca, de arteria mesenterica superior en de abdominale aorta daarboven. Disseceer de abdominale aorta onder de arteriae renales stomp. Plaats daarna twee ligaturen eromheen, maar knoop deze nog niet vast.

Klem de aorta boven de ligaturen en knoop de onderste draad vast. Katheteriseer daarna de aorta met een polyethyleenbuisje dat is verbonden met een spuitpomp gevuld met PBS onder de klem en fixeer de katheter met een tweede ligatuur. Verwijder vervolgens de klem en ligeer deze.

Meet de enterische en coeliacale arteriën. Infuseer de aorta gedurende drie minuten met voorkoelde PBS met een snelheid van zes milliliter per minuut. Maak tegelijkertijd een incisie in de vena cava nabij de niervenen om de druk te verlichten.

Stop na drie minuten de perfusie en exciseer en inkapselen de nieren. Plaats deze in PBS-oplossing op ijs. Bereid nu 30 milliliter verse 5% BSA in RPMI 1640-medium.

Isoleer met een scheermesje en een schaar de cortex van beide nieren en vermalen deze vervolgens tot een homogeen mengsel. Duw het fijngehakte weefsel daarna door een roestvrijstalen zeef van 100 mesh die vooraf is geweekt in een 5%P-S-A-R-P-M-I oplossing. Verzamel het filtraat en laat dit door een zeef van 140 mesh passeren.

Filter vervolgens de verzamelde doorstroom van de 140 mesh zeef met behulp van een vooraf geweekte 200 mesh zeef. Gooi het filtraat weg en was de bovenste zeef met 10 tot 15 milliliters van de bereide B-S-A-R-P-M-I-oplossing en verzamel de glomeruli van de bovenkant van de zeef. Plaats vervolgens de B-S-A-R-P-M-I-oplossing die de G Glomeruli bevat in een 15 milliliter centrifugebuis en laat de glomeruli tot 20 minuten bezinken op de bodem van de buis.

In deze procedure worden dekglasplaatjes van vijf bij vijf millimeter gecoat met polylysine met een molecuulgewicht van 70.000 tot 150.000 en op een warmteplaat gedroogd. Verwarm vervolgens de experimentele oplossingen tot kamertemperatuur en vul de patchclampkamer en de pipet. Meng de oplossing die de glomeruli bevat voorzichtig. Breng daarna ongeveer 50 µL hiervan aan op elk met polylysine gecoat dekglasplaatje.

Verplaats daarna de glazen chips met glomeruli naar de patchclampkamer. Deze is vooraf gevuld met de Beth-oplossing. Perfuseer de kamer gedurende één minuut met een snelheid van 3 mL/min om alle niet-gehechte glomeruli te verwijderen voordat de conventionele patchclamp-registratie in cell-attached modus wordt uitgevoerd.

Plaats nu 500 µL van de glomeruli-fractie in elke 0,5 mL conische buis en voeg de calciumkleurstoffen pure red AM en fluo-4 AM toe. Plaats de buizen vervolgens voor maximaal één uur bij kamertemperatuur op een rotatorschudder. Bereid daarna de glazen dekglasjes voor met polylysine en laat deze drogen op de warmteplaat bij 70 °C. Zodra de belading met calciumkleurstoffen is voltooid, brengt u 100 µL van de glomeruli-bevattende oplossing aan op de met polylysine gecoate dekglasjes en laat u deze ongeveer vijf minuten hechten aan het oppervlak.

Monteer vervolgens de dekglasjes waaraan de glomeruli zijn gehecht in een beeldkamer en perfundeer deze met badoplossing met een snelheid van 3 mL per minuut om de niet-gehechte glomeruli en resterende kleurstoffen te verwijderen. Stel daarna de confocale laser-scanning microscoop in op een excitatiegolflengte van 488 nm. Stel vervolgens de beeldvormingssoftware in op de gewenste frequentie en resolutie.

Zoek vervolgens de glomeruli op in helderveldmicroscopie. Schakel daarna de detectie van het fluorescentiesignaal in. Selecteer vervolgens een gewenst brandvlak en controleer de fluorescentie-intensiteit op de flu oh four- en firo red-kanalen.

Zorg ervoor dat de glomerulus duidelijk zichtbaar is in brightfield. Registreer vervolgens de veranderingen in fluorescentie-intensiteit voor de flu oh four- en furor red-signalen. Om de beeldsequentie te importeren, splitst u de kanalen en gebruikt u de hyper stack gray scale-modus.

Open in de Image J-software een ROI-manager-venster via het pad Analyze tools, ROI Manager. Selecteer een of meer regio's van belang met behulp van een ovaal selectie-instrument en de functie add T in de ROI-manager. Selecteer vervolgens het gebied in de achtergrond en sla de geselecteerde ROI's op.

Vink vervolgens het vakje 'one row per slice' aan in het dialoogvenster en klik op 'ok' in de menuopties resultaten. Stel de metingen in. Selecteer 'mean gray value' en bereken de pixelintensiteitswaarden voor elke ROI, welke in afzonderlijke kolommen in het resultatenvenster worden weergegeven.

Kopieer vervolgens voor elke ROI de gemeten ROI-intensiteitswaarden voor elk kanaal naar de gewenste data-analyse software, en trek de achtergrondintensiteitswaarden af van elk datapunt voor elk tijdstip. Bereken daarna de ratio van de intensiteiten van de flu oh four- en URA red-kanalen en zet de veranderingen in de calciumtransiënten per tijdstip uit voor elke ROI. Deze afbeelding toont de patchclamp-pipet bevestigd aan het cellichaam op het oppervlak van de glomerulus van de rat.

Tijdens een elektrofysiologische registratie is in de rechterbenedenhoek van de afbeelding een deel van een ingekapselde glomerulus te zien. Hier is een representatief stroomspoor van de activiteit van TRP-achtige kanalen van een cell-attached patch die op de podocyt is aangebracht om de intracellulaire calciumconcentratie te meten. Glomeruli zijn geladen met fluo-4 AM om intracellulair calcium te labelen.

Deze video illustreert de effecten van CIN en mangaanchloride op de calciuminstroom in de glomeruli. Deze grafiek kwantificeert veranderingen in de flu oh vier-signaalintensiteit gemeten bij een enkele podocyt als reactie op CIN en mangaanchloride. Zoals verwacht produceert CIN het maximum van de fluorescentie en dooft mangaanchloride de kleurstof, wat resulteert in de laagste fluorescentie-intensiteit.

Toepassing van deze geneesmiddelen stelt de onderzoeker in staat om later de exacte calciumconcentratie in de cel te bepalen. Deze video demonstreert het effect van 10 micromole a TP op de calciumconcentratie in de glomeruli. Let op de toename van de groene flu O four-fluorescentie en de afname van de rode fu red-fluorescentie, wat duidt op een toename van de intracellulaire calciumconcentratie.

Deze techniek biedt een unieke mogelijkheid om veranderingen in de calciuminstroom op het niveau van individuele ionkanalen en cellen te monitoren na farmacologische behandelingen of andere manipulaties. Deze aanpak vormt daarmee een zeer krachtig instrument, gezien de beschikbaarheid van meerdere genetisch gemodificeerde knaagdiermodellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe calciummetingen worden uitgevoerd in de podocyten, evenals de elektrofysiologische patch-clamp experimenten die zowel in combinatie als afzonderlijk kunnen worden gebruikt.

Deze technieken bieden een diepgaand en mechanistisch inzicht in de regulatie van de calciumhuishouding in podocyten onder normale en pathologische omstandigheden.