Name: Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer calcium-imaging en patch-clamp elektrofysiologie in podocyten van vers geïsoleerde glomeruli. Deze methode meet intracellulaire calciumconcentraties en ionkanaalactiviteit in real-time.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Gregory Blass is erkend voor kritische revisie van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie ​​HL108880 en American Diabetes Association verlenen 1-15-BS-172 (AS), en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).

Animal gebruik en welzijn moeten zich houden aan de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren volgende protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) beoordeeld en goedgekeurd. 1. Nier Flush <ol><li> Gebruik 8-12 weken oude mannelijke ratten (beoogd is een stam Sprague Dawley, maar andere stammen van verschillende leeftijd en geslacht kunnen worden gebruikt met geschikte wijzigingen). </li><li> Verdoven het dier volgens de procedure toegestane IACUC protocol; monitoren diepte van de anesthesie en inspecteer het dier. De gedetailleerde beschrijving van de ingreep wordt uitgevoerd in 1,3-1,8 ligt in Ilatovskaya et al 7. </li><li> Na een goede verdoving, plaats het dier op een temperatuur-gecontroleerde chirurgische tafel, maak een middellijn incisie van de buik (tot 3 centimeter in lengte), en ontdek de vena cava en de aorta. </li><li> Plaats ligatuur rond de coeliakie en superieure mesenteriale slagaders en de buikaorta boven die; niet ligeren. </li><li> Blunt ontleden de abdominale aorta onder de nierslagaders en plaats twee ligaturen rond het, maar niet ligeren, vervolgens klem de aorta boven de ligaturen en bind de onderste draad. </li><li> Katheteriseren de aorta met een polyethyleen PE50 buis (bevestigd aan een injectiespuit pomp gevuld met PBS) onder de klem en bevestig de katheter met de tweede ligatuur; Verwijder de klem, zet de pomp, en ligeren van de aorta en mesenterische met coeliakie slagaders. Maak snel incisie in nierader om de druk te verlichten. </li><li> Giet de aorta met de vooraf gekoelde PBS gedurende 2 of 3 minuten bij een snelheid van 6 ml / min. </li><li> Stop perfusie, accijnzen en decapsulate 7 de nieren, en leg ze op ijs in de PBS-oplossing. Euthanaseren van de dieren volgens het protocol door IACUC goedgekeurd. </li></ol> 2. Isolatie van de Rat glomeruli <ol><li> Bereid 30 ml verse oplossing van 5% BSA in RPMI 1640. </li><li> Met behulp van een scheermesje en schaar,isoleren van de cortex van beide nieren, en vervolgens gehakt tot een homogene massa. Deze procedure is eerder 7 beschreven. </li><li> Duw het weefsel fijngehakt in de vorige stap door een 100 mesh roestvrijstalen zeef (vooraf geweekt in 5% BSA / RPMI-oplossing) met een spatel. Verzamel de doorstroom en door zwaartekracht kan de doorstroom door een 140 mesh zeef. </li><li> Filtreer de doorstroom vanuit het 140 mesh zeef met een geweekte 200 mesh zeef, het filtraat weg en spoel de bovenkant van de zeef met 10-15 ml van de geprepareerde BSA / RPMI oplossing voor de glomeruli die sediment te verzamelen de zeef. </li><li> Zet de BSA / RPMI bevattende glomeruli op ijs in een 15 ml buisje en laat de glomeruli sediment op de bodem van de buis gedurende maximaal 20 minuten. De glomeruli concentreren op de bodem van de buis duidelijk zichtbaar. Verwijder de overtollige oplossing, laat ongeveer 2 ml in de buis. </li></ol> 3. Single-channel Patch-clamp Elelektrofysiologie <ol><li> Bereid 5 x 5 mm dekglas chips door het bekleden ze met MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-lysine, en laten drogen. Gebruik ongeveer 30 ul van 0,01% steriel gefiltreerd oplossing in water per couvert glas. </li><li> Warmen de experimentele oplossingen voor RT en vul de patch-clamp kamer en pipet. Voor de bewaking TRPC kanalen, gebruik dan een bad oplossing, in mm: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glucose, pH 7,4; pipet: 126 NaCl, 1,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glucose; pH 7,4. <ol><li> Remmers Naar de pipet oplossing om de activiteit van endogene kanalen, die niet relevant voor de studie (aanbevolen zijn blok zijn: 100 uM nifluminezuur of DIDS (Ca 2 + -geactiveerde Cl blok - kanalen), 10 mM TEA (het inhiberen grote-conductance Ca 2 + - afhankelijke K + kanaal), 10 nM iberiotoxin (de Ca 2+ -geactiveerde K + kanalen te blokkeren), 10 uM nicardipine (voor N-type Ca blokkeren2+ kanalen)) direct voor de patch-clamp experiment. </li></ol></li><li> Meng de glomeruli bevattende oplossing en vervolgens ongeveer 50 ui te passen op de poly-ʟ-lysine beklede dekglaasjes chips. Laat de glomeruli worden toegevoegd van ongeveer 5 min. </li><li> Beweeg de glazen chips met glomeruli om de patch-clamp kamer pre-gevuld met het bad oplossing; perfuseren de kamer met een snelheid van 3 ml / min gedurende 1 minuut om het verwijderen van de losse glomeruli waarborgen. </li><li> Voer een conventionele patch-clamp experiment in een cel-bevestigd-modus 7. Met een glazen pipet (7-10 MQ pipette resistentie) een hoge weerstand afdichting tussen een pipet en een podocyte membraan door toepassing van zachte zuigkracht (een pipet bevestigd aan een podocyte op het oppervlak van de geïsoleerde glomerulus wordt getoond in figuur 2, op links). </li><li> Voor de cel bevestigd metingen, low-pass de stroming bij 300 Hz met een acht-polige Bessel-filter. </li><li> Use geïsoleerd glomeruli in patch-clamp experimenten voor maximaal 4 - 6 uur. Houd de voorraad glomeruli fractie op ijs. </li></ol> 4. Ratiometrische confocale Fluorescentie metingen van de intracellulaire calciumconcentratie in de podocytes <ol><li> Plaats 500 pi van de glomeruli fractie (beschreven in 2.5) in 0,5 ml conische buis en voeg calcium kleurstoffen Fura Rood, AM en Fluo-4, AM. Gebruik 2 mM en 1 mM voorraad concentratie van Fura rood, AM en Fluo-4, AM, respectievelijk (opslag bij -20 ° C, opgelost in DMSO) en gebruik 2,5 pi van elke kleurstof een 500 pl glomeruli fractie. Onmiddellijk na toevoeging van de kleurstoffen omvatten de buis met aluminiumfolie. </li><li> Plaats de buisjes op een roterende schudder gedurende ten minste 20 min tot 1 uur bij KT. Opmerking: Farmacologische middelen kunnen in deze stap worden toegevoegd. </li><li> Bereid dekglaasjes, bedek ze met poly-ʟ-lysine en laat het drogen met behulp van verhitte plaat set tot 70 ° C. </li><li> Zodra het laden van calcium kleurstoffen complete Breng 100 pi van de glomeruli bevattende oplossing van het poly-ʟ-lysine beklede dekglaasjes en laat ze zich aan de oppervlakte gedurende 5 min. Monteer de glomeruli bevestigd dekglaasjes in een imaging kamer en perfuseren met het bad-oplossing (bevattende (in mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) met een snelheid van 3 ml / min te verwijderen de losse glomeruli en de resterende kleurstoffen. </li><li> Stel de confocale laserscanning microscoop een 488 nm excitatie golflengte en emissiefilters (525/25 en 650/25 nm voor Fluo-4 en Fura rood, respectievelijk). Stel de imaging software op een gewenste frequentie en resolutie. </li><li> Vind de glomeruli in helderveld en zet vervolgens de detectie van de fluorescentie-signaal. De intensiteit van de laser voor elke kleurstof verzadiging van het signaal te voorkomen. Kies het brandvlak met podocytes die direct op de ruit bevestigd. Dit minimaliseert het effect wordt veroorzaakt door samentrekking van een glomerulus in reactie op geneesmiddelentoepassing. Double-check dat de glomerulus van keuze goed is bevestigd aan het glas; </li><li> Start beeldvorming van de focal plane keuze (neem 512 x 512 beelden met de op 4 sec frequentie snel Ca 2+ voorbijgaande veranderingen te visualiseren. Gebruik een 60X / NA 1.4 of soortgelijke objectief hoge resolutie afbeelding voor), drugs van belang toe te passen, en noteer de respons. <ol><li> Selecteer de gewenste focal plane (zo dicht mogelijk bij het oppervlak van het glas mogelijk te beeldvorming van podocytes garanderen op het oppervlak van de glomerulus). Controleer de intensiteit van de fluorescentie van de Fluo4 en FuraRed kanalen, en zorg ervoor dat de glomerulus duidelijk is te zien in helderveld. </li><li> Start imaging. Voor het aanbrengen van enige drugs, opnemen ten minste 1 min van de baseline fluorescentie om ervoor te zorgen dat het signaal stabiel is (er zijn geen plotselinge pieken of vervagen van het signaal). </li><li> Breng de gewenste geneesmiddelen met behulp van een micropipet; wees voorzichtig en zorgen voor de drug was in staat om goed te verspreiden en bereiken de glomerUlus. Meng het bad oplossing voorzichtig indien nodig, het toezicht op de geselecteerde focal plane en controleren dat het niet uit te gaan van de focus als gevolg van de drug toepassing. </li><li> Noteer de veranderingen in fluorescentie-intensiteit voor Fluo4 en FuraRed signalen. Zorg ervoor dat de opname is lang genoeg, door te wachten tot het signaal het plateau niveau bereikt of een piek bereikt en keert vervolgens terug naar de uitgangswaarde. Voer oplossing wijziging of aanvulling van enige andere medicijnen als dat nodig is. </li><li> Stop de opname en sla het bestand in het eigen formaat van de software. </li></ol></li></ol> 5. Image Analysis voor het Calcium Metingen <ol><li> Voer beeldanalyse met de ImageJ geopende software uitgerust met de ND Utility plugin die het mogelijk maakt het importeren van afbeeldingen in de moedertaal ND2 formaat. </li><li> Importeer de beeldsequentie; Zorg ervoor om de kanalen te splitsen en gebruik een HyperStack grijstinten-modus. </li><li> Volg de Analyze → Extra → ROI manager pad in de ImageJ software om open een ROI manager venster. Selecteer verschillende regio&#39;s van belang (podocytes) met behulp van een ovale selectie-instrument en de &quot;toevoegen (t)&quot; functie in de ROI Manager. Zoals de laatste ROI, selecteer het gebied op de achtergrond; sla de geselecteerde ROI (Meer → Opslaan). </li><li> Markeer het venster met de gekozen voor analyses kanaal. Gebruik de Meer → Multi Measure functie in de ROI Manager, markeer de &quot;één rij per slice&quot; box aan de dialoog die naar buiten komt, en klik op OK. De resultaten zullen in het formaat dat kan worden ingesteld in het venster Resultaten worden getoond: het aangaan van de menuoptie Resultaten → Set Metingen, selecteer &quot;Mean grijswaarde&quot; en bereken de pixel intensiteit waarden voor elk ROI, die zal worden weergegeven in de Resultaten venster in aparte kolommen voor elke ROI. </li><li> Kopieer het ROI gemeten intensiteitswaarden voor elk kanaal (Fluo-4 en Fura rood) in voorkeur software voor gegevensanalyse; subtract achtergrond intensiteitswaarden van elk DATeen punt. </li><li> Voor elk tijdstip berekent de verhouding van intensiteiten van de Fluo-4 tot Fura Red kanalen. Plot scatter / line point-time wijzigingen van Ca 2+ transient voor elke ROI. Bereken Mean / SE waarden voor geselecteerde glomeruli. Opmerking: Time kolom moet worden ingesteld op basis van imaging frequentie geselecteerd op 4,5. </li></ol> 6. Intracellulaire calciumconcentratie Berekeningen met Fluo-4 fluorescentiesignaal <ol><li> Neem een ​​monster van de glomeruli en het uitvoeren van de experimentele protocol tot stap 4.7. Na registratie van de achtergrondfluorescentie voeg Ionomycin (eindconcentratie in het bad kamer moet 10 urn) aan de badoplossing en opnemen fluorescentie-intensiteit verhogen. Zodra de intensiteit bereikt zijn maximum en het verval begint, voeg MnCl 2 (eindconcentratie moet 5 mM) aan de fluorescentie 8 doven. </li><li> Analyseer de verkregen data 6.1. Kopieer de Fluo-4 signaal ROI intensiteit waarden verkregen volgenshet op 5.1 beschreven protocol - 5.5 door voorkeursuitvoeringsvorm analysesoftware. </li><li> Bereken intracellulaire calciumconcentratie (in nM) in podocyte overeenkomt met het ROI met een formule: <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> waarin Kd een vooraf bepaalde dissociatieconstante voor Fluo-4 (345 nM), F is de intensiteit van het tijdstip dat u berekent de calcium concentratie (baseline) en F min en Fmax de intensiteitswaarden van het punt van de maximale belasting calcium (na ionomycine toepassing) en na doven van de fluorescentie (met MnCl 2) respectievelijk (zie figuur 3). </li></ol>

<ol><li>Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+nephrotic+syndrome%3A+connecting+molecular+genetics+to+podocyte+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).</li>
<li>Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+glomerular+barrier+and+mechanisms+of+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria.</a> Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).</li>
<li>Patrakka, J., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+podocytes+in+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of podocytes in proteinuria.</a> Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+albumin+reflection+coefficient+with+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).</li>
<li>Gloy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+depolarizes+podocytes+in+the+intact+glomerulus+of+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat.</a> J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).</li>
<li>Nitschke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+the+intracellular+calcium+activity+in+podocytes+of+the+intact+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus.</a> Kidney Int. 57, 41-49 (2000).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+analysis+of+TRPC+channels+in+the+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+heavy+metal+ions+perturb+fura-2+measurements+of+basal+and+hormone-evoked+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals.</a> Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).</li>
<li>Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mineralocorticoid+and+angiotensin+II+receptor+blockers+on+proteinuria+and+glomerular+podocyte+protein+expression+in+a+model+of+minimal+change+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+%28Carlton%29%22%5BJournal%5D)">Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome.</a> Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Abramowitz, J., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+canonical+transient+receptor+potential+channels%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels).</a> FASEB J. 23, 297-328 (2009).</li>
<li>Heeringa, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+TRPC6+mutation+that+causes+childhood+FSGS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS.</a> PLoS ONE. 4, e7771(2009).</li>
<li>Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+role+of+TRPC6+in+vitamin+D+ameliorating+podocyte+injury+in+STZ-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats.</a> Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).</li>
<li>Bohrer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+puromycin-induced+defects+in+the+transglomerular+passage+of+water+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules.</a> J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).</li>
<li>Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+charge+and+size+selectivity+barrier+of+the+glomerular+filter+in+aminonucleoside+nephrosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats.</a> Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).</li>
<li>Schiessl, I. M., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+AT2+receptor+activation+attenuates+AT1+receptor-induced+increases+in+the+glomerular+filtration+of+albumin%3A+a+multiphoton+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+acutely+inhibit+TRPC+channels+in+freshly+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).</li>
<li>Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+wave+of+tubuloglomerular+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium wave of tubuloglomerular feedback.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).</li>
<li>Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+directly+stimulates+ENaC+activity+in+the+cortical+collecting+duct+via+AT%281%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+the+P2+receptors+profile+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li>
<li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li>
<li>Roshanravan, H., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+acting+through+P2Y+receptors+causes+activation+of+podocyte+TRPC6+channels%3A+role+of+podocin+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).</li>
<li>Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+activation+of+TRPC6+channels+in+rat+podocytes+requires+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species.</a> J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven benadering maakt voor de analyse van calciumhuishouding door podocytes van het knaagdier glomeruli. Deze techniek maakt het mogelijk de toepassing van de patch-clamp single channel elektrofysiologie en fluorescentie ratiometrische confocale beeldvorming. Echter, beide werkwijzen afzonderlijk worden gebruikt, als zodanig. De voorgestelde protocol heeft een aantal relatief eenvoudige stappen, waaronder 1) de nieren spoelen; 2) het isoleren van de glomeruli door differentiële zeven; 3) het uitvoeren van ...

Nieren handhaven homeostatische balans voor diverse stoffen en reguleren bloedvolume op een manier die totaal bloeddruk bepaald. Verstoringen in de renale filtratie, reabsorptie of secretie leiden of begeleiden pathologische toestanden, gaande van hyper- of hypotensie tot eind nierziekte die uiteindelijk nodig niertransplantatie. De renale filtereenheid (glomerulus) bestaat uit drie lagen - de capillaire endotheel, basaalmembraan en een eencellige laag van epitheelcellen - podocytes, die een belangrijke rol in de handhaving van het spleetvormige diafragma integriteit en functie 1 zijn. Disfunctie in de permselectief glomerulaire filter veroorzaakt urine verlies van macromoleculen, zoals proteïnurie. Verschillende middelen kunnen de structuur van de podocytes en hun voeten processen die de integriteit van de glomeruli filtratie barrière bepalen beïnvloeden. De podocytes zijn betrokken bij het onderhoud van de Glomeruli filtratie functie. Vastgesteld is dat incorrect calciumhuishouding van de podocyte leidt tot celbeschadiging en speelt een belangrijke rol bij de progressie van verschillende vormen van nefropathie 2,3. Daarom is ontwikkeling van een model waarmee directe meting van intracellulaire calciumconcentratie veranderingen instrumentele voor onderzoek podocyte functie zijn. Geïsoleerde glomeruli werden eerder gebruikt in een groot aantal studies, waaronder het meten van albumine reflectiecoëfficiënt verandert 4 en evaluatie van de integrale cellulaire stromingen in de whole-cell elektrofysiologische patch-clamp metingen 5,6. In dit artikel beschrijven we het protocol dat de onderzoeker mogelijk maakt om intracellulaire calciumconcentratie verandert in reactie op verzoeken van farmacologische middelen te meten, schatten basale niveaus van calcium in de cellen, en beoordeelt afzonderlijke calciumkanalen activiteit. Ratometric calciumconcentratie metingen en patch-clamp electrophysiology werden gebruikt om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in het podocyte en kanaalactiviteit respectievelijk bepalen.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluroniczuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>oplossing</td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Buizenrotator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Duitsland</td></tr><tr><td>Nikon confocale microscoop (omgekeerd)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Laser-excitatie 488 nm. Emissiefilters 500-550 nm en 570-620 nm</td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Hoogvacuümvet</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Siliconenverbinding</td></tr><tr><td>Software</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Registratie-/perfusiekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Gegevensacquisitiesysteem</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; Systeem</td></tr><tr><td>Laagdoorlaatfilter</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8-pool Bessel</td></tr><tr><td>Borosilicaatglas capillaires</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet-puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown-type micropipet-puller</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Gemotoriseerde micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microvibratie-isolatietafel</td><td>TMC</td><td></td><td>uitgerust met Faraday-kooi</td></tr><tr><td>Multikanaalventiel-perfusiesysteem</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Registratie-/perfusiekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxine</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Nifluminezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA-chloride</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>zonder antibiotica</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30% albumine-oplossing</td></tr><tr><td>Temperatuurgecontroleerde operatietafel</td><td>MCW core</td><td></td><td>voor knaagdieren</td></tr><tr><td>Stalen zeven:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>mesh 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>zeef voor CD-1</td></tr><tr><td>Binoculaire microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Binoculaire microscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Op spuitenpompen gebaseerd perfusiesysteem</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buisjes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan anesthesie</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Overige basisreagentia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-channel analyse en calcium imaging in de podocytes van de vers geisoleerde glomeruli

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocyten (epitheelcellen van het nierglomerulus) staan erom bekend dat ze de glomerulaire permeabiliteit reguleren en de glomerulaire structuur behouden; een sleutelrol voor deze cellen in de pathogenese van verschillende nieraandoeningen is vastgesteld, aangezien podocytenschade leidt tot proteïnurie en effacetie van de voetprocessen. Eerder werd gemeld dat verschillende endogene agentia een dramatische overbelasting van de intracellulaire Ca2+concentratie in podocyten kunnen veroorzaken, leidend tot albuminurie, en dit gebeurt waarschijnlijk via calciumgeleidende ionenkanalen. Daarom leek het belangrijk om calciumverwerking in de podocyten te bestuderen, zowel onder normale omstandigheden als in verschillende pathologische toestanden. De beschikbare experimentele benaderingen zijn echter enigszins beperkt gebleven tot gekweekte en getransfecteerde cellen. Hoewel ze een goed basismodel vertegenwoordigen voor dergelijke studies, worden ze in essentie uit de oorspronkelijke omgeving van het glomerulus geëxtraheerd. Hier beschrijven we de methodologie om podocyten te bestuderen als onderdeel van het vers geïsoleerde gehele glomerulus. Deze voorbereiding behoudt het functionele potentieel van de podocyten, die nog steeds aan de haarvaten zijn bevestigd; daarom blijven podocyten in de omgeving die de belangrijkste delen van het glomerulaire filtratieapparaat behoudt. Het huidige manuscript gaat dieper in op twee experimentele benaderingen die 1) realtime detectie van veranderingen in calciumconcentratie mogelijk maken met behulp van ratiometrische confocale fluorescentiemicroscopie, en 2) het opnemen van de activiteit van enkele ionenkanalen in de podocyten van de vers geïsoleerde glomeruli. Deze methodologieën benutten de voordelen van de oorspronkelijke omgeving van het glomerulus die onderzoekers in staat stellen acute veranderingen in de intracellulaire calciumverwerking in reactie op toepassingen van verschillende agentia op te lossen, basale calciumconcentraties binnen de cellen te meten (bijvoorbeeld om de ziekteprogressie te evalueren) en calciumgeleiding op het niveau van enkele ionenkanalen te beoordelen en te manipuleren.

Hier geadresseerd we het probleem van het meten van acute veranderingen in het calciumgehalte in het podocytes. Figuur 1 toont een schematische weergave van de experimentele protocol ontworpen om hoge resolutie levende fluorescentie confocale beeldvorming en één ionkanaalactiviteit opnamen verrichten de podocytes van de vers geïsoleerde knaagdieren glomeruli. Kort nadat de rat verdoofd, de nieren moet worden gespoeld met PBS om ze te verwijderen van bloed. Vervolgens worden de nieren uitgesneden en ontk...

Veranderingen in de intracellulaire calciumniveaus in de podocyten zijn een van de belangrijkste middelen om de filtratiefunctie van glomeruli te beheersen. Hier leggen we een high-throughput benadering uit die detectie van real-time calciumverwerking en activiteit van enkele ionkanalen in de podocyten van de vers geïsoleerde glomeruli mogelijk maakt.

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie als reactie op farmacologische middelen. Schat de basale calciumspiegels in en beoordeel de individuele kanaalactiviteit in de podocyten als onderdeel van de volledige, vers geïsoleerde glomerulus. Dit wordt bereikt door eerst het bloed uit ratnieren te verwijderen via spoeling via de abdominale aorta.Vervolgens worden de nieren geoogst en wordt de nierschors geïsoleerd en fijngehakt met een scheermesje. In de derde stap worden de corticale glomeruli geïsoleerd door middel van differentiële centrifugatie. Daarna kunnen de geïsoleerde, gedecappiteerde glomeruli worden onderworpen aan elektrofysiologische experimenten of worden geladen met fluorescente kleurstoffen voor confocale calciumconcentratiemetingen.Uiteindelijk stellen deze procedures onderzoekers in staat om acute veranderingen in de intracellulaire calciumhuishouding als reactie op de toediening van diverse reagentia op te lossen, en om de calciumgeleiding op het niveau van enkelvoudige ionkanalen te beoordelen en te manipuleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het ons in staat stelt om podocyten te bestuderen als onderdeel van de gehele geïsoleerde glomerulus. Onze preparatie behoudt het functionele potentieel van de podocyten.Ze blijven gehecht aan de capillairen en dragen bij aan de homeostase in de omgeving die feitelijk de belangrijkste delen van het filtratieapparaat van de glomeruli kan behouden. De implicaties van deze techniek breiden onze farmacologische screening uit. In normale en pathologische toestanden vervult het mechanisme van calciumhuishouding door de podocyten een essentiële regulerende rol bij de ontwikkeling en preventie van renale complicaties bij ziekten zoals diabetische nefropathie, focale segmentale glomerulosclerose of hypertensie. Het is van groot belang om de responsiviteit van de calciuminstroom in deze cellen op geneesmiddelen waar te nemen, die eenvoudig gescreend kunnen worden.In deze voorbereiding zal VLA Hunka demonstreren hoe de nier moet worden gespoeld voor de volgende procedures. Ik zal de isolatie van glomeruli en V-clamp elektrofysiologie laten zien, en Dr. GaN zal u begeleiden bij confocale calcium-imaging. Om deze procedure te starten, plaatst u een geanestheseerde rat op de temperatuurgecontroleerde operatietafel. Maak onder de microscoop een midline incisie in de buik om de vena cava en de aorta bloot te leggen.Plaats vervolgens de ligatuur rond de arteria coeliaca, de arteria mesenterica superior en de abdominale aorta daarboven. Disseceer de abdominale aorta onder de arteriae renales stomp. Plaats daarna twee ligaturen eromheen, maar knoop deze nog niet vast.Klem de aorta boven de ligaturen en knoop de onderste draad vast. Katheteriseer daarna de aorta met een polyethyleenbuisje dat is verbonden met een spuitpomp gevuld met PBS onder de klem en fixeer de katheter met een tweede ligatuur. Verwijder vervolgens de klem en ligeer deze.Meet de enterische en coeliacale arteriën. Infuseer de aorta gedurende drie minuten met voorkoelde PBS met een snelheid van zes milliliter per minuut. Maak tegelijkertijd een incisie in de vena cava nabij de niervenen om de druk te verlichten.Stop na drie minuten de perfusie en exciseer en inkapselen de nieren. Plaats deze in PBS-oplossing op ijs. Bereid nu 30 milliliter verse 5% BSA in RPMI 1640-medium.Isoleer met een scheermesje en een schaar de cortex van beide nieren en vermalen deze vervolgens tot een homogeen mengsel. Duw het fijngehakte weefsel daarna door een roestvrijstalen zeef van 100 mesh die vooraf is geweekt in een 5%P-S-A-R-P-M-I oplossing. Verzamel het filtraat en laat dit door een zeef van 140 mesh passeren.Filter vervolgens de verzamelde doorstroom van de 140 mesh zeef met behulp van een vooraf geweekte 200 mesh zeef. Gooi het filtraat weg en was de bovenste zeef met 10 tot 15 milliliters van de bereide B-S-A-R-P-M-I-oplossing en verzamel de glomeruli van de bovenkant van de zeef. Plaats vervolgens de B-S-A-R-P-M-I-oplossing die de G Glomeruli bevat in een 15 milliliter centrifugebuis en laat de glomeruli tot 20 minuten bezinken op de bodem van de buis.In deze procedure worden dekglasplaatjes van vijf bij vijf millimeter gecoat met polylysine met een molecuulgewicht van 70.000 tot 150.000 en op een warmteplaat gedroogd. Verwarm vervolgens de experimentele oplossingen tot kamertemperatuur en vul de patchclampkamer en de pipet. Meng de oplossing die de glomeruli bevat voorzichtig. Breng daarna ongeveer 50 µL hiervan aan op elk met polylysine gecoat dekglasplaatje.Verplaats daarna de glazen chips met glomeruli naar de patchclampkamer. Deze is vooraf gevuld met de Beth-oplossing. Perfuseer de kamer gedurende één minuut met een snelheid van 3 mL/min om alle niet-gehechte glomeruli te verwijderen voordat de conventionele patchclamp-registratie in cell-attached modus wordt uitgevoerd.Plaats nu 500 µL van de glomeruli-fractie in elke 0,5 mL conische buis en voeg de calciumkleurstoffen pure red AM en fluo-4 AM toe. Plaats de buizen vervolgens voor maximaal één uur bij kamertemperatuur op een rotatorschudder. Bereid daarna de glazen dekglasjes voor met polylysine en laat deze drogen op de warmteplaat bij 70 °C. Zodra de belading met calciumkleurstoffen is voltooid, brengt u 100 µL van de glomeruli-bevattende oplossing aan op de met polylysine gecoate dekglasjes en laat u deze ongeveer vijf minuten hechten aan het oppervlak.Monteer vervolgens de dekglasjes waaraan de glomeruli zijn gehecht in een beeldkamer en perfundeer deze met badoplossing met een snelheid van 3 mL per minuut om de niet-gehechte glomeruli en resterende kleurstoffen te verwijderen. Stel daarna de confocale laser-scanning microscoop in op een excitatiegolflengte van 488 nm. Stel vervolgens de beeldvormingssoftware in op de gewenste frequentie en resolutie.Zoek vervolgens de glomeruli op in helderveldmicroscopie. Schakel daarna de detectie van het fluorescentiesignaal in. Selecteer vervolgens een gewenst brandvlak en controleer de fluorescentie-intensiteit op de flu oh four- en firo red-kanalen.Zorg ervoor dat de glomerulus duidelijk zichtbaar is in brightfield. Registreer vervolgens de veranderingen in fluorescentie-intensiteit voor de flu oh four- en furor red-signalen. Om de beeldsequentie te importeren, splitst u de kanalen en gebruikt u de hyper stack gray scale-modus.Open in de Image J-software een ROI-manager-venster via het pad Analyze tools, ROI Manager. Selecteer een of meer regio's van belang met behulp van een ovaal selectie-instrument en de functie add T in de ROI-manager. Selecteer vervolgens het gebied in de achtergrond en sla de geselecteerde ROI's op.Vink vervolgens het vakje 'one row per slice' aan in het dialoogvenster en klik op 'ok' in de menuopties resultaten. Stel de metingen in. Selecteer 'mean gray value' en bereken de pixelintensiteitswaarden voor elke ROI, welke in afzonderlijke kolommen in het resultatenvenster worden weergegeven.Kopieer vervolgens voor elke ROI de gemeten ROI-intensiteitswaarden voor elk kanaal naar de gewenste data-analyse software, en trek de achtergrondintensiteitswaarden af van elk datapunt voor elk tijdstip. Bereken daarna de ratio van de intensiteiten van de flu oh four- en URA red-kanalen en zet de veranderingen in de calciumtransiënten per tijdstip uit voor elke ROI. Deze afbeelding toont de patchclamp-pipet bevestigd aan het cellichaam op het oppervlak van de glomerulus van de rat.Tijdens een elektrofysiologische registratie is in de rechterbenedenhoek van de afbeelding een deel van een ingekapselde glomerulus te zien. Hier is een representatief stroomspoor van de activiteit van TRP-achtige kanalen van een cell-attached patch die op de podocyt is aangebracht om de intracellulaire calciumconcentratie te meten. Glomeruli zijn geladen met fluo-4 AM om intracellulair calcium te labelen.Deze video illustreert de effecten van CIN en mangaanchloride op de calciuminstroom in de glomeruli. Deze grafiek kwantificeert veranderingen in de flu oh vier-signaalintensiteit gemeten bij een enkele podocyt als reactie op CIN en mangaanchloride. Zoals verwacht produceert CIN het maximum van de fluorescentie en dooft mangaanchloride de kleurstof, wat resulteert in de laagste fluorescentie-intensiteit.Toepassing van deze geneesmiddelen stelt de onderzoeker in staat om later de exacte calciumconcentratie in de cel te bepalen. Deze video demonstreert het effect van 10 micromole a TP op de calciumconcentratie in de glomeruli. Let op de toename van de groene flu O four-fluorescentie en de afname van de rode fu red-fluorescentie, wat duidt op een toename van de intracellulaire calciumconcentratie.Deze techniek biedt een unieke mogelijkheid om veranderingen in de calciuminstroom op het niveau van individuele ionkanalen en cellen te monitoren na farmacologische behandelingen of andere manipulaties. Deze aanpak vormt daarmee een zeer krachtig instrument, gezien de beschikbaarheid van meerdere genetisch gemodificeerde knaagdiermodellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe calciummetingen worden uitgevoerd in de podocyten, evenals de elektrofysiologische patch-clamp experimenten die zowel in combinatie als afzonderlijk kunnen worden gebruikt.Deze technieken bieden een diepgaand en mechanistisch inzicht in de regulatie van de calciumhuishouding in podocyten onder normale en pathologische omstandigheden.

single-channel-analysis-calcium-imaging-podocytes-freshly-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Calcium is betrokken bij tal van fysiologische en pathofysiologische signaalwegen. Live cell imaging vereist gespecialiseerde apparatuur en kan tijdrovend zijn. Een snelle, eenvoudige werkwijze met een flow cytometer om relatieve veranderingen in cytosolische calcium in hechtende epitheelcellen gebracht suspensie bepalen geoptimaliseerd.

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

Hier presenteren we technieken voor het beeldvormen van lokale IP3-gemedieerde Ca2+-gebeurtenissen met behulp van fluorescentiemicroscopie in intacte zoogdiercellen die zijn geladen met Ca2+-indicatoren, samen met een algoritme dat de identificatie en analyse van deze gebeurtenissen automatiseert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Het doel van dit protocol is om intacte pacemakergebieden van het nierbekken van de muis te isoleren met behulp van vibratoomsecties. Deze secties kunnen vervolgens worden gebruikt voor in situ Ca2+ beeldvorming om Ca2+ transiënte eigenschappen van pacemakercellen en andere interstitiële cellen in vibratoomsegmenten te verduidelijken.

Isoleren en beeldvorming Live, intact pacemakergebieden van het nierbekken van de muis door vibratoomsecties

De gepresenteerde methode maakt visualisatie van fluorescerend gelabelde cellulaire eiwitten met expansiemicroscopie mogelijk, wat leidt tot een resolutie van 70 nm op een conventionele microscoop.

Beeldvorming van Podocytische eiwitten Nephrin, Actine en Podocine met expansiemicroscopie

Celcalciumbeeldvorming is een veelzijdige methodologie om dynamische signalering van individuele cellen te bestuderen, op gemengde populaties in cultuur of zelfs op ontwaakte dieren, gebaseerd op de expressie van calciumdoorlatende kanalen / receptoren die unieke functionele handtekeningen geven.

Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Leer calcium-imaging en patch-clamp elektrofysiologie in podocyten van vers geïsoleerde glomeruli. Deze methode meet intracellulaire calciumconcentraties en ionkanaalactiviteit in real-time.

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Meer video's verkennen