Name: Faag phenomics: Fysiologische Approaches te karakteriseren Novel virale eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer fenomische benaderingen om nieuwe faaggenen te karakteriseren met behulp van MAPs en metabolomics in E. coli. Deze methode koppelt genexpressie aan metabole fenotypes voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas en leden van het Viral Dark Matter consortium voor hun hulp en constructieve input op dit manuscript. Dit onderzoek wordt gefinancierd door de National Science Foundation (DEB-1046413) en is onderdeel van het Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

<ol><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recoding+in+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Recoding%3A+Expansion+of+decoding+rules+enriches+gene+expression%22%5BJournal%5D)">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+sciences+%2F+The+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li>
<li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li>
<li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li>
<li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalendar%2C+R+%22The+bacteriophages%22">The bacteriophages</a>. , Oxford Univeresity Press. (2006).</li>
<li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+letters%22%5BJournal%5D)">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li>
<li>Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li>
<li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Oceanography%22%5BJournal%5D)">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li>
<li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+ecosystems%3A+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741(2003).</li>
<li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+S-PM2%2C+a+%E2%80%9Cphotosynthetic%E2%80%9D+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li>
<li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li>
<li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li>
<li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes%3A+signature+features+and+ecological+interpretations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144(2005).</li>
<li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li>
<li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40%3A+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li>
<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li>
<li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li>
<li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657(2012).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+for+Enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+expression+of+the+P%28BAD%29+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li>
<li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf">http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf</a> (2014).</li>
<li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TagCleaner%3A+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341(2010).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288(2011).</li>
<li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002(2009).</li>
<li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+for+plant+metabolomics%3A+reporting+MSI-compliant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li>
<li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+viruses+exploit+their+host%E2%80%99s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li>
<li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li>
<li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li>
<li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+research%3A+an+international+journal+for+rapid+publication+of+reports+on+genes+and+genomes%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we phenomic benaderingen voor de functionele karakterisering van faaggenen vermeende. Technieken omvatten een ontwikkelde assay geschikt gastheer toezicht anabole metabolisme, de multi-fenotype testplaten (MAP), naast de gevestigde werkwijze van metabolomics, kan meten effecten katabole stofwisseling. Wij aanvullende instrumenten om het grote datasets als gevolg van deze technieken beheerst en hun high throughput verwerking en analyse 24. Tot slot, door middel van de vergelijking van een geannoteerde faag capsideproteïne, faag thioredoxine, twee vermeende faaggenen metabole, en de gemiddelde experimentele reactie stellen wij voor verschillende strategieën voor beide datasets en gen klassen te interpreteren, met de nadruk op de identificatie van fenotypische trends en identificatie van uitschieters. Zoals gezegd, beide benaderingen kwantitatief te meten slechts de helft van ontvangst metabolisme. Om de relatieve werking van de interpretatienieuwe eiwitten in onderzoek, de gegevens van beide methoden is nodig om het bewijs van functie te geven. Hoewel dit niet een focus van onze huidige manuscript, wordt data-uitgangen van elke phenomic methode gebracht door middel van combinatorische analyses die zich richten op clustering technieken zoals willekeurige bos en principale componenten analyse. Bovendien moeten hypothesen gevolg van de gecombineerde analyse vervolgens bevestigd met klassieke genetische werkwijzen. Tot slot, de methoden gepresenteerd worden sterk beïnvloed door bacteriële fysiologie en volgt dus dezelfde normen. Bij het uitvoeren van beide methoden, moeten overwegingen worden gedaan om onafhankelijke, klonale groepen worden geëxperimenteerd met waarborgen; besmetting wordt voorkomen; één variabele wordt getest; en passende controles worden tegelijkertijd liep. Het niet instaan ​​voor dergelijke punten waardoor onzuivere resultaten, vergelijkbaar met fysiologische assay. Multi-fenotype testplaten(MAP) De ontwikkeling van MAP biedt een hoge doorvoer en aanpasbaar assay in vergelijking met technologieën die momenteel beschikbaar zijn (Figuur 5A en tabellen 1,2). De assay maakt gebruik van voorraden, apparatuur en basistechnieken in alle microbiologische laboratoria. De integratie van een computationele pijplijn, PMAnalyzer 24, voor verdere verwerking van gegevens en analyse zorgt voor een snelle data-interpretatie. Bovendien kunnen zowel experimenteel en analytische aspecten van de aanpak gemakkelijk worden afgesteld of afgestemd voor aangepaste doeleinden. Als bijvoorbeeld een groot deel van de gegevens mislukt filteren beschreven in hoofdstuk 4 passen, kan handmatig vinden in de groeicurven om te identificeren. Als het probleem ontstaat als gevolg van strengere filterparameters kunnen aanpassingen aan het script worden. Alternatief, als er problemen geassocieerd met de experimentele werkwijze (bijv verlengde condensatie, onjuist overdracht van bacteriële cells, etc.) zullen aanvullende duplo gemakkelijk worden herhaald. Zoals beschreven in Cuevas et al. 24, de PMAnalyzer is een enkel bash programma geschreven als een wrapper script dat de parsing en analyse scripts als een samenhangend, geautomatiseerde pijplijn uitvoert. Alle scripts zijn vrij toegankelijk vanuit een Git repository bij 25 Door de mediane waarde voor elk tijdstip tussen drievoud data en vervolgens parameterizes de logistische curve om de vertragingstijd te verkrijgen, maximale groeisnelheid, asymptoot, en een nieuwe term, Growth niveau. De mediaanwaarde is in onze studie om het effect van grote uitbijters te verminderen verkozen boven het gemiddelde, maar het script kan gemakkelijk worden aangepast aan het gemiddelde van duplo te berekenen. Door minder variatie (SE) gezien over herhaalde data (Figuur 2A) behielden we het gebruik van de mediaan in de PMAnalyzer voor bevestiging van een logistische curve. Bovendien, de afgesneden voor groei in deze studie (GL ≥ 0,4) was determined door het vergelijken van hoe gegevens gescheiden over Groei Level en maximale groei (Figuur 1A, B). Afhankelijk van de instrumenten en het model dat wordt gebruikt deze term kan variëren, waarbij herdefiniëring van deze afgesneden waarde. Een groot voordeel van onze test is het vermogen te vergelijken fenotypes met één kenmerkende parameter totale microbiële groei, die we definiëren als groeipeil (GL). GL is een harmonisch gemiddelde, en vermindert daardoor de effecten van grote uitschieters. Het gebruik van een harmonisch gemiddelde met verschoven-logistieke gemonteerd waarden geven een overzicht van de groei is gekomen door middel van trial and error. Andere methoden geprobeerd om onderscheid groei opgenomen: tijd waarin specifieke curveparameters (half μ max, μ max en draagvermogen), de determinatiecoëfficiënt (R2), en combinaties van de R 2 vermenigvuldigd met specifieke curve parameters bereikt. Met behulp van een harmonisch gemiddelde met verschovenlogistieke-fit waarden voor de GL ontvangen uit zoveel mogelijk bij de evaluatie groei, waardoor werd de werkwijze van keuze. Een overweging te merken is dat dynamische groeicurve patronen hebben het potentieel verloren bij gebruik van een enkele parameter of aangepaste model. Bijvoorbeeld, de afzonderlijke curve parameters van het logistische curve en GL zijn niet in staat vertegenwoordigen bifasische groei. In enige koolstofbron, dit effect op de groei impliceert bemiddeling van het virale eiwit op ofwel de omzetting van het substraat of verschuiving van substraat gebruik. Bijkomende effecten potentieel verloren als niet het overwegen van meerdere groei parameters omvatten: langdurige vertraging, stelt een grotere last van virale machines of producten; snel versnellen exponentiële fase, suggereert virale eiwitten gekoppeld aan de productie van energie trajecten gastheer; of hogere vorming van biomassa, wat impliceert virale ondersteuning opname en anabolisme gastheer nutriënten (data niet getoond). Zo plotten ontluikende groeicurves ( <strong&gt; Figuur 2A, B) geeft informatie over trends in de tijd dat de GL houdt rekening met de belangrijkste variabelen van het logistische model, verschaffen een kwantitatieve getal aan het succes van een kloon vertegenwoordigen. Worden de verschillende reacties bijgedragen door structurele en metabole genen in de MAP wordt opgemerkt dat de verschillende substraat betrokken klassen de krachtigste bewijs voor eiwitfunctie. Zo zijn metabole eiwitten vaak geassocieerd met het verkrijgen beperken nutriënten die aspecifieke de centrale metabolisme 16,32 gastheer. Voorlopige MAP experimenten blijkt dat klonen vermeende faaggenen metabole hebben een verhoogde vertragingsfase wanneer gegroeid op centraal metabolisme koolstofbronnen (Figuur 2A). Omgekeerd klonen uitvoeren vermeende structurele genen, waarin grote verhoudingen van gastheer energie en dNTP zwembaden vergen, resulteren in een vals positieve reactie op de groei voor central en aminozuurmetabolisme koolstofsubstraten. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de accumulatie van onoplosbare eiwitten die in gastheer filamentatie en / of insluitingslichamen, zoals waargenomen via microscopie (figuur 2A en data niet getoond). Terwijl verdere analyse is nodig om deze voorlopige resultaten te valideren, de kaarten zijn in staat om ophalen van fenotypische reacties die correleren met de functies van specifieke faag gen klassen hypothese. Naast de opheldering van onbekende virale eiwitten, de kaarten zijn een nieuwe bron om de functionele en metabolische diversiteit van een individuele bacterie of door bacteriën te onderzoeken. MAP componenten zijn ontworpen voor eenvoudige wijziging van de groei van verschillende bacteriën te ondersteunen; waaronder marine, auxotrofe en anaërobe bacteriën. Om deze inspanningen gedefinieerde basale pre-kweekmedium vereisen extra of gewijzigde chemische species voor een ander bacterieel genus kunnen worden ondersteund in de MAP vergemakkelijken.Een opmerking in dit gebruik van de kaarten is naar gedefinieerd media te behouden, een verbod op het gebruik van ingrediënten zoals trypton, gistextract en pepton. Metabolomics Het gebied van metabolomics is afhankelijk metabolietdatabases, die geïsoleerd metabolieten geïdentificeerd door massaspectrometrie omvatten. De kern faciliteit hier gekozen heeft één van de grootste metabolomics databases. Interessant is dat meer dan de helft van de metabolieten als gevolg van onze experimenten waren identificeerbaar (~ 65%), terwijl andere nooit eerder opgeslagen in de gastheer Escherichia coli (voorbeelden zijn: Indole 3 33 azijnzuur, salicylzuur 34 en dihydroabiëtinezuur 35). Dit feit kan worden toegeschreven aan zowel een sterke neiging van de gegevensbank richting plantenmetabolieten of de specifieke eiwitten onderzocht. Ongeacht, het resultaat een beperkt aantal bekende metabolieten vindt datarepresentatie en analyse. In de futuur, meerdere metabolomics methoden gebruik van verschillende databases zou zorgen voor een grotere metaboliet dekking. Momenteel bekende en onbekende metabolieten worden gebruikt bij het vergelijken en tegenover elkaar onze nieuwe virale eiwitten. Met deze aanpak, veronderstellen we dat klonen functioneel vergelijkbare eiwitten een verhoogde gelijkenis in hun volledige metabolomic profiel zullen delen. Voorafgaande metabolomics analyse bleek dat terwijl structurele en metabolische genen niet duidelijk van elkaar gescheiden, die genen vertonen soortgelijke effecten op de gastheer wanneer overexpressie correleren (figuur 6). Bijvoorbeeld, de geannoteerde capside-gen clusters samen met het vermeende metabole genen die in deze studie, EDT2440 en EDT2441. Onderzoeken met behulp van een algemeen beschikbare transmembraan topologie en signaalpeptide voorspeller programma toonde bewijs dat beide vermeende metabole genen haven een enkele transmembraandomein. Interessant 5 uit the 9 klonen in de eerste clustergroep (meest linkse gedeelte van het dendrogram) hebben transmembraandomeinen volgens dezelfde topologie programma voorspeld. Verder onderzoek is nodig, maar is het waarschijnlijk dat dit bij de overexpressie van deze klonen metabolieten worden geassocieerd met cellulaire stressrespons gevolg van membraan of structurele lasten. Dit bewijs ondersteunt dat terwijl metabolomics data bezit een verhoogde hoeveelheid ruis, de werkwijze kan benadrukken signalen die algemene gevolgen van genen, zowel binnen als tussen een gen klasse differentiëren. Om te bepalen of de werkwijze kan extraheren uit specifieke informatie genfunctie, metabolieten werden gegroepeerd in specifieke metabole pathways. De hypothese zijn, indien een kloon beïnvloedt metabolieten specifiek voor één traject, dan is de overexpressie gen actief in dat traject. Voorafgaand aan de oprichting van ons metabolomics kwaliteitsborging pijpleiding, voorlopige gegevens blijkt dat meer dan eend ondervertegenwoordigd metabolieten meestal &quot;onbekend&quot;, die weinig informatie over de paden waaraan ze zijn gekoppeld (data niet getoond). Voorbewerkte metabolomics data toont echter dat de meeste metabolietprofielen soortgelijk zijn en slechts een beperkt aantal bekende en onbekende metaboliet abundanties variëren tussen klonen, bijvoorbeeld putrescine en uracil (figuur 6). Om hogere resolutie eiwitfunctie inspanningen leveren worden aan de faaggenen nieuwe experimenten vergelijken met bekende faag genen, die kunnen worden gebruikt in de &quot;gaten&quot; metaboliet gebaseerde functionele karakterisering te vullen. Met deze techniek, de toegewezen functie van bekende virale genen verschaft een referentie voor de functie van onbekende genen. Toch is de beperkende factor metabolomic analyse is de omvang en relevantie van de database. Om te corrigeren voor deze beperkingen, metabolomic databases relatable aan dit onderzoek moeten worden ontwikkeld; zodanigals een database van metabolieten en hun abundanties specifiek voor de ASKA verzameling E. coli klonen waarin één enkel ORF tot overexpressie 36. Bewijs voor de noodzaak van dergelijke databases was voorzien in 2013 toen onderzoekers van de Lawerence Berkeley National Laboratory samengesteld de eerste uitgebreide database van metabolieten die specifiek zijn voor hele mutant bibliotheken van model bacteriën 37. Dit onderzoek leverde nieuw inzicht in de genen die nodig zijn voor het gebruik van specifieke metabolieten, het openbaren van de duidelijk verband tussen fenotype en genotype. Bij het overwegen van metabolomics als hulpmiddel, is het belangrijk om duidelijk af te bakenen verwerking, gevolgd in de kern faciliteit. Een artefact van de meest experimentele procedures is de dag-tot-dag variatie in verband met de instrumenten van het gebruik. Tot op heden zijn alle GC-MS-analyse implementeert het gebruik van interne standaarden die zijn opgenomen in elke analytische run; Echter, de toevoeging van projectspecifieke interne samples &lt;/ Em&gt; liep elke dag van experimenten verwijdert extra variantie. Deze overwegingen moet vroeg worden gericht aan normalisering problemen en vooroordelen te voorkomen. Een andere oplossing is om alle monsters te verwerken op een kernfaciliteit op dezelfde machine als los batch, optioneel verkrijgbaar bij elke doorvoer faciliteit. De verschillende instrumenten zowel geïntroduceerd en opnieuw onderzocht in dit manuscript bieden nieuwe middelen om te screenen en te karakteriseren faaggenen functioneel onbekend. De eenvoud en de aanpasbaarheid van de experimentele technieken de stroomlijn gebruik van computationele leidingen verzekert deze methoden zijn toepasbaar op een breed scala van onderzoek inspanningen en velden. Ons doel is dat de phenomic benaderingen hier gepresenteerde verdere onderzoeken van faageiwitten roman in aanvulling zal helpen om systemen die even functioneel undefined.

Virussen die bacteriën (aka bacteriofaag of fagen) infecteren schatting bestaan ​​meer dan 10 31 virusachtige deeltjes (VLP&#39;s) globaal en overtreffen alle andere organismen in een omgeving 1,2. De eerste metagenomic onderzoek naar de virale gemeenschappen in verband met het mariene milieu gericht op het kwantificeren van de diversiteit gezien binnen het virale fractie 3. Bovendien Breitbart en collega&#39;s vonden dat meer dan 65% van de virale sequenties gedeeld door geen homologie geven sequenties in publieke databanken. Latere metagenomic studies gevonden vergelijkbaar bewijs: metagenomes uit mariene sedimenten in San Diego, Californië bevatten 75% onbekende virale sequenties 4; metagenomes van zoute meren in de Salton Sea bevatten 98% onbekende virale sequenties 5; en koraal geassocieerd metagenomes bevatten 95-98% onbekende virale sequenties 6. Deze opeenstapeling van unannotated informatie heeft geleidfaag genetisch materiaal dat &quot;de donkere materie van de biologische universum&quot; 7. Genomische karakterisering van faag baseert zich op het identificeren van sequentie-overeenkomst door vergelijking tegen bestaande nucleïnezuur en eiwit databases. Door faag gecodeerde genetische informatie is hoofdzakelijk bekend, homologie-gebaseerde methoden zijn niet effectief. Binnen hun genoom, fagen coderen gewoonlijk drie belangrijke genen types: transcriptie en replicatie genen metabole genen en structurele genen. De transcriptie en replicatie genen (klasse I / II genen 8) omvatten polymerasen, primases, endo / exo-nucleasen en kinases. Deze genen zijn sterk geconserveerd vanwege hun belang in de faag infectie, transcriberen en repliceren faag genetisch materiaal. Faag polymerasen worden gemakkelijk geïdentificeerd volgens traditionele sequentiehomologie methoden wegens hun wereldwijde bescherming 9 en is aangetoond als effectieve fylogenetische markers 10 dienen.Daarentegen faag metabole en structurele genen (klasse II / III genen 8) steeds divergent vaak geannoteerd als hypothetisch genen. Faag metabole genen van invloed op de metabole capaciteit van de gastheer en zijn niet per se nodig zijn voor virale replicatie. Deze genen, vaak aangeduid als aanvullende metabole genen 11 (AMG), blijken gastheer metabolisme moduleren en zorgen voor een optimale progressie van de infectie en het succes van virion rijping. AMG zijn geassocieerd met het gebruik en toepassing van beperkende nutriënten of energieproductie trajecten. Voorbeelden zijn fotosysteem genen in het genoom van verschillende cyanophage 12-16, genen verbonden met en geregeld door fosfaatmetabolisme 17,18, en het gebruik van de pentose fosfaat route voor faag dNTP biosynthese 18,19. In vergelijking, structurele genen behoren tot de midden tot late genen die tijdens infectie en variëren in verschillende fagen-host systemen. De productie van structurele eiwitten zijn afhankelijk van de beschikbaarheid van virale dNTP en energie pools hun transcriptie, translatie en assemblage 8. De capside en staartvezel structurele eiwitten worden beschouwd als de meest uiteenlopende van viraal eiwit coderende genen en zijn nodig voor een succesvolle virion productie. Hun verschil wordt meestal toegeschreven aan de actieve rol die zij spelen in het vormgeven van virus-gastheer coevolution 20. Afwijkende eiwitten, ongeacht het gen klasse, worden gemakkelijk vergeten bij gebruik van traditionele homologie en sequence alignment technieken. Een poging om te corrigeren voor de beperkingen waargenomen strenge sequentievergelijkingen heeft geleid bioinformatica hulpmiddelen die gebruikt sequentiekenmerken Association, zoals kunstmatige neurale netwerken 21 bepalen. Kunstmatige neurale netwerken (ANNs) maken voor het voorspellen van de structurele en metabole genen, vereisen echter downstream experimentele validatie om direct te karakteriserengenfunctie. Het doel van dit manuscript is phenomic protocollen voor de controle zowel katabole en anabole metabolisme van een gastheer bacterie tijdens de expressie van een nieuw faaggen verschaffen, functioneel voorspeld door middel ANNs. Het veld van phenomics, de biologie in verband met cellulaire fenotypes, is goed ingeburgerd in systeembiologie om te helpen bij het onderzoek naar eiwitten met onbekende of pleiotrope functie. Phenomic tools worden gebruikt om fenotypische informatie te koppelen aan genotypische informatie. We veronderstellen voor vermeende faag genen die hun functie (s) kunnen worden bepaald met inachtneming van ontvangst fysiologische effecten tijdens faag genexpressie. Om deze hypothese te onderzoeken, werden twee kwantitatieve methoden gekozen. Multi-fenotype testplaten (MAP&#39;s) gebruikt om vreemde drager gebruik en de daaropvolgende vorming van biomassa te controleren terwijl metabolomics gemeten diversiteit gastheer metaboliet en relatieve aanwezigheid tijdens de groei in bepaalde environpsychische aandoeningen. Vermeende structurele en metabole eiwitten werden tot overexpressie gebracht in Escherichia coli en representatieve resultaten van beide experimenten worden vergeleken. Tal van visuele technieken en high throughput verwerking pijpleidingen worden gepresenteerd aan de experimentele replicatie te vergemakkelijken. Ten slotte is de reproduceerbaarheid en de nauwkeurigheid van de gepresenteerde methoden worden besproken in de context van de verwachte fysiologische effecten van een geannoteerde capside-eiwit en faag metabolische eiwit thioredoxine, plus twee vermeende AMG.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m Sterivex Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m Millex Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m SteriCap Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS02RE</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m Omnipore membrane filters</td><td>Millipore</td><td>JHWP02500</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>96-well micro-titer plates</td><td>VWR</td><td>82050-764</td><td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td></tr><tr><td>2 ml 96-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive seal plate film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2 L Nalgene square bottles</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Nalgene square bottles</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer with lock ring x female Luer coupler</td><td>Cole Parmer</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>Variable flow mini pump (peristaltic pump)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Velp Scientifica</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-141</td><td>Millipore* Filter Forceps</td></tr><tr><td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td><td>Molecular Devices Analyst GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter manifold</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX10 025 02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software:</td></tr><tr><td>Python version 2.7.5</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.python.org/" target="_blank">http://www.python.org/</a></td></tr><tr><td>PyLab module</td><td></td><td></td><td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab" target="_blank">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td></tr><tr><td>R version 3.0.1</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/" target="_blank">http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>reshape2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://had.co.nz/reshape" target="_blank">http://had.co.nz/reshape</a></td></tr><tr><td>ggplot2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://ggplot2.org/" target="_blank">http://ggplot2.org/</a></td></tr><tr><td>Gene Composer</td><td>PSI Tech Portal</td><td></td><td><a href="http://www.genecomposer.net" target="_blank">http://www.genecomposer.net</a></td></tr><tr><td colspan="4">Services:</td></tr><tr><td>West Coast Metabolomics Center</td><td>UC Davis</td><td></td><td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/" target="_blank">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.dna20.com" target="_blank">https://www.dna20.com</a></td></tr></tbody></table>

faag phenomics: fysiologische approaches te karakteriseren novel virale eiwitten

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Lopende onderzoeken in faag-gastheer interacties zijn afhankelijk van het extrapoleren van de kennis van (meta) genoom. Interessant 60-95% van faag sequenties delen geen homologie bij lopende geannoteerde eiwitten. Dientengevolge, een groot deel van faag genen geannoteerd als hypothetisch. Deze realiteit sterk van invloed op de annotatie van zowel structurele en hulpstoffen metabole genen. Hier presenteren we phenomic die zijn ontworpen met de fysiologische reactie (s) van een geselecteerde gastheercellen bij de expressie van een van deze onbekende faaggenen vangen. Multi-fenotype testplaten (MAP&#39;s) worden gebruikt om de diversiteit van vreemde drager gebruik en daaropvolgende vorming van biomassa te monitoren, terwijl metabolomics biedt bijproduct analyse door monitoring metaboliet overvloed en diversiteit. Beide modellen worden tegelijkertijd gebruikt om een ​​fenotypische profiel geassocieerd met expressie van een vermeende faag enkele open leeskader (ORF) te verschaffen. Representatieve resultaten voor beide methoden worden vergeleken, highlighting de fenotypische verschillen profiel van een gastheer dragen ofwel vermeende structurele of metabole faaggenen. Bovendien zijn de visualisatietechnieken en high throughput computational pijpleidingen experimentele analyse vergemakkelijkt gepresenteerd.

Hier presenteren we fenomisch aanpakken voor de functionele karakterisering van putatieve faaggenen. Technieken omvatten een ontwikkelde test die in staat is om het anabole metabolisme van de gastheer te monitoren, de Multi-fenotype Assay Plates (MAPs), naast de gevestigde methode van metabolomics, die in staat is om effecten op katabool metabolisme te meten.

Faag phenomics: Fysiologische Approaches te karakteriseren Novel virale eiwitten

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het screenen en karakteriseren van fagegenen met onbekende functies. Allereerst worden vermeende virale open leesramen, genaamd ORF's, tot expressie gebracht in E. coli.Klonen van de faag-expresserende E. coli worden geënt op multi-fenotype assayplaten of -kaarten, die groeimedium en diverse substraten bevatten. Bacteriële groei wordt vervolgens in de tijd gemonitord via spectrometrie als tweede analysemethode; faaggen-expresserende E. coli worden gekweekt in ofwel een continue cultuur of via seriële batchkweek.De resulterende groeimetabolieten worden vervolgens verzameld en verzonden voor metabolomische analyse via gaschromatografie-tijd-van-vlucht-massaspectrometrie. De resulterende gegevens bieden een fenotypisch profiel dat geassocieerd is met de expressie van één enkel hypothetisch open leesraam van een faag. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld om de functie van onbekende viraal eiwitten te ananalyseren.Het kan ook worden toegepast op studies naar de link tussen genotypen en fenotypen, en bij het onderzoeken van de interacties tussen bacteriofagen en gastheren in verschillende biomen. Begin deze procedure door steriele 96-wells microtiterplaten te labelen met het identificatienummer van de E. coli-kloon en het type schema van de kaart, waarin de substraten worden aangegeven waartegen wordt getest in de assay. Breng onder aseptische omstandigheden steriel water over in een vloeistofreservoir.Breng vervolgens met een multichannelpipet 60 µL water over naar elke well van de microtiterplaat. Breng daarna aseptisch drie X basaalmedium over naar een vloeistofreservoir. Breng vervolgens met een multichannelpipet 50 µL over naar elke well van de microtiterplaat.Pipette met dezelfde techniek 50 µL van elk basaal medium dat in het schema van de kaart wordt gebruikt. Draag vervolgens 30 µL van elk substraat over naar de betreffende putjes. Draag daarna met een meerkanals pipet 10 µL bacteriële cellen over naar elk putje.Zorg ervoor dat u de tips vervangt voordat u de pipet opnieuw in de cultuurvoorraad plaatst. Dek elke plaat af met een adhesieve plaatfolie. Druk de folie stevig op de wells van de plaat en langs de randen om een gelijkmatige en luchtdichte afsluiting te creëren.Verwijder met een steriel scheermesje eventuele overtollige film van de randen van de microtiterplaat. Plaats de voorbereide plaat in de invoersleuf van een multifunctionele spectrophotometer. Open de software van de platenlezer en maak een protocol aan om de absorbentie elke 30 minuten te meten gedurende een totale periode van 32 uur.Stel de temperatuur van het apparaat in op 37 °C, met 60 seconden schudden tussen de metingen. Zodra de plaat is geëquilibreerd naar de ingestelde temperatuur, start het protocol na 32 uur en verwijder de plaat uit de uitgangshouder van de platenlezer. Label elk gegevensbestand met het e coone identificatienummer, de datum en het type plaatschema.Analyseer de gegevens zoals beschreven in het bijbehorende document om de groei en biologisch relevante groei te beoordelen. Parameters uit de metabolietanalyse; cellen kunnen worden gekweekt viaून continue of seriële passage batch-kweek om een steady state te handhaven.Hier demonstreren we een continue kweek. Steriliseer de componenten van een 75 milliliter continue kweekreactor en een voedingsfles van twee liter zoals beschreven in het bijbehorende document. Plaats na sterilisatie alle autoclaveermaterialen in een biologische veiligheidskabinet en schakel het ultravioletlicht in terwijl het medium afkoelt. Zodra het medium is afgekoeld, voegt u 0,1% L-arabinose en 100 µg/mL toe.Voeg ampicilline toe aan 75 milliliters 0,5 XLB-bouillon en breng dit over naar de continue reactor. Verwijder de verpakking van de dop van de continue kweekreactor en draai deze op de reactor. Vermijd contact met de bemonsteringsbuis, verwijder de verpakking van de dop van de voedingsfles en draai deze op de voedingsfles.Voorkom dat u de bemonsteringsbuis aanraakt, zodat de 18 inch slang die aan poort epsilon is bevestigd steriel blijft. Pak de 18 inch slang en de slang van de peristaltische pomp uit. Bevestig één uiteinde van de 18 inch slang aan één uiteinde van de adapter van de peristaltische pompslang en bevestig het andere uiteinde van de adapter van de peristaltische pompslang aan de 18 inch slang.Bevestig port epsilon van de dop van de voedingsfles en bevestig 0,22 µm filtereenheden op de poorten bèta en delta van de continu-cultuurreactor. Bevestig een 0,22 µm filtereenheid op de adapter van port alfa. Bevestig vervolgens de 18 inch slang in de biosafety-kast.Inoculeer de continue cultuurreactor met 100 µL van een overnight cultuur van E. coli, voorbereid zoals beschreven in het bijbehorende document. Draai de deksels van de reactor en de voedingsfles stevig vast en plaats het systeem vervolgens in een incubator op 37 °C. Bevestig de adapter voor de peristaltische pompslangen in de peristaltische pomp, die is uitgerust met een magnetische roerplaat en een minipéristaltische pomp.De slang van de voedingsfles gaat in de pomp en loopt door naar de reactor. Stel de pomp in op snel en start deze vervolgens. Schakel over naar voorwaarts om te controleren of het medium door de slang begint te stromen.Plaats de reactor op de magnetische roerplaat en begin met mengen. Laat de continue cultuurreactor 24 uur equilibreren voordat er de volgende dag monsters worden genomen. Om de continue cultuur te bemonsteren, schroeft u een Luer-lockspuit van vijf milliliter op poort gamma en trekt u 4,5 milliliter cultuur op.Gebruik 500 µL van de cultuur om de optische dichtheid bij 600 nm te meten. Gebruik vervolgens de rest van het aliquot om vier culturen van 1 mL te maken met een OD 600 van 0,35 en gebruik 1,7 mL microcentrifugebuisjes om de monsters voor gaschromatografie, time-of-flight massaspectrometrie of GC-TOF-MS voor te bereiden. Centrifugeer de cellen bij 16.900 ×g gedurende twee minuten om ze te pelletteren.Na het centrifugeren en aftappen wordt de supernatant gewassen met 500 µL PBS. Voer deze wasstap een tweede keer uit, tap de supernatant voor de laatste maal af en dompel vervolgens de microcentrifugebuisjes met de gepelletteerde cellen onder in vloeibare stikstof.Bewaar de monsters in een vriezer van -80 °C totdat het bruisen stopt. Herhaal de monsterneming elke 12 uur gedurende vier dagen nadat alle monsters zijn verzameld. Verzend drie monsters per kloon op droogijs naar een metabolomics core facility voor monsterverwerking, analyse en normalisatie van GC naar f ms om virale open reading frames te verkrijgen.Zeewater werd verzameld van Starbuck Island en Caroline AOL van de Southern Line Islands onder de koraalgrenslaag. De bacteriële groei onder 72 koolstofspecifieke condities werd voor 47 klonen beoordeeld met behulp van maps. De resulterende gegevens werden vervolgens gebruikt om de klonen te categoriseren als fenotypes met verwachte groei, functie-toename, functieverlies en geen groei.Om de hypothese te testen dat klonen met functioneel vergelijkbare eiwitten metabolomische profielen hebben, werden de mediane metabolietconcentraties bepaald voor 84 klonen gekweekt in continue cultuur via GC-TOF-ms. De resulterende gegevens werden vervolgens gebruikt om de klonen hiërarchisch te clusteren op basis van hun relatieve metabolietconcentraties, die door kleur worden aangegeven.De meest abundante metabolieten zijn in het rood weergegeven, terwijl de minst abundante in donkerblauw zijn weergegeven. Voorlopige metabolomische analyse wees uit dat hoewel structurele en metabole genen zich niet duidelijk van elkaar scheiden, genen die vergelijkbare effecten op de gastheer vertonen wel correleren. Zo clustert het geannoteerde capsid-gen nauw met de putatieve metabole genen EDT 24 40 en EDT 24 41 die in deze studie zijn gemarkeerd; onderzoeken met behulp van een openbaar beschikbaar programma voor het voorspellen van transmembraantopologie en signaalpeptiden leverden bewijs dat beide putatieve metabole genen een enkel transmembraandomein bevatten.Interessant is dat vijf van de negen klonen in de eerste clustergroep voorspelde transmembraandomeinen hebben met dezelfde topologie. Samen laten deze gegevens zien dat deze methode in staat is om informatie te verschaffen over metabolietprofielen van klonen, potentiële klonen met verwante functies en metaboliet-outliers van klonen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de gepresenteerde methoden sterk worden beïnvloed door de bacteriële fysiologie.Er moet rekening worden gehouden met maatregelen om te waarborgen dat er met klonaal onafhankelijke groepen wordt geëxperimenteerd, dat contaminatie wordt voorkomen en dat er slechts één variabele wordt getest met gebruik van de juiste controles.

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor...

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Bron: Krishnamurthi, R., et al. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (2024)Deze video demonstreert de inductie van lytische replicatie in een profaag die is geïntegreerd in het bacteriële genoom en het vastleggen van veranderingen in genexpressie via tijdgebonden bemonstering voor transcriptomische analyse.

Inductie van de lytische replicatie van de profage voor transcriptoomanalyse

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling platforms is ontworpen voor de bouw van biochemische systemen in vitro middels het uitvoeren van gene circuits. In dit artikel beschrijven we hoe bacteriofagen, zoals MS2, ΦΧ174 en T7, worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een alle E. coli cel-vrije TXTL systeem.

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

Het doel van dit protocol is te specifiek tag en selectief isoleren viraal DNA van geïnfecteerde cellen voor de karakterisatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten.

Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten

De beschreven protocollen toestaan de bouw, karakterisering en selectie (tegen het doelwit) van een bibliotheek van de "domainome" gemaakt van elke bron van DNA. Dit wordt bereikt door een onderzoek-pijpleiding dat verschillende technologieën combineert: faag display, een opvouwbare verslaggever en de volgende generatie sequencing met een web-tool voor data-analyse.

Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Dit protocol maakt het mogelijk om de impact van profagen op hun gastheren te onthullen. Bacterieculturen worden gesynchroniseerd met behulp van omstandigheden die de lysogene toestand het beste ondersteunen, waardoor spontane inductie wordt beperkt. RT-qPCR maakt ondubbelzinnig onderscheid tussen profaagbeperkte genen en genen die zijn losgekoppeld van faagcontrole en genen die tot expressie worden gebracht tijdens de lytische replicatiecyclus.

Inzicht in de impact van gematigde bacteriofagen op hun lysogenen door middel van transcriptomics

Een op optische dichtheid gebaseerde microplaatmethode wordt beschreven om de bacteriële groei op lange termijn te kwantificeren in aanwezigheid van bacteriofagen, geschikt voor actinomyceten en andere langzaam groeiende bacteriën. Deze methode omvat aanpassingen om verdamping en dekselcondensatie te verminderen en R-code om virusinfectiestatistieken te berekenen, inclusief het gebied onder de curve, het groeimaximum en de relatieve virulentie.

Een aangepaste op optische dichtheid gebaseerde microplaattest voor het karakteriseren van actinobacteriofaaginfectie

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde multiplex fluorescerende immunoassay die gebruikmaakt van een dual-reporter flowcytometrisch systeem om tegelijkertijd twee unieke spike-eiwitepitopen te detecteren op intacte virale deeltjes van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) die waren opgevangen door angiotensine-converterend enzym-2-gekoppelde magnetische microsferen.

Profilering van oppervlakte-eiwitepitopen op virale deeltjes door multiplex dual-reporter-strategie

Hier beschrijven we methoden voor bemonstering uit de eufotische zones van mariene en zoetwaterecosystemen om cyanofagen (en hun gastheren) te isoleren en post-bemonsteringsprocessen die afzonderlijke genotypen verrijken en de dynamiek van virus-gastheerinteractie karakteriseren.

Milieubemonstering van fotosynthetische microben en hun virussen: van veld tot laboratorium

Leer fenomische benaderingen om nieuwe faaggenen te karakteriseren met behulp van MAPs en metabolomics in E. coli. Deze methode koppelt genexpressie aan metabole fenotypes voor microbiologisch onderzoek.

Faag phenomics: Fysiologische Approaches te karakteriseren Novel virale eiwitten

Meer video's verkennen