Name: Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer co-immunoprecipitatie van het antivirale MX1-eiwit met influenzavirus nucleoproteïn in muiscellen. Deze methode toont eiwitinteracties aan met western blotting en optimaliseert antiviraal onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het FWO-Vlaanderen, het IOF project IOF10 / StarTT / 027 en de Universiteit Gent Special Research Grant BOF12 / GOA / 014.

Opmerking: De volgende transfectie en co-immunoprecipitatie protocol is vastgesteld voor een 9 cm Petrischaal formaat. Andere formaten zijn ook mogelijk na het schalen van het protocol. 1. Seeding de humane embryonale nier (HEK) 293T cellen <ol><li> Zaad de HEK293T cellen één dag voor transfectie 1,2 x 10 6 cellen per 9 cm petrischaal in 12 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM L-glutamine, 0,4 mM Na-pyruvaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 100 U / ml penicilline en 0,1 mg / ml streptomycine. </li><li> Kweek de cellen 16 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Inspecteer de morfologie en de levensvatbaarheid van de cellen met een omgekeerde lichtmicroscoop voor transfectie. De cellen moeten subconfluente voor optimale transfectie efficiëntie. </li></ol> 2. calciumfosfaat transfectie van HEK293T cellen Notitie: Gebruik 0,5-1 ug pCAXL-NP of lege pCAXL plasmide in combinatie met 1-3 ug pCAXL-Mx1 per 9 cm schotel. Gebruik een gelijke hoeveelheid totaal plasmide-DNA in alle monsters; aanpassen met lege plasmide indien nodig. <ol><li> Bereid de volgende transfectie buffers: <ol><li> Bereid Tris-EDTA (TE) met concentraties van 1,0 mM Tris-HCl pH 8,0 en 0,1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Bereid BS / HEPES met concentraties van 25 mM HEPES (5,96 g / l, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur), 274 mM NaCl (16 g / l), 10 mM KCI (0,74 g / l), 1,5 mM NaHPO 4 · 12H 2 O (0,5 g / l) en 11,1 mM dextrose (2 g / l). Stel de pH naar 7,05. </li><li> Bereid CaCl2 / HEPES met concentraties van 1.25 M CaCl2 · 2H 2 O (183,8 g / L) en 125 mM HEPES (29.79 g / L). Stel de pH tot 7,05 met NaOH. </li></ol></li><li> Verwarm de transfectie buffers bij 37 ° C vóór gebruik. </li><li> Bereid de plasmide monsters door verdunning van de plasmide-DNA in 600 ui TE.Bereid deze mengsels in de putjes van een 6-wells plaat. </li><li> Voeg 150 ul van CaCl2 / HEPES in een druppelsgewijs wijze het plasmide monsters en meng door pipetteren 3 keer op en neer. </li><li> Bereid de transfectie oplossing druppelsgewijs toevoegen van de plasmide-oplossing (TE + DNA + CaCl2 / HEPES; 750 pi) 750 pl BS / HEPES buffer voorzien in een nieuwe 6-wells plaat. Verdeel het plasmide oplossing gelijkmatig over het volledige putje met BS / HEPES buffer. </li><li> Schud de transfectieoplossing op een plaat schudder gedurende 90 seconden bij 1000 rpm. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg de transfectie oplossing (1,5 ml) druppelsgewijs aan de cellen. Gebruik een P1000 micropipet de transfectieoplossing op de cellen druppelen. De verspreiding van de mengsel over de volledige 9 cm petrischaal en schud de plaat heel voorzichtig. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 6 uur. Verwijder vervolgens het medium door aspiratie en onmiddellijk vervangen wiste 12 ml verse, voorverwarmde medium. Voeg voorzichtig de vers medium aan de cellen cel losraken te voorkomen. Hiervoor houdt de punt van de pipet tegen de zijkant van de put en duw het medium. </li><li> Incubeer de cellen gedurende nog eens 16 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 3. Co-immunoprecipitatie Opmerking: Voer de co-immunoprecipitatie 24 uur na transfectie. <ol><li> Voorbereiding van de lage zout lysebuffer en hoge zout wasbuffer. <ol><li> Bereid een voorraad oplossing van 2 M N-ethylmaleimide (NEM) door weging van de hoeveelheid NEM en lossen in absolute ethanol. Bereid de NEM stockoplossing vers vóór gebruik. LET OP: NEM is zeer giftig, voor te bereiden en te gebruiken deze oplossing in een zuurkast. </li><li> Bereid laag zoutgehalte lysis buffer bij concentraties van 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 1% NP40 en een cocktail van proteaseremmers (los 1 tabelt in 50 ml lysis buffer). Voeg NEM tot een uiteindelijke concentratie van 25 mM (dwz verdund 1:80). Houden op het ijs na het toevoegen van de proteaseremmers en NEM. Opmerking: Voeg altijd de proteaseremmers en NEM vóór gebruik vers. </li><li> Bereid een hoog zoutgehalte wasbuffer in concentraties van 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA en 1% NP40. Merk op dat de hoge zout wasbuffer NEM bevat. </li></ol></li><li> Bereiding van cellysaten. <ol><li> Verwijder het medium en spoelen van de cellen met 2 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Toe te voegen heel voorzichtig de wasbuffer, als HEK293T cellen los gemakkelijk. </li><li> Verwijder de PBS en voeg 600 ul van ijskoude laag zout lysebuffer per 9 cm petrischaal. </li><li> Incubeer de platen gedurende 20 min op ijs. Zorg ervoor dat de platen horizontaal worden gehouden, om een ​​volledige dekking van de plaat oppervlak met lysebuffer verzekeren. Schud de platen om de 5 min. </li><li> Verzamel het cellysaat in een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer gedurende 3 min bij 4 ° C en 16.000 xg om de onoplosbare fractie te pelleteren. </li><li> Breng de oplosbare fractie, namelijk het cellysaat een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en op ijs bewaren. Onmiddellijk verder met de co-immunoprecipitatie protocol dissociatie van de interagerende eiwitten voorkomen. Voer alle volgende stappen zoveel mogelijk op ijs of bij 4 ° C proteolytische activiteit beperken de lysaten. </li></ol></li><li> Genereren van immuuncomplexen. Opmerking: In deze stap wordt het eiwit van belang gebonden aan het geschikte antilichaam. Om de NP-Mx1 interactie te bestuderen, maken gebruik van een muis anti-NP monoklonaal antilichaam. <ol><li> Voor elk monster, meng 135 pl lysaat met 2 pl anti-NP monoklonaal antilichaam en 113 pl laag zoutgehalte lysis buffer (totaal volume 250 ui). Bewaar de overblijvende lysaat bij -20 ° C voor verdere analyse zoals western blotting, om de expressieniveaus van het vermoeden Intera documenterenctie partners in de getransfecteerde cellen. Opmerking: Alternatief meet de eiwitconcentratie van het lysaat (bijvoorbeeld met Bradford-reagens) en gebruik van een vaste hoeveelheid totaal eiwit, bijvoorbeeld 400 ug voor elk lysaat. </li><li> Incubeer de antilichaam-lysaat mengsel 3 uur op een draaiend wiel bij 4 ° C. Deze stap kan worden uitgebreid tot een nacht incuberen. </li></ol></li><li> Bereiding van het proteïne G parels. Opmerking: De proteïne G parels worden vervoerd en opgeslagen in 20% ethanol voor bewaring. De kraal-suspensie bestaat gewoonlijk uit 50% korrels en deze kralen moeten worden gewassen voordat ze worden gebruikt om de immune complexen immunoprecipiteren. <ol><li> Gebruik 50 pi kralen, dwz 100 ul kraal-suspensie voor elk monster. Was de hoeveelheid korrels nodig voor alle monsters in de co-immunoprecipitatie assay in een buis. Snij het puntje van een 1 ml pipet tip om pipetteren van de kraal-slurry te verlichten. </li><li> Centrifugeer de proteïne G kraal-suspensie bij 8000 xg en 4 ° C gedurende 30 sec. Verwijder de ethanoloplossing en een gelijk volume laag zoutgehalte lysisbuffer. Centrifugeer de proteïne G kraal-suspensie bij 8.000 xg en 4 ° C gedurende 30 seconden en de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Herhaal deze wasstap 3 keer. Opmerking: De laag zoutgehalte lysis buffer gebruikt om de parels te wassen hoeft niet proteaseremmers of NEM bevat. </li><li> Schat de hoeveelheid proteïne G kralen en een gelijk volume van laag zoutgehalte lysisbuffer in nieuw 50% kraal-suspensie in laag zout lysisbuffer maken. </li><li> Voor elk monster Breng 100 pi van de kraal-slurry in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en opgeslagen op ijs tot gebruik. Let op de hiel-slurry mengen te splitsen, zoals deze kralen snel bezinken naar de bodem van de buis. </li></ol></li><li> Immunoprecipitatie van de immuuncomplexen door proteïne G kralen en de elutie. <ol><li> Alvorens de proteïne G kralen voor immunoprecipitatie centrifuge alle buizen 30 sec bij 8.000 xg en 4 ° C encontroleren door visuele inspectie dat er een gelijke hoeveelheid kralen in alle monsters. Pas eventueel de hoeveelheid korrels in enkele van de monsters en centrifugeer weer. Gooi de bovenstaande vloeistoffen. Wees voorzichtig dat u de afgedraaid proteïne G kralen verstoren. </li><li> Kort Centrifugeer de immuun-complexen (bijv., Lysaten met antilichaam, 250 ul) gedurende 30 seconden bij 8000 xg en 4 ° C om het volledige monster op de bodem van de reageerbuis te verzamelen. Breng de immuuncomplexen naar de proteïne G parels (50 ui). </li><li> Incubeer 60 min op een wiel te draaien bij 4 ° C. Niet incubeer deze immuuncomplexen langer dan 75 min met de kralen niet-specifieke binding van eiwitten te verlagen naar de proteïne G parels. </li><li> Centrifugeer de proteïne G korrels (met gebonden immuuncomplexen) gedurende 30 seconden bij 8000 xg en 4 ° C en verwijder het supernatant. Wees voorzichtig dat u de afgedraaid proteïne G kralen verstoren. Optioneel: sla deze supernatanten bij 4 ° C of -20 ° C voor latere analyse,bijvoorbeeld het schatten van de hoeveelheid ongebonden eiwit. </li><li> Was de proteïne G korrels ongeveer 5 min met 900 gl hoog zoutgehalte lysisbuffer. Zorg ervoor dat de kralen volledig worden opnieuw gesuspendeerd in de was buffer voor optimale wassen. Centrifugeer de proteïne G parels gedurende 30 seconden bij 8000 xg en 4 ° C en werp de bovenstaande vloeistoffen. Herhaal deze wasstap 4 keer. Wees voorzichtig dat u de afgedraaid proteïne G kralen storen aan het verlies van immunogeprecipiteerd materiaal te voorkomen. </li><li> Na de laatste wasstap, voeg 50 ul 2x Laemmli monsterbuffer om de kralen en verwarm de suspensie gedurende 10 min bij 95 ° C om het (co) immunologisch neergeslagen eiwitten elueren. <ol><li> Bereid 10 ml 6x Laemmli buffer met 1 g natriumdodecylsulfaat, 3,5 ml glycerol, 3,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8 en 420 pl β-mercaptoethanol. Stel het totale volume van 10 ml door toevoeging van gedestilleerd water. Verdunnen 3 keer in gedestilleerd water tot 2x Laemmli buffer te verkrijgen. LET OP: &amp;# 946; mercapto-ethanol is giftig, voor te bereiden en te gebruiken Laemmli buffer in een zuurkast. </li></ol></li><li> Na verwarming, centrifuge de proteïne G kralen gedurende 30 seconden bij 8000 xg en bewaar de monsters bij 4 ° C (korte termijn) of -20 ° C (op lange termijn). </li></ol></li></ol> 4. Analyseer de (co-) immunogeprecipiteerd Eiwitten <ol><li> Visualiseren aanwezig in het cellysaat en het eluaat van de co-immunoprecipitatie door SDS-PAGE 20 en Western blotting 21,22 eiwitten. Typisch laden helft van het eluaat op Laemmli gel. Wees voorzichtig dat u de afgedraaid proteïne G kralen storen bij het nemen van monsters voor gel laden. MX1 en NP expressie werden onthuld met anti-Mx1 en anti-NP-antilichaam, respectievelijk 14. De banden werden gedetecteerd met HRP-gebaseerde chemiluminescentie en een röntgenfilm ontwikkelaar. </li></ol>

<ol><li>Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mx+proteins%3A+antiviral+gatekeepers+that+restrain+the+uninvited%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).</li>
<li>Goujon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MX2+is+an+interferon-induced+post-entry+inhibitor+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).</li>
<li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MX2+is+an+interferon-induced+inhibitor+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon-inducible+MxB+protein+inhibits+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection.</a> Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+human+MxA+GTPase+blocks+nuclear+import+of+Thogoto+virus+nucleocapsids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).</li>
<li>Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+interactive+region+of+human+MxA+GTPase+is+involved+in+GTPase+activation+and+interaction+with+viral+target+structures%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+%28Orthomyxoviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution-guided+identification+of+antiviral+specificity+determinants+in+the+broadly+acting+interferon-induced+innate+immunity+factor+MxA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).</li>
<li>Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+antiviral+activity+of+the+human+MxA+protein+against+Thogoto+and+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus.</a> J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).</li>
<li>Turan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+MxA+proteins+form+a+complex+with+influenza+virus+NP+and+inhibit+the+transcription+of+the+engineered+influenza+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome.</a> Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).</li>
<li>Dittmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+strains+differ+in+sensitivity+to+the+antiviral+action+of+Mx-GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase.</a> J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).</li>
<li>Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viral+nucleoprotein+determines+Mx+sensitivity+of+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses.</a> J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).</li>
<li>Manz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandemic+influenza+A+viruses+escape+from+restriction+by+human+MxA+through+adaptive+mutations+in+the+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein.</a> PLoS Pathog. 9 (3), e1003279(2013).</li>
<li>Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-inducible+protein+Mx1+inhibits+influenza+virus+by+interfering+with+functional+viral+ribonucleoprotein+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly.</a> J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).</li>
<li>Brewer, C. F., Riehm, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+possible+nonspecific+reactions+between+N-ethylmaleimide+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins.</a> Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).</li>
<li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+ribonucleotide+reductase+M1-gemcitabine+interaction+in+vivo+by+N-ethylmaleimide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide.</a> Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).</li>
<li>Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dimerization+of+human+MxA+promotes+GTP+hydrolysis%2C+resulting+in+a+mechanical+power+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke.</a> Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).</li>
<li>Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+metal-ion-binding+properties+of+the+Ca2%2B-binding+helix-loop-helix+EF-hand+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs.</a> Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).</li>
<li>Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2014).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+mouse+Mx+proteins+inhibit+different+steps+of+the+influenza+virus+multiplication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle.</a> J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Het bestuderen van de interactie tussen antivirale eiwitten en hun virale targets is zeer belangrijk voor de details van de antivirale mechanisme van deze eiwitten te begrijpen. Dit kan nieuwe inzichten in hoe virussen en hun gastheren mede-geëvolueerd te geven en zijn de basis voor de ontwikkeling van nieuwe antivirale strategieën. De geoptimaliseerde co-immunoprecipitatie hier beschreven protocol laat de interactie tussen de muis Mx1 eiwit en virale doel, het influenza NP-eiwit te bestuderen. Het belangrijkste aspect ...

Myxovirus weerstand (Mx) eiwitten zijn een belangrijk onderdeel van de aangeboren afweer tegen virale ziekteverwekkers. Deze eiwitten zijn groot dynamin-achtige GTPases die worden geïnduceerd door type I en type III interferonen. De overeenkomstige Mx genen aanwezig in bijna alle gewervelde dieren in een of meerdere kopieën en hun genproducten remmen een groot aantal virussen, waaronder Orthomyxoviridae (bv., Influenzavirus), Rhabdoviridae (bijv., Vesiculaire stomatitis virus), Bunyaviridae (bijv. , La Crosse virus) en Retroviridae (bijvoorbeeld humaan immunodeficiëntievirus-1) 4/1. Het is onduidelijk hoe deze eiwitten herkennen zo&#39;n breed scala aan virussen, zonder duidelijke gedeeld primaire sequentie motieven in deze virussen. Het analyseren van de interactie van Mx-eiwitten met hun virale doelen, mogelijk met hogere orde complexen met andere gastheercel factoren, zal helpen om de moleculaire mechanismen te begrijpen thoed zijn geëvolueerd in de wapenwedloop tussen virussen en hun gastheren. De interactie tussen zoogdieren Mx eiwitten en virale targets is het meest uitgebreid bestudeerd voor menselijke MxA. Menselijke MxA kan de replicatie van veel virussen, waaronder de orthomyxovirussen influenza A en Thogoto virus remmen. MxA bindt Thogoto virus ribonucleoproteïne complexen (vRNPs), waardoor hun nucleaire binnenkomst, waardoor blok infectie 5 voorkomen. Deze interactie tussen MxA en Thogoto virus vRNPs aangetoond met co-sedimentatie en co-immunoprecipitatie experimenten 6-9. Hoe Mx eiwitten hinderen influenza A-virussen is minder duidelijk. Een groot probleem is dat het niet eenvoudig om een ​​interactie tussen een eiwit en Mx een influenza genproduct tonen. Een rapport toonde een interactie tussen mens MxA en de NP-eiwit in het influenza A-virus geïnfecteerde cellen 10. Deze interactie kan alleen worden aangetoond door co-immunoprecipitation als de cellen waren behandeld met de verknopingsreagens dithiobis (succinimidylpropionaat) voor lysis, wat suggereert dat de interactie van voorbijgaande aard en / of zwak. Recentere studies hebben aangetoond dat de differentiële Mx gevoeligheid van verschillende influenza A-stammen wordt bepaald door de oorsprong van het NP-eiwit 11,12. In lijn met deze, kan influenza-A-virussen deels ontsnappen uit Mx controle door het muteren van specifieke resten in het NP eiwit 13. Dit suggereert dat de belangrijkste doelstelling van influenza A virussen gastheer Mx NP eiwit, waarschijnlijk NP geassembleerd vRNP complexen. Geen van deze recentere studies toonden een interactie tussen influenza NP of vRNPs en humaan MxA of muis Mx1. Onlangs toonden wij voor het eerst een interactie tussen influenza NP en muis Mx1 eiwit met een geoptimaliseerde co-immunoprecipitatie protocol 14, dat hier wordt beschreven. In het algemeen co-immunoprecipitation is een van de meest gebruikte biochemische methoden om proteïne-proteïne interacties te onderzoeken. Deze techniek wordt vaak de voorkeur boven andere technieken, bijvoorbeeld gist twee hybride, aangezien het eiwit-eiwit interacties in hun natuurlijke omgeving onderzoeken. Co-immunoprecipitatie kan op endogeen tot expressie gebrachte eiwitten worden uitgevoerd als antistoffen tegen de eiwitten van belang zijn beschikbaar. Alternatief kunnen de eiwitten van belang tot expressie worden gebracht in de cel door middel van transfectie of infectie en een affiniteit tag worden gebruikt. Naast de hierboven genoemde voordelen, beschreven co-immunoprecipitatie protocol maakt de detectie van zwakke en / of transiënte eiwit interacties. Het hoofdbestanddeel van deze geoptimaliseerde protocol is de toevoeging van N-ethylmaleimide (NEM) voor cel lysis buffer. NEM is een alkylerend reagens dat reageert met vrije thiolgroepen zoals aanwezig in cysteïnen bij een pH van 6.5-7.5, een stabiele thio-ester(Figuur 1). Bij hogere pH kan NEM ook reageren met aminogroepen of ondergaat hydrolyse 15. NEM wordt typisch gebruikt om vrije thiolgroepen te blokkeren, teneinde vorming van disulfidebindingen te voorkomen of remmen enzymatische activiteit. Zo wordt NEM vaak gebruikt om desumoylating enzymen die cysteïne proteasen blokkeren. In het beschreven co-immunoprecipitatie protocol werd NEM eerst in het lysisbuffer, omdat was gemeld dat de sumoylation van influenza eiwitten interactie tussen virale eiwitten 16 kunnen beïnvloeden. Onverwacht toevoeging NEM gebleken om de interactie tussen influenza NP en muis Mx1 door co-immunoprecipitatie document. Het is onduidelijk waarom de toevoeging NEM is cruciaal voor de NP-Mx1 interactie detecteren. Mogelijk is de interactie is ook van voorbijgaande aard en / of zwak. NEM kon de interactie, bijvoorbeeld stabiliseren, door het behoud van een specifieke conformatie van Mx1, een viraal eiwit of zelfs een onbekende derde component. Een dergelijke stabiliserende effect NEM eerder is opgemerkt, bijvoorbeeld voor de interactie tussen de ribonucleotide reductase M1 en zijn inhibitor gemcitabine (F2dC) 17. MX1 en NP beide bevatten meerdere cysteïneresiduen die door NEM kan worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, een recente studie van Rennie et al. Aangetoond dat een stalkless MxA-variant bevat drie oplosmiddel cysteine ​​residuen die door iodoacetamide kan worden gewijzigd. Muteren deze residuen serinen heeft geen invloed op de enzymatische activiteit van MxA, maar voorkomen disulfide gemedieerde aggregatie 18. Aangezien deze cysteïnen zijn geconserveerd in Mx1, suggereert dit dat de analoge cysteïnen in Mx1 door NEM en als zodanig beïnvloeden de conformatie of oplosbaarheid kan worden gewijzigd. Bovendien kan NEM van invloed op de GTPase activiteit van Mx1, die essentieel is voor de anti-influenza werking van Mx1 en daardoor de interactie tussen Mx1 en NP stabiliseren. Echter, een direct effect van NEM op de GTPase activiteit van Mx1 onwaarschijnlijk, zoals NEM moet ook de interactie tussen influenza NP en GTPase inactieve mutanten van het Mx1 eiwit 14 te detecteren. Het is duidelijk dat er meer onderzoek nodig is om het effect van NEM op de NP-Mx1 interactie te ontrafelen. Samengevat, de beschreven co-immunoprecipitatie protocol kan de interactie tussen de antivirale Mx1 eiwit en virale doel, het influenza NP-eiwit te bestuderen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om andere zwakke of voorbijgaande interacties die afhankelijk zijn van de stabilisatie van specifieke eiwitten conformaties bestuderen. Eiwit-eiwit interacties die door specifieke conformaties zijn eerder beschreven, bijvoorbeeld voor calcium bindende eiwitten zoals calmoduline 19. Tenslotte, de gunstige rol NEM kan ook worden gebruikt in andere werkwijzen die eiwit-eiwit interacties, zoals co-sedimentatie assays detecteren.

<table><tbody><tr><td>DMEM hoge glucose</td><td>Gibco</td><td>52100-047</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E-3876</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I-30212</td><td>ook bekend als NP40</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>anti-NP monoklonaal antilichaam</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-4282</td><td>ascites blend van klonen A1 en A3</td></tr><tr><td>anti-RNP polyklonaal serum</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-3133</td><td>gericht tegen A/Scotland/840/74 (H3N2)</td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4FF</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9068-36</td><td></td></tr><tr><td>ECL western blotting substraat</td><td>Pierce</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

co-immunoprecipitatie van de muis mx1 eiwit met het influenza a-virus nucleoprotein

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Het bestuderen van de interactie tussen eiwitten is essentieel om hun functie(s) te begrijpen. Een zeer krachtige methode die vaak wordt gebruikt om interacties van eiwitten met andere macromoleculen in een complex monster te bestuderen, wordt co-immunoprecipitatie genoemd. Het beschreven co-immunoprecipitatieprotocol maakt het mogelijk om de interactie te demonstreren en verder te onderzoeken tussen het antivirale myxovirus resistentie-eiwit 1 (Mx1) en een van zijn virale doelen, het nucleoproteïne (NP) van het influenza A-virus. Het protocol begint met getransfecteerde zoogdiercellen, maar het is ook mogelijk om met influenza A-virus geïnfecteerde cellen als uitgangsmateriaal te gebruiken. Na cellyse wordt het virale NP-eiwit afgescheiden met een specifiek antilichaam en de resulterende immuuncomplexen worden geprecipiteerd met protein G-kralen. Het succesvolle afscheiden van NP en de co-immunoprecipitatie van het antivirale Mx1-eiwit worden vervolgens onthuld door western blotting. Een voorwaarde voor succesvolle co-immunoprecipitatie van Mx1 met NP is de aanwezigheid van N-ethylmaleïmide (NEM) in de cellysebuffer. NEM alkyleert vrije thiolgroepen. Vermoedelijk stabiliseert deze reactie de zwakke en/of voorbijgaande NP–Mx1-interactie door een specifieke conformatie van Mx1, zijn virale doelwit of een onbekende derde component te behouden. Een belangrijke beperking van co-immunoprecipitatie-experimenten is het onbedoeld afscheiden van besmettende eiwitten, veroorzaakt door niet-specifieke binding van eiwitten aan de protein G-kralen of antilichamen. Daarom is het erg belangrijk om controle-instellingen op te nemen om valse positieve resultaten uit te sluiten. Het beschreven co-immunoprecipitatieprotocol kan worden gebruikt om de interactie van Mx-eiwitten van verschillende gewervelde soorten te bestuderen met virale eiwitten, elk eiwitpaar of een eiwit met andere macromoleculen. De gunstige rol van NEM om zwakke en/of voorbijgaande interacties te stabiliseren, moet voor elk interactiepaar afzonderlijk worden getest.

N-ethylmaleimide is een organische verbinding die kan worden gebruikt om irreversibel te wijzigen vrije thiolgroepen, bijvoorbeeld cysteïne proteases (Figuur 1) inhiberen. De antivirale Mx1 eiwit influenza A virus replicatie door interactie met het virale nucleoproteïne. De geoptimaliseerde co-immunoprecipitatie hier beschreven protocol maakt het mogelijk om deze NP-Mx1 interactie te bestuderen. HEK293T-cellen werden getransfecteerd met expressievectoren voor de ant...

Dit co-immunoprecipitatie protocol maakt het mogelijk om de interactie te bestuderen tussen het nucleoproteïne van het influenza A-virus en het antivirale Mx1-eiwit in menselijke cellen. Het protocol benadrukt het belang van N-ethylmaleïmide voor een succesvolle co-immunoprecipitatie van Mx1 en het nucleoproteïne van het influenza A-virus.

Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Het algemene doel van deze procedure is om de interactie tussen het antivirale MX1-eiwit en het virale doelwit, het influenzanucleoproteïne, aan te tonen via co-immunoprecipitatie. Dit wordt bereikt door eerst getransfecteerde cellen die beide eiwitten bevatten te lyseren in aanwezigheid van ide. De tweede stap is het toevoegen van een antilichaam dat specifiek is voor het nucleoproteïne om te binden aan het influenzanucleoproteïne en het interagerende MX1-eiwit.Vervolgens worden de resulterende immuuncomplexen neergeslagen met proteïne G-beads en worden de contaminerende eiwitten verwijderd door middel van uitgebreide wasstappen. De laatste stap is het elueren van het influenza nucleaire eiwit en het mee-neergeslagen MX1-eiwit van de proteïne G-beads. Ten slotte wordt western blotting gebruikt om de interactie tussen het influenza nucleaire eiwit en het antivirale MX1-eiwit aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals deze twee hybride systemen, is dat de interagerende eiwitten zich in hun natuurlijke omgeving bevinden, namelijk de menselijke cel. Deze methode kan inzicht bieden in de interactie tussen het nucleaire eiwit van

co-immunoprecipitation-mouse-mx1-protein-with-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het genoom van het influenza A-virus bestaat uit acht afzonderlijke complexen van RNA en eiwitten, de zogenaamde virale ribonucleoproteïne complexen (vRNPs). Dit document beschrijft de glycerol gradiënt zuivering en transmissie elektronenmicroscopie visualisatie van influenza A vRNPs.

Zuivering en Visualisatie van Influenza A Viral ribonucleoproteïne Complexen

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

This video demonstrates the immunoprecipitation of DNA fragments crosslinked with target protein from stem cell-derived motor neuron lysates using target protein-specific antibody-coated magnetic beads.

Immunoprecipitation of Target Protein-DNA Complexes from Motor Neuron Lysate

Er is een algemene kennisgebrek over hoe vaccins werken. Hier stellen we het gecombineerde gebruik van omgekeerde genetica en botmerg chimerische muizen voor om inzicht te krijgen in de vroege gastheer immuunreacties op vaccins met een speciale focus op dendritische cellen en T-cel immuniteit.

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Dit artikel beschrijft een eenvoudig en snel protocol om de oligomere toestand van het dynamin-achtige GTPase MxA-eiwit uit lysaten van menselijke cellen te evalueren met behulp van een combinatie van niet-denaturerende PAGE met western blot-analyse.

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

Influenza A virussen (IAVs) zijn belangrijke menselijke respiratoire pathogenen. Om te begrijpen van de pathogeniteit van IAVs en om de preklinische testen van nieuwe vaccin benaderingen, zijn diermodellen nabootsen menselijke fysiologie vereist. Hier beschrijven we technieken om IAV pathogenese, humorale reacties en vaccin werkzaamheid met behulp van een muismodel van infectie te evalueren.

Influenza-A Virus Studies in een muismodel van infectie

In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

Dit artikel beschrijft protocollen voor het evalueren van de Tfh- en GC B-respons in het muismodel van influenzavirusinfectie.

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Leer co-immunoprecipitatie van het antivirale MX1-eiwit met influenzavirus nucleoproteïn in muiscellen. Deze methode toont eiwitinteracties aan met western blotting en optimaliseert antiviraal onderzoek.

Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein

Meer video's verkennen