Name: Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Leer iPSCs genereren uit bevroren buffy coats met niet-integrerende episomale plasmiden via elektroporatie. Deze virusvrije methode biedt een kosteneffectieve aanpak voor patiëntspecifiek stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek werd ondersteund door het Ministerie van Volksgezondheid en het Departement van Educatieve Bijstand, Universiteit en Onderzoek van de Autonome Provincie Bolzano en de Zuid-Tiroler Sparkasse Stichting.

Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMNCs) werden geïsoleerd uit humaan perifeer bloedmonsters van gezonde donoren na ondertekend informed consent en goedkeuring van de Ethische Commissie van de provincie Zuid-Tirol. Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de principes die in de Verklaring van Helsinki. Alle gegevens werden verzameld en anoniem geanalyseerd. 1. Isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) <ol><li> PBMNCs verkregen uit buffy coats na volbloed centrifugeren, zonder dichtheidsgradiënt scheiding. <ol><li> Verzamel 8 ml veneus perifeer bloed in een natriumcitraat gebufferde plastic buisje en bewaar bij kamertemperatuur (25 ° C). Proces bloed binnen 12 uur na collectie. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 2000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C in een swinging bucket rotor, uitschakeling van de centrifuge remmen. </li><li> Verzamel de bewolkte buffycoat (de laag tussen de bovenste plasma fase en de onderstefase die het merendeel van de erythrocyten) met het PBMNC verrijkte fractie (500 ui) in een cryovial buis. </li><li> Resuspendeer 500 pl buffy coat met 500 ul 2x freezing medium dat 90% FBS en 20% DMSO, teneinde een totaal volume van 10% DMSO met een concentratie van 1 ml te verkrijgen. </li><li> Bevries het flesje in een gecontroleerde snelheid invriezen container bij -80 ° C. WINKEL cellen in vloeibare stikstof gedurende langere perioden. </li></ol></li><li> PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding <ol><li> Verzamel 12 ml perifeer veneus bloed in een natriumcitraat gebufferde plastic buisje en bewaar bij kamertemperatuur. Proces bloed binnen 12 uur na collectie. </li><li> Verdun het bloed met steriele PBS tot een eindvolume van 35 ml. </li><li> Voorzichtig en langzaam, laag 35 ml verdund bloed aan 15 ml polysucrose oplossing (voor dichtheidsgradiënt scheiding) (p = 1,077) in een 50 ml conische buis (verhouding 3: 1). </li><li> Centrifugeer de buis bij 800 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur ineen swingende emmer rotor, het uitschakelen van de centrifuge remmen. </li><li> Zuig de bovenste, gele fase die plasma en gooi deze weg. Voorzichtig, de overdracht van de ondoorzichtige witte interphase laag met PBMNCs om een ​​nieuwe 50 ml conische buis. </li><li> Breng totale volume 30 ml met steriele PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 30 ml PBS. Tel het aantal levensvatbare cellen, op basis van trypan blauw exclusie 25. </li><li> Centrifugeer PBMNCs bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur, zuig de supernatant af en gooi dit. </li><li> Resuspendeer de celpellet in een geschikte hoeveelheid ijskoud medium met 90% FBS en 10% DMSO, teneinde een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml te verkrijgen. </li><li> Aliquot 1 ml per flesje (ongeveer 5 x 10 6 cellen / ml) en vries de flacon in een gecontroleerde snelheid invriezen container bij - 80 ° C. WINKEL cellen in vloeibare stikstof gedurende langere perioden. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Ontdooien en Plating van PBMNCs (dag 0) <ol><li> PBMNCs verkregen uit buffy coats na volbloed centrifugeren, zonder dichtheidsgradiënt scheiding. <ol><li> Het protocol gebruikt PBMNCs uit bevroren buffy coats start ontdooien 1 flesje met cellen in een waterbad bij 37 ° C en los het buffy coat met steriele PBS tot een eindvolume van 2 ml. </li><li> Breng het verdunde bufferlaag in een 50 ml conische buis, voeg 10 ml erytrocyten lysis buffer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Ter voorbereiding 500 ml erytrocyten lysis buffer, voeg 0,5 g kaliumbicarbonaat, 4,145 g ammoniumchloride, 100 pl 0,5 M EDTA-oplossing tot 500 ml ultrazuiver water, pH 7,2-7,4. </li><li> Breng totale volume op 50 ml met steriele PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en was het pellet met 50 ml steriel PBS, gecentrifugeerd buffy coat bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de cellen in1 ml van PBMNC medium, zoals eerder beschreven 22, bestaande uit: IMDM en Ham&#39;s F-12 (verhouding 1: 1), 1% van de insuline-transferrine-Seleen-Ethanolamine (ITS-X), 1% van chemisch gedefinieerde Lipid Concentrate (CDL), 1% penicilline / streptomycine, 0,005% L-ascorbinezuur, 0,5% runderserumalbumine (BSA), 1-thioglycerol (eindconcentratie 200 uM), stamcelfactor SCF (100 ng / ml), Interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), erythropoïetine EPO (2 U / ml), insuline-achtige groeifactor IGF-1 (40 ng / ml), Dexamethasone (1 uM) en holo-transferrine (100 ug / ml ). </li><li> Overbrengen naar een putje van een 12-wells plaat met standaard weefselkweek behandelde oppervlak zonder coating, bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur, totdat de veranderende medium stap (zie sectie 3). </li></ol></li><li> PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding <ol><li> Om het protocol te beginnen met bevroren PBMNCs nadichtheidsgradiënt scheiding dooi 1 flacon cellen in een waterbad bij 37 ° C en breng de cellen in 5 ml medium PBMNC. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml medium PBMNC en overbrengen naar een putje van een 12-wells plaat met een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur, totdat de veranderende medium stap (zie sectie 3). </li></ol></li></ol> 3. Cultuur en uitbreiding van PBMNCs (DAY 2-13) <ol><li> Verzamel PBMNCs in suspensiekweek, met een pipet met een 1 ml tip, in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml vers medium PBMNC. </li><li> Breng de cellen in 1 putje van 12-well plaat met standaard weefselkweek behandelde oppervlak, zonder coating, en incubeer ze op 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li><li&gt; Herhaal deze stappen om de twee dagen, en de splitsing van de cellen in een verhouding 1: 2 bij het bereiken van de juiste samenloop (ongeveer 80%). </li></ol> 4. Transfectie van plasmiden PBMNCs met Episomaal (DAY 14) Opmerking: Voer de isolatie van vier commerciële intergation vrij episomale plasmiden, die de pluripotentie genen met behulp van een commerciële kit voor plasmidezuivering en de kwaliteit van de gezuiverde plasmiden met gebruik van agarose gel analyse beoordelen volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Verzamel PBMNCs in 15 ml conische buis en tel het aantal levensvatbare cellen (op basis van trypan blauw exclusie) 25. </li><li> Centrifugeer 2 x 10 6 cellen bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer 2 x 10 6 cellen van transfectie mengsel dat 100 ui resuspensiebuffer T en 1 pg van elk plasmide DNA (een plasmide dat Oct3 / 4 en shRNA tegen p53, een plasmide dat SOX2 en KLF4, eenplasmide dat L-MYC en LIN28, en een plasmide dat EGFP, om de transfectie-efficiëntie te controleren). </li><li> Zuig het transfectie mengsel dat de cellen in een 100 ul tip en plaats de pipet met het monster verticaal in de buis gevuld met 3 ml buffer Elektrolytische E2, geplaatst in de pipet station van electroporatie apparaat, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Efficiënt electroporate cellen met het volgende programma: 1650 V, 10 msec, 3 pulsen. </li><li> Resuspendeer de geëlektroporeerde cellen (2 x 10 6 cellen) in 2 ml voorverwarmde PBMNC medium, het toevoegen van 0,25 mM natriumbutyraat (NaB) en tel het aantal levensvatbare cellen na elektroporatie protocol (op basis van trypan blauw exclusie) 25. </li><li> Breng de cellen in een putje van een 6-wells plaat zonder coating, schud de plaat en incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li><li> De dag na elektroporatie, count het aantal GFP-positieve cellen onder fluorescentiemicroscopie 8-10 willekeurige velden, teneinde de transfectie-efficiëntie te beoordelen. </li><li> Handhaving van de getransfecteerde cellen zonder splitsing voor 3 dagen, totdat plating ze op MEF (zie hoofdstuk 6). </li><li> Vervang 2 ml vers PBMNCs medium, plus 0,25 mm NaB om de twee dagen. </li></ol> 5. Bereid Gerechten met Feeder-cellen voor de co-cultuur (DAY 16) <ol><li> Coat de putjes van een 6-wells plaat met 1 ml basaalmembraan matrix gedurende 15 minuten bij 37 ° C en plaat muis embryonale fibroblasten (MEF) bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen / putje met 2 ml van 10% FBS bevatte DMEM (MEF gemiddeld) een dag voor passage van de geëlektroporeerd PBMNCs op MEF feeder-cellen. </li></ol> 6. Plating Getransfecteerde PBMNCs op MEF (DAY 17-19) <ol><li> Verzamel PBMNCs in suspensiekweek, met een pipet met 1 ml tip, in 15 ml conische buis en centrifugeer getransfecteerd PBMNCs bij 300 xg gedurende 10 minbij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 ml vers medium PBMNC, plus 0,25 mM NaB. </li><li> Plaat de cellen op MEF-coated 6 goed platen en incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li><li> Na twee dagen, zuigen en het medium vervangen met 2 ml iPSC medium bestaande uit DMEM knockout (KO-DMEM), 20% KO-Serum vervangen (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% penicilline / streptomycine, 20 mM L- Glutamine, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 10 ng / ml FGF (bFGF basic) en 0,25 mM NaB. </li><li> Vervang 2 ml vers iPSC medium elke dag en controleer de cellen dagelijks. Opmerking: Bij ongeveer 22-25 dagen, moet de eerste kolonies iPSCs zichtbaar. </li></ol> 7. Picking en uitbreiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Clones (DAY 30-35) Opmerking: Ongeveer 30-35 dagen na transfectie, moet iPSC kolonies klaar voor het plukken en opnieuw uitplaten zijn. De herprogrammering efficiëntie moet esti zijngekoppeld als het percentage van het aantal iPSC kolonies / aantal cellen geëlektroporeerd, zoals eerder vermeld 26. <ol><li> De dag voor passage iPSC kolonies, de voorbereiding van de MEF feeder in een 12-well plaat (1,25 x 10 5 cellen / putje). </li><li> Zuig het MEF medium en verandering met 1 ml iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF en 10 pM Y-27632. Handmatig ontleden met een naald één kolonie op elk tijdstip onder de stereomicroscoop in het opneemmiddel kap om een ​​raster te verkrijgen, verzamel kleinere klonten door pipetteren en breng ze elk in een afzonderlijk putje van 12-well plaat bekleed met MEFs. </li><li> Passage en vergroten elke 12-well plaat een 6-wells plaat in een verhouding 1: 2, daarna iedere 6-wells plaat in een verhouding 1: 4 voor verdere vermeerdering. Ontleden en uit te breiden iPSCs handmatig voor de eerste 2-3 passages (zo grondig beschreven in stap 7.2), gebruik dan een enzym dissociatie procedure (starten vanaf stap 7.4). </li><li> Voor een enzym dissociatie protocol, schoon iPSC Colonies door opzuigen gedifferentieerde porties, onder het ontleden microscoop in het picking-kap. </li><li> Incubeer iPSCs met 1 ml collagenase IV (1 mg / ml) gedurende 10 min bij 37 ° C. </li><li> Zuig de enzymoplossing Spoel de cellen met 1 ml van KO-DMEM en laat de kolonies in een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het supernatant, resuspendeer de kolonies in 2 ml iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF en 10 pM Y-27632 en plaat ze op MEF-coated 6-well plaat (verhouding 1: 4). </li></ol> 8. Analyse van iPSCs (tussen 5-15 Passages) <ol><li> Alkalische fosfatase Staining <ol><li> Cultuur iPSC kolonies 3-5 dagen iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF. </li><li> Voor het starten van een alkalische fosfatase kleuring protocol, spoelen iPSCs eenmaal met PBS en bevestig ze met 1 ml 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen drie keer met PBS om resten PFA te verwijderen. </li><li> Stain gefixeerde cellen gebruiktcommerciële alkalische fosfatase kleuring kit volgens instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> Immunofluorescentie <ol><li> Cultuur iPSC kolonies 3-5 dagen iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF. </li><li> Om een ​​immunofluorescentie assay starten, wassen iPSCs eenmaal met PBS en vervolgens vast met 1 ml 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen drie keer met PBS om resten PFA te verwijderen. </li><li> Behandel vaste iPSCs met 1 ml van permeabilisatie / blokkerende oplossing met 4% geit serum, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 en 0,05% natriumazide (NaN3) gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Zuig het blockingbuffer en incubeer de gefixeerde cellen met primaire antilichamen in 3% BSA en 0,05% NaN3 oplossing O / N bij 4 ° C (zie de tabel materiaal voor de primaire lijst antilichaam en zonder antilichaam verdunningsfactor). </li><li> De volgende dag was iPSCs driemaal met PBS, vervolgens Incubeer de cellen met Alexa Fluor 488 geit anti-muis Alexa Fluor 555 geit anti-konijn antilichamen verdund 1: 1000 in 3% BSA en 0,05% NaN3 oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Vlekken op de kernen met DAPI (1 ug / ml) gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker, gevolgd door drie keer wassen met PBS. </li></ol></li><li> Differentiatie van iPSCs in embryoiden Bodies (EBS) <ol><li> Cultuur iPSC kolonies 5-6 dagen iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF. </li><li> Verwijder gedifferentieerde gedeelten uit iPSC kolonies door opzuigen, onder de microscoop ontleden in de picking-kap. </li><li> Incubeer iPSCs met 1 ml collagenase IV (1 mg / ml) gedurende 10 min bij 37 ° C. </li><li> Zuig de enzymoplossing Spoel de cellen met 1 ml van KO-DMEM en laat de kolonies in een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de kolonies in 2 ml EB medium uit KO-DMEM, 20% gedefinieerd foetaal bovien serum (FBS), 1 mM NEAAs, 1% penicilline / streptomycine, 20 mM L-glutamine, 0,1 mM46; mercaptoethanol. </li><li> Plate iPSC kolonies in suspensiekweek gedurende 6 dagen op ultra-low attachment 6-well platen, teneinde de vorming van bolvormige driedimensionale embryoid lichamen (EB&#39;s) mogelijk maken. Veranderen 2 ml vers EB medium om de twee dagen. </li><li> Op dag 7, verzamel EBS en plaat ze op 0,1% gelatine bedekte 6-well platen in 2 ml EB medium en EBS handhaven differentiatie gedurende 20 dagen. </li><li> Veranderen 2 ml vers EB medium om de twee dagen. </li></ol></li><li> qRT-PCR voor Gene Expression Analysis <ol><li> Cultuur iPSC kolonies 5-6 dagen iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF. </li><li> Extract totaal RNA van PBMNCs, iPSCs of EBS gebruik 1 ml commercieel reagens volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Evalueer RNA concentratie en zuiverheid geschikte werkwijzen zoals het gebruik van een spectrofotometer (hoge kwaliteit RNA A 260 / A 280 en A 260 / A 230-verhoudingen&gt; 1,8) 27. </li><li> ControleerRNA integriteit met behulp van een commerciële kit volgens de fabrikant protocol (hoge kwaliteit RNA RQI&gt; 9,5) 28. </li><li> Voer een reverse transcriptie reactie op 1 ug totaal RNA met behulp van een commercieel reverse transcriptase kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Bereid de qPCR mengsels die 5 ng cDNA sjabloon, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 pl van 5 uM primers (voorwaarts: 1 ui en achteruit: 1 pl) en 6 ui van RNase / DNase-vrij water voor elke reactie 29. </li><li> Voer de qRT-PCR met het volgende programma: een initiële denaturatiestap bij 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli bestaat uit een denaturatie stap bij 95 ° C gedurende 15 sec en primer annealing en verlenging stap bij 60 ° C gedurende 45 29 sec. </li><li> Normaliseren van de expressie van andere genen met GAPDH als housekeeping gen 28 (zie de in tabel 1 vermelde primers). </li></ol></li><li> qPCRvoor Transgene Uitsluiting <ol><li> Extraheer DNA uit PBMNCs of iPSCs gebruik 1 ml lysis buffer bevattende 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 20 ug / ml proteïnase K. </li><li> Voeg een gelijk volume (1 ml) van 100% isopropanol, meng door inversie driemaal om DNA precipitatie en centrifugeer bij 10.000 xg laat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant, was de DNA pellet met 1 ml 70% ethanol en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig en gooi het supernatant en resuspendeer in RNase / DNase-vrij water. </li><li> Evalueer DNA concentratie en zuiverheid geschikte werkwijzen zoals het gebruik van een spectrofotometer (hoge kwaliteit RNA A 260 / A 280 en A 260 / A 230-verhoudingen&gt; 1,8) 27. </li><li> Bereid de qPCR mengsels die 5 ng DNA template, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 pl van 5 uM primers (voorwaarts: 1 ui en achteruit: 1 pl) en 6 &amp;# 181; l van RNase / DNase-vrij water voor elke reactie 29. </li><li> Normaliseren van de expressie van specifieke episomaal plasmide EBNA-1 gen met behulp FBX-15 als huishoudgen 29 (zie tabel 1 opgesomde primers). </li></ol></li><li> Karyotype Analyse <ol><li> Cultuur iPSC kolonies 5-6 dagen op voedingsvrije basaalmembraan matrix beklede plaat met een commercieel gedefinieerd voedingsvrije onderhoudsmedium voor iPSCs, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Om het karyotype analyse protocol begint los iPSC kolonies met 1 ml cel onthechting oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C, tot het verkrijgen eencellige dissociatie. </li><li> Verzamel cellen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer iPSCs in 2 ml van een medium speciaal ontwikkeld voor het kweken van cellen voor prenatale diagnostiek. Plate eencellige iPSCs op basaalmembraan matrix gecoate glazen schalen en incubeer ze in een 37 ° C, 5% CO 2 &lt;/ Sub&gt; incubator. </li><li> Na 2-4 dagen, voeg 10 ul / ml colchicine direct aan de kweken en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li><li> Zuig het medium en incubeer iPSCs in 1 ml van een hypotone oplossing (0,6% natriumcitraat en 0,13% kaliumchloride) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel de cellen met 1 ml van 5% azijnzuuroplossing en bevestig iPSCs met methanol / azijn- zuuroplossing (verhouding 3: 1) in een machine met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid (28 ° C, 42% rH). </li><li> Dompel en vlek vaste cellen met Quinacrine oplossing voor 15-20 min bij kamertemperatuur in het donker 30 (Q-banding te verkrijgen). </li><li> Verwerven cel metafasen onder een fluorescentiemicroscoop bij 100X vergroting 29. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells).</a> Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci. Rep. 2, 657(2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Streckfuss-Bomeke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+bone+marrow+cells%2C+hair+keratinocytes%2C+and+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts.</a> Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).</li>
<li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+and+human+cells+to+pluripotency+using+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs.</a> Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+human+hair+follicle+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).</li>
<li>Beltrao-Braga, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+immature+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells.</a> Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li>
<li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+efficient+cellular+substrate+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adults%3A+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).</li>
<li>Hasegawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+reprogramming+efficiency+between+transduction+of+reprogramming+factors%2C+cell-cell+fusion%2C+and+cytoplast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion.</a> Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), 2565(2010).</li>
<li>Fleige, S., Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+and+the+effect+on+the+real-time+qRT-PCR+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).</li>
<li>Meraviglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chorionic+villus+mesenchymal+stromal+cells+reveal+strong+endothelial+conversion+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties.</a> Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).</li>
<li>Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+metaphase+chromosome+set+by+aid+of+DNA-binding+fluorescent+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents.</a> Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).</li>
<li>Alikani, M., Munne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviable+human+pre-implantation+embryos+as+a+source+of+stem+cells+for+research+and+potential+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy.</a> Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).</li>
<li>Tropel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+following+pre-implantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+reprogramming+is+a+stochastic+process+amenable+to+acceleration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.</a> Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ink4%2FArf+locus+is+a+barrier+for+iPS+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming.</a> Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus%3A+mechanistic+insights+into+efficient%2C+licensed%2C+extrachromosomal+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het verleden was de enige weg om humane pluripotente stamcellen die een bepaalde genetische mutatie te verkrijgen, omdat de ouders die een pre-implantatie genetische diagnose werven en het genereren embryonale stamcellen uit hun afgedankte blastocysten 31,32. Met behulp van een herprogrammering aanpak kunnen onderzoekers nu genereren iPSCs van patiënten dragen vrijwel elk genotype. De mogelijkheid te gaan van een patiënt-specifieke cellijn een gemakkelijk toegankelijke bron van groot belang omdat daarmee e...

In 2006 heeft de groep van Shinya Yamanaka 1 aangetoond voor de eerste keer dat de somatische cellen van volwassen muizen en mensen kan worden omgezet in een pluripotente toestand door ectopische expressie van vier herprogrammering factoren (oktober-4, Sox-2, Klf-4, en c-Myc), genereert de zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) 2. Patiëntspecifieke iPSCs lijken humane embryonale stamcellen (hESCs) qua morfologie, proliferatie en het vermogen om te differentiëren in de drie-kiem celtypen (mesoderm, endoderm en ectoderm), terwijl zonder de ethische bezwaren verbonden aan het gebruik van hESCs en bypassing mogelijke afstoting 3. Aldus iPSCs weergegeven als een van de belangrijkste bronnen van patiënt-specifieke cellen voor basisonderzoek, drug screening, ziektemodel, evalueren van de toxiciteit en regeneratieve geneeskunde doeleinden 4. Verschillende benaderingen zijn gebruikt iPSC generatie virale integrerende vectoren(5 retrovirus, lentivirus 6), niet-integrerende virale vectoren (adenovirus 7), Sendai-virus 8, BAC transposons 9, episomale vectoren 10, 11 eiwitten of RNA delivery 12. Hoewel het gebruik van virus-gemedieerde werkwijzen kunnen leiden tot hoge efficiency herprogrammering, virale vectoren integreren in het genoom van gastheercellen en daardoor potentiële willekeurige mutagenese kan permanente verandering van genexpressie en reactivering van zwijgen transgenen tijdens differentiatie niet uitgesloten 13. Om iPSCs veiliger regeneratieve geneeskunde maken, zijn pogingen gedaan om iPSCs afleiden zonder integratie van exogeen DNA in cellulair genoom. Hoewel accijnsgoederenverkeer virale vectoren en transposons zijn ontwikkeld, is nog onduidelijk of korte vectorsequenties, wat onvermijdelijk blijven de getransduceerde cellen na excisie en transposase expressie verandering in cel kan inducerenular functioneren 13. Ondanks zijn hoge herprogrammering efficiëntie, Sendai virus vertegenwoordigt een dure aanpak en bereiken-door licenties zorgen met het bedrijf dat dit systeem ontwikkeld, het potentieel hebben om de toepassing ervan in translationeel onderzoek te beperken. Bovendien is de noodzaak om het monster direct van eiwitten en RNA vereist meerdere afgifte herprogrammeren moleculen met de inherente technische beperkingen dit brengt en herprogrammering algehele efficiëntie zeer laag 14. Opmerkelijk zijn rendabel viraal-vrije en niet-integrerende methoden gebaseerd op het gebruik van episomale plasmiden met succes gerapporteerd voor de herschikking van huidfibroblasten 15. Specifiek, in dit werk hebben we besloten om commercieel beschikbare integratie vrije episomale plasmiden gebruiken, zoals eerder gemeld 10,15. Tot op heden huidfibroblasten vormen de meest populaire donor celtype 5. Echter, andere mobiele bronnen succes geweestalle codes opnieuw geprogrammeerd in iPSCs waaronder keratinocyten 16, beenmerg mesenchymale stamcellen 17, stromacellen in vetweefsel 18, haarzakjes 19, en tandheelkundige pulp cellen 20. De isolatie van deze cellen vereist chirurgische procedures, en enkele weken nodig om in vitro celexpansie om een primaire celkweek stellen. In dit licht is de keuze van het starten celtype is kritisch en is het even belangrijk om te kunnen iPSCs produceren van gemakkelijk toegankelijke en minder invasief weefsels zoals bloed. Zowel navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMNCs) 21,22 en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) 14,22-24 vertegenwoordigen geschikte bron van cellen voor de afleiding van iPSCs. Hoewel de efficiëntie van volwassen PBMNC herprogrammering 20-50 keer lager dan die van CBMNCs 22, blijven ze de meest geschikte celtype voor bemonstering doel. InEigenlijk PBMNC bemonstering heeft het voordeel dat minimaal invasief, en bovendien zijn deze cellen niet uitgebreid in vitro expansie voor herprogrammering experimenten vereist. Tot nu toe zijn verschillende protocollen gemeld dat PBMNCs na dichtheidsgradiënt scheiding kan worden ingevroren en ontdooid dagen tot enkele maanden na invriezen en uitgebreid voor enkele dagen vóór herprogrammeren in iPSCs 22,23. Echter zover wij weten geen rapporten herprogrammering van PBMNCs uit bevroren buffy coats beschreven. Belangrijk is bevroren buffycoats verzameld zonder dichtheidsgradiënt scheiding vertegenwoordigen de meest voorkomende bloedstalen opgeslagen in grootschalige biobanken van de bevolking studies, dus neerkomt op een gemakkelijk toegankelijke pool van materiaal voor iPSC productie die verder monstername voorkomt. Hierin beschrijven we voor het eerst de productie van virale-vrij iPSCs uit humane bevroren buffy coats, gebaseerd op een eerder beschreven protocol 22. InDaarnaast werden iPSCs geproduceerd uit bevroren PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding als een controleprotocol voor non-density gradient gezuiverde PBMNC resultaten.

<table><tbody><tr><td>Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube</td><td>Terumo</td><td>VF-054SBCS07</td><td></td></tr><tr><td>Ammodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Potassium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>0,5 M oplossing</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>Polysucrose oplossing voor dichtheidsgradient centrifugatie</td></tr><tr><td>Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>Geen fenolrood</td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)</td><td>Gibco</td><td>51500-056&nbsp;</td><td>1X (Stock: 100X)</td></tr><tr><td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td>1X (Stock: 100X)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Eindconcentratie van 200 &micro;M</td></tr><tr><td>Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml (Stock:100 &micro;g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>10 ng/ml (Stock: 10 &micro;g/ml)</td></tr><tr><td>Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td>40 ng/ml (Stock: 40 &micro;g/ml)</td></tr><tr><td>Recombinant Human Erythropoietin (EPO)</td><td>R&amp;D Systems&nbsp;</td><td>287-TC-500</td><td>2 U/ml (Stock: 50 U/ml)</td></tr><tr><td>Dexamethasone&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>1 &mu;M (Stock: 1 mM)</td></tr><tr><td>Human Holo-Transferrin</td><td>R&amp;D Systems&nbsp;</td><td>2914-HT</td><td>100 &mu;g/ml (Stock: 20 mg/ml)</td></tr><tr><td>Amniomax II</td><td>Gibco</td><td>11269016</td><td>Medium voor cytogenetische analyse</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>Medium voor feeder-free iPSC-cultuur</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>0,1 mM (Stock: 50 mM)</td></tr><tr><td>Sodium Butyrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>0,25 mM (Stock: 0,5 M)</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF basic, 145 aa&nbsp;</td><td>R&amp;D Systems&nbsp;</td><td>4114-TC</td><td>10 ng/ml (Stock: 10 &micro;g/ml)</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503&nbsp;</td><td>10 &micro;M (Stock: 10 mM)</td></tr><tr><td>Fetal Defined Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH 30070.03</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Gelatin Solution</td><td>Merck-Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td>Celafscheidingsoplossing</td></tr><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)</td><td>Global Stem</td><td>GSC-6201G</td><td>1*106 cellen/6 well plate</td></tr><tr><td>Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27077</td><td>1 &micro;g (Stock: 1 &micro;g/&/micro;l)</td></tr><tr><td>Plasmid pCXLE-hSK</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27078</td><td>1 &micro;g (Stock: 1 &micro;g/&/micro;l)</td></tr><tr><td>Plasmid pCXLE-hUL</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27080</td><td>1 &micro;g (Stock: 1 &micro;g/&/micro;l)</td></tr><tr><td>Plasmid pCXLE-EGFP</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27082</td><td>1 &micro;g (Stock: 1 &micro;g/&/micro;l)</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Staining Kit</td><td>Stemgent</td><td>00-0009</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4304</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4360</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4381</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-Oct-3/4 Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9081</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-33759</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Troponin I Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15368</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Actinin (Sarcomeric) Antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7732</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Neuronal Class III &szlig;-Tubulin (TUJ1) Antibody</td><td>Covance Research Products Inc&nbsp;</td><td>MMS-435P-100</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td><td>Calbiochem</td><td>657012</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse&nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat

generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van frozen buffy coats behulp van niet-integrerende episomaal plasmiden

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) worden geprogrammeerd door het forceren van de expressie van vier transcriptiefactoren (oktober-4, Sox-2, Klf-4, en c-Myc), typisch uitgedrukt door menselijke embryonale stamcellen (hESCs) . Door hun gelijkenis met hESCs, hebben iPSCs een belangrijk instrument voor potentiële patiënt-specifieke regeneratieve geneeskunde te worden, het vermijden van ethische kwesties in verband met hESCs. Om die geschikt zijn voor klinische toepassing, verplichting-transgen vrij iPSCs worden gegenereerd om transgene reactivering, veranderde genexpressie en differentiatie misplaatste voorkomen. Bovendien is een zeer efficiënte en goedkope herprogrammering nodig is, moet voldoende iPSCs leiden voor therapeutische doeleinden. Gezien deze behoefte, een efficiënte niet-integrerende episomaal plasmide aanpak is de voorkeur keuze voor iPSC afleiding. Momenteel is de meest voorkomende celtype voor herprogrammering doeleinden fibroblasten, de isolatie die alleen door een weefselbiopsie, een invasive chirurgische ingreep voor de patiënt. Daarom humaan perifeer bloed is de meest toegankelijke en minst invasieve weefsel voor iPSC genereren. In deze studie wordt een kosteneffectieve en virale free-protocol met behulp van niet-integrerende episomale plasmiden gerapporteerd voor het genereren van iPSCs uit menselijk perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats na volbloed centrifugering en zonder dichtheidsgradiënt gescheiden.

In dit onderzoek werd een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van virale free iPSCs door herprogrammering van PBMNCs geïsoleerd uit bevroren buffy coats na volbloed centrifugeren en vergelijking met herprogrammering van PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding wordt gerapporteerd. Figuur 1A toont een schematische weergave van de gedetailleerde protocol. Na ontdooien de geïsoleerde PBMNCs, dat een typische ronde vorm, geëxpandeerd specifieke bloed kweekmedium 14 dagen (Fi...

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit mononucleaire cellen uit perifeer humaan bloed, verkregen uit bevroren buffy coats, middels een kosteneffectief en virusvrij protocol. Dit wordt eerst bereikt door de isolatie van PB MNCs uit buffy coats na centrifugatie van volbloed zonder densiteitsgradiënt, gevolgd door expansie in een specifiek bloedkweekmedium. De tweede stap bestaat uit het transfecteren van de PB MNCs uit de buffy coat met episomale plasmiden via electroporatie.De getransfecteerde PB MNC's worden vervolgens geplaatst op verse feeder-cellen van embryonale muis fibroblasten. De laatste stap is het handmatig selecteren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit de cultuur en het overbrengen hiervan naar nieuwe platen met feeder-cellen voor expansie. Uiteindelijk kan de efficiënte herprogrammering van PB MNC's naar geïnduceerde pluripotente stamcellen met een typische humane morfologie worden aangetoond via immunofluorescentie en het meten van genexpressie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de regeneratie van virusvrije IPC's uit bevroren OTs de kosten, de werktijd en de handmatige stappen voor operators tijdens de monsterverwerking vermindert. Een ander voordeel van deze techniek is dat het gebruik mogelijk maakt van bevroren OTs die op grote schaal in een Biobank zijn opgeslagen, verzameld uit populatiestudies, als bronmateriaal voor de productie van IPS. Begin met het afnemen van acht milliliters veneus perifeer bloed in een plastic buis met natriumcitraatbuffer.Bewaar het bloed bij 25 °C en verwerk het binnen 12 uur. De eerste verwerkingsstap is het centrifugeren van het bloed bij 2000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gebruik een swinging bucket rotor en pas geen centrifugale remmen toe tijdens de scheiding.Verzamel de troebele buffylaag. Dit is de laag tussen de bovenste plasmafase en de onderste fase. De buffylaag is de verrijkte P-B-M-N-C-fractie; overbreng ongeveer 500 microliters van elk monster van acht milliliter naar een cryovial.Resuspendeer nu de buffy coat door een gelijk volume tweemaalvuldig vriesmedium toe te voegen, en vries het vials vervolgens in een container voor gecontroleerd invriezen in bij -80 °C voor maximaal één week. Voor langere bewaring kunnen de cellen worden bewaard in vloeibare stikstof. Begin het ontdooien van een bevroren suspensie van 1 mL PB MNC's, verkregen uit bevroren buffy coats, in een waterbad van 37 °C. Verdun de cellen vervolgens tot 2 mL met PBS.Breng vervolgens de verdunning over naar een buis van 50 milliliter en voeg 10 milliliter rode cel-lysisbuffer toe. Laat dit mengsel ongeveer 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Verhoog na 10 minuten het totale volume tot 50 milliliter met steriele PBS.Centrifuge de cellen vervolgens 10 minuten bij 300 Gs bij kamertemperatuur. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en was het pellet met 50 milliliters PBS. Centrifugeer de cellen nu opnieuw en resuspendeer ze in één milliliter PBM en C medium.Neem een aliquot van de geresuspendeerde cellen en meet de celdichtheid met een telkamer. Pas deze vervolgens aan naar 2 miljoen cellen per milliliter. Richt nu een suspensiecultuur op.Breng de cellen over naar een putje van een standaard 12-wells plaat en incubeer deze gedurende 48 uur. Versjes het medium om de dag, aspireer de cellen met een pipet en breng ze over naar een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de gevulde buis bij 300 GS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter vers P-B-M-N-C medium. Contaminatie met rode bloedcellen komt gebruikelijk voor tijdens de eerste dagen van de PB MNC-kweek. Voordat de cellen naar een nieuw medium worden overgebracht, moeten ze onder een omgekeerde microscoop worden gecontroleerd; wanneer ze een confluentie van ongeveer 80% hebben bereikt, wordt de kweek tijdens de overdracht gesplitst.Twee weken na het starten van de PB MNC-cultuur zouden de cellen klaar moeten zijn voor transfectie. Bereid vier plasmiden voor: één met T3, T4 en S-H-R-N-A tegen P 53, één met SOX2 en KLF4, één met lmic en lin 28, en één plasmide met EGFP. Begin met het verzamelen van de PB MNC's in een conische buis van 15 milliliter en tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van trypaanblauw.Bereid vervolgens 2 miljoen levensvatbare cellen voor, centrifugeer deze en resuspendeer de cellen in een transfectiemengsel bestaande uit 100 µL resuspensiebuffer T en één µg van elk van de vier plasmiden. Vul nu de transfectiecontainer met drie mL elektrolytische buffer E2 en aspireer het transfectiemengsel in een 100 µL tip om het monster vervolgens verticaal in de voorbereide elektroporatiebuis te injecteren.Behandel de cellen vervolgens met drie pulsen. Resuspendeer de cellen na de elektroporatie in twee milliliter voorverwarmd PBM en C-medium met 0,25 millimolair natriumbutyraat. Tel vervolgens het aantal levensvatbare cellen zoals voorheen en breng de suspensie over naar één putje van een ongecoate six-well plaat. Laat de plaat 24 uur incuberen onder milde agitatie.Houd de getransfecteerde cellen drie dagen na de dag van transfectie aan zonder ze te splitsen op om en om aaneengeslotende dagen. Vervang het medium één dag voor het opzetten van de co-cultuur door twee milliliters vers bereid P-B-M-N-C medium met 0,25 millimolar natriumbutyraat; bereid vervolgens de eerste MES-laag door de wells van een six-well plaat te vullen met één milliliter basement membrane matrix en laat de platen 15 minuten incuberen bij 37 °C. Aspireer daarna de basement membrane matrix en zaai 200 000 MEF's per well uit in twee milliliters DMEM met 10%FBS; verzamel de volgende dag de PB MNC's in een tip van één milliliter.Breng ze over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer ze. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in twee milliliters vers medium. Zaai de cellen vervolgens uit in de met meth gecoate wells en incubeer de plaat gedurende twee dagen.Vervang het medium door twee milliliters IPSC-medium met 0,25 millimolar natriumbutyraat, en ga door met het om de dag vervangen van de IPSC-media. Na ongeveer 22 tot 25 dagen zouden de eerste kolonies iPSCs zichtbaar moeten zijn, uiterlijk tegen 30 tot 35 dagen. De kolonies zouden klaar moeten zijn om te picken en opnieuw uit te platen de dag voordat de IPSC-kolonieplaat met feeder-cellen op een 12-wells plaat wordt overgebracht.Wellplaat met 125 000 cellen per well en incubeer deze een nacht. Vervang de volgende dag het medium van de meth-cellen door één milliliter aangevuld iPSC-medium. Gebruik vervolgens onder een dissectiemicroscoop een naald om één voor één kolonies te selecteren bij grotere kolonies die kleine klompjes vormen.Breng ze individueel over met een pipet, waarbij één kolonie in elke put van de met meth gecoate plaat wordt overgebracht, en incubeer de plaat voor passage. Voor de iPSC-koloniën wordt aanvankelijk dezelfde picking-techniek gebruikt, maar na twee of drie passages wordt de enzymgebaseerde procedure gehanteerd. Geïsoleerde PB MNCs met een typische ronde vorm werden gedurende 14 dagen uitgebreid in een specifiek bloedkweekmedium en vervolgens getransfecteerd met episomale plasmiden. Ongeveer 20 tot 30 dagen na de transfectie begonnen er kleine, ronde, heldere koloniën met scherp gedefinieerde marges en een morfologie die lijkt op die van embryonale stamcellen te verschijnen.Er verschenen zeer compacte iPSC-koloniën met scherpe randen, die in omvang toenamen totdat ze groot genoeg waren om te worden opgepikt voor de eerste paar passageringsstappen. De iPSC-koloniën behielden hun ongedifferentieerde staat en vertoonden een typische morfologie van menselijke embryonale stamcellen. Bij een hogere vergroting zijn de individuele cellen binnen de koloniën en de hoge kern-cytoplasmaverhouding zichtbaar.Geselecteerde IPSE-klonen werden nog ongeveer 10 tot 15 keer gepasseerd. Ongeveer 20 metafasen van verschillende onafhankelijke culturen werden geanalyseerd op genetische stabiliteit. Alle monsters vertoonden een normaal karyotype na vijf tot 10 in vitro expansies.Deze klonen werden gekarakteriseerd op hun stamcelkarakter en pluripotentie. De klonen waren positief voor alkalische fosfatase-kleuring. Kwantitatieve R-T-P-C-R bevestigde dat de klonen endogene pluripotente genen tot veel hogere niveaus tot expressie brachten dan de uitgangs-PB MNCs.Hoewel de niveaus van endogeen cmic en KLA four min of meer gelijk bleven, kon de expressie van het exogene episomale transgen niet worden aangetoond in IPC's, wat duidt op de succesvolle activatie van endogene pluripotente genen. Tot slot onthulde immunofluorescentieanalyse dat de IPC's pluripotentiemarkers tot expressie brachten zoals OC three four SSEA four TRA 180 1, SOX two en TRA one 60. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u op een kosteneffectieve manier IPC's kunt genereren uit ko, geïsoleerd uit menselijk perifeer bloed, met behulp van niet-integrerende episomale plasmiden.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-frozen-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Het huidige protocol beschrijft stappen voor het oplossen van problemen met geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) uit de perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van patiëntenmonsters die moeilijk te herprogrammeren waren volgens de instructies van de fabrikant. Dit protocol is specifiek voor bevroren buffy coat-monsters, maar kan ook worden toegepast op de herprogrammering van gezuiverde PBMC's.

Herprogrammering van geïnduceerde pluripotente stamcellijnen uit bevroren Buffy Coat-monsters

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen van de patiënt afgeleid fibroblast-achtige synoviocyten, met behulp van een lentivirale systeem zonder feeder-cellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van fibroblast-achtige synoviocyten Geïsoleerd van de gewrichten van patiënten met reumatoïde artritis

Leer iPSCs genereren uit bevroren buffy coats met niet-integrerende episomale plasmiden via elektroporatie. Deze virusvrije methode biedt een kosteneffectieve aanpak voor patiëntspecifiek stamcelonderzoek.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Meer video's verkennen