Name: Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische In Vivo Blootstelling aan zeer lage doses van bèta en gamma-straling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Leer DNA-schade en herstel meten in muizenmiltcellen na chronische blootstelling aan lage doses bèta- en gammastraling. Deze flowcytometriemethode met gamma-H2AX-markering helpt bij risicobeoordeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen de bijdrage van onze collega's Sandrine Roch-Lefevre en Eric Gregoire van het Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Parijs, Frankrijk) graag erkennen. Dit werk werd ondersteund door het wetenschaps- en technologieprogramma van de regering van Canada bij Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), de CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), de Canadian Nuclear Safety Commission en door het Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Parijs, Frankrijk).

Alle muis handling en behandeling procedures moeten zich houden aan de regels uiteengezet door de wetgever en / of dierlijke zorgprogramma&#39;s en goedgekeurd door een plaatselijke dier zorg commissie. Alle methoden beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care met toestemming van de plaatselijke dier zorg commissie. LET OP: Alle werkzaamheden met radioactiviteit (waaronder, maar niet beperkt tot het behandelen van tritium, externe γ-straling, het hanteren van radioactief dierlijke weefsels, beddengoed afval) moeten zich houden aan de regels uiteengezet door de wetgever en / of stralingsbescherming autoriteiten en worden uitgevoerd door geautoriseerde personeel in een gecertificeerd laboratorium en / of faciliteit. 1. Dierlijke Work <ol><li> Animal Groepering <ol><li> Als muizen afkomstig uit een externe organisatie, acclimatiseren dieren gedurende ten minste 10 dagen in de dierfaciliteit. Als de studie omvat verschillende behandelingsgroepen, ervoor te zorgen dat het dier leverancier al kan sturenl dieren als één partij. </li><li> Willekeurig muizen toewijzen aan behandelingsgroepen van 10 muizen per groep. Bij gebruik van mannelijke muizen van de C57BL / 6 stam, hebben het dier leverancier pre-regelen randomisatie van zeer jonge C57BL / 6 mannetjes in hun mogelijkheid om agressie problemen te beperken. </li></ol></li><li> Chronische blootstelling van muizen aan interne β-straling <ol><li> Bereid werkende concentraties tritium (10 kBq / l en 1 MBq / l) bij muizen drinkwater door verdunning van de oorspronkelijke stam van HTO en OBT (een mengsel van getritieerd proline, alanine en glycine aminozuren) oplossingen. </li><li> Valideer de eindconcentraties van tritium in het drinkwater door het meten van radioactiviteit met een vloeistof scintillatieteller. Pas concentraties, indien nodig. </li><li> Behandel dieren voor een maand door toegang ad libitum aan het tritium water. Als de behandeling water krijgt laag in de periode van twee weken, voeg meer water. Anders op twee weken veranderen flessen. </li><li> Behandel sham-bestraalde controlemuizen identiek. Houd ze in een aparte &quot;schone&quot; kamer of op een aparte &quot;schone&quot; rack onder positieve luchtdruk tritium kruisbesmetting uit de lucht te voorkomen. </li></ol></li><li> Chronische blootstelling van muizen aan externe γ-straling Opmerking: γ-straling voorziening / materiaal varieert afhankelijk van de locatie. </li><li> Met behulp van beschikbare wijzen van dosimetrie, bepalen de afstand tot een γ-stralingsbron die stralingsvelden produceren van de gewenste doses hebben. Zorg ervoor dat de homogeniteit van de straling gebieden binnen de gebieden die het dier kooien. Opmerking: 1,7 μGy / h betekent een dosistempo door 1 MBq / l tritium in het lichaam. </li><li> Expose muizen door het plaatsen van de muis kooien op het bepaald in stap 1.3.1 voor een maand afstanden. Minimaliseren dagelijkse onderbreking van γ-bestraling 30 min. Gebruik thermoluminescentie dosimeters totale geabsorbeerde doses te meten. </li></ol> 2. Offers en Sampling <ol&gt; <li> Bereid steriele chirurgische instrumenten, 60 mm petrischalen met geplaatste 70-micron filters cell, 15 ml en 1,5 ml buizen, RPMI medium aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en plaats alle binnen een biologische veiligheidskast. Zorgen voor de steriliteit van het werk is van cruciaal belang. </li><li> Pipetteer 5 ml van RPMI medium in elk 60 mm petrischaal. </li><li> Offer muizen met een door de lokale dier zorg commissie goedgekeurde methode. Cervicale dislocatie is een goede keuze voor de splenocyten werk beschreven in dit protocol. Echter, als bloedmonsters voor andere testen (bijvoorbeeld voor de mFISH, de cytochalasine block micronucleus of andere gemeenschappelijke genetoxicity assays) zijn vereist, gebruiken intra-cardiale punctie na anesthesie met isofluraan. </li><li> Plaats het dier in dorsale decubitus, met het hoofd wijzen van u af. Spray de muis naar beneden met 70% ethanol. Met behulp van een tang, pak de huid naar voren om de urethra opening en maak een kleine incisie met een schaar in de perineale regio. <ol&gt; <li> Vanaf deze insnijding, snijd langs de ventrale middellijn naar de borstholte, voorzichtig om alleen de spier muur onder snijd de huid en niet. Ontleden de huid weg van de middellijn. </li><li> Pak de buikwand met een pincet en snijden langs de middenas van de spierwand het openstellen van de buikholte. </li></ol></li><li> Accijnzen de milt door licht aangrijpend met een steriel pincet en voorzichtig te trekken terwijl tegelijkertijd het wegsnijden van het bindweefsel met een schaar. </li><li> Snij een klein stukje van de milt (ongeveer 1/10 van de milt) en plaats in een 1,5 ml buis. Snap bevriezen in vloeibare stikstof voor daaropvolgende opslag bij -80 ° C gedurende aanvullende tests. </li><li> Doe de rest van de milt in een cel zeef in een 60 mm petrischaal met 5 ml voorverdeeld RPMI media. </li><li> Ga naar de volgende muis. Opmerking: Extracted milten kan in 60 mm schalen worden gehouden met media (tot 2 uur) terwijl de rest van de muizen Sacrificed. Afhankelijk van het aantal mensen dat deelneemt, tussen 5 en 15 muizen worden verwerkt in één dag. </li></ol> 3. Bereiding van splenocyten Cultures <ol><li> Homogeniseren van de milt door hakken in een cel zeef met steriel pincet met een gebogen einde. </li><li> De cel zeef en verzamel de gefiltreerde celsuspensie van 60 mm schaal in een 15 ml buis. </li><li> Spoel de cel zeef met 5 ml medium aan de rest van de cellen te verzamelen. </li><li> Centrifugebuizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml RPMI. </li><li> Centrifugebuizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in 5 ml RPMI. </li><li> Overdracht 4 ml celsuspensie in een 25 ml weefselkweek kolf en naar een CO 2-incubator (37 ° C, 5% CO2, 80% vochtigheid) </li></ol> 4. Uitdagende Bestraling en Fixing <ol><li> Breng deresterende 1 ml celsuspensie uit stap 3,8 in een 1,5 ml buis op ijs en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. DNA schade gemeten in dit voorbeeld zowel behandeling geïnduceerde schade en t = 0 datapunt voor de constructie van een DNA-herstel curve vertegenwoordigt. </li><li> Zuig het supernatant met behulp van een vacuümpomp zorgvuldig. Voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml TBS-buffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl). </li><li> Centrifugebuizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig het supernatant met behulp van een vacuümpomp zorgvuldig. Voorzichtig resuspendeer pellet in 300 ul TBS. </li><li> Onder mengen op een vortex bij lage snelheid, voeg 700 ul van -20 ° C 100% ethanol. Sluit het deksel en omkeren een paar keer om te mengen. </li><li> Bewaar de monsters bij -20 ° C. In ethanol vaste splenocyten kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende ten minste 12 maanden zonder merkbaar verlies van de γH2AX signaal. </li><li> Bestraal het kweken van splenocyten uit stap 3.8 een uitdagende γ-rad<html> iation dosis van 2 Gy bij een dosis ≥ 200 mGy / min met behulp van beschikbare bestralingsinrichting. Opmerking: Het doel van deze bestraling DNA DSB ertoe om de reparatie machine betwisten. Röntgenstralen kunnen ook worden gebruikt voor dit doel. </li><li> Onmiddellijk terug de culturen naar een CO 2 incubator. </li><li> 1 uur na de uitdagende 2 Gy bestraling, verwijder de culturen uit de incubator naar een biologische veiligheid kabinet. Een representatieve hoeveelheid verzamelen, zacht resuspendeer cellen met behulp van een pipet en overdracht 1 ml van de celsuspensie op een 1,5 ml buis op ijs. Zet de celkweken een CO 2 incubator. </li><li> Centrifugebuizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig het supernatant met behulp van een vacuümpomp zorgvuldig. Voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml TBS. </li><li> Herhaal stap 4,3-4,5. </li><li> 24 uur na de uitdagende 2 Gy γ-straling, de oogst en vast te stellen op = 24 uur monster zoals beschreven in stap 4,8-4,10. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. Immunofluorescente Labeling met Anti-γH2AX Antibody Opmerking: Typisch, 15 - kan 30 monsters per dag immunofluorescently worden gelabeld en geanalyseerd door flowcytometrie in één run. Om een ​​nauwkeurige vergelijking tussen de groepen te zorgen, onder meer monster (s) van elke groep. Zie ook Referentie 16 voor meer informatie. <ol><li> Bereid een label set van buizen voor het aantal monsters te verwerken en plaats op ijs. Gebruik 12 x 75 mm afgetopte glazen buizen. Steriliteit is niet vereist voor dit werk. Inclusief een extra historische controle monster voor het labelen met secundaire antilichaam alleen (&quot;slechts 2 Ab&quot;). Gebruik deze historische controle monster in elke flowcytometrie draaien binnen een studie. </li><li> Voeg 0,5 ml ijskoude TBS aan elke buis. </li><li> Verwijder vaste splenocyten van -20 ° C, vortex gedurende 5 seconden en breng een 0,5 ml aliquot voorbereide buizen met TBS. Plaats de resterende monsters terug in -20 ° C opslag enhouden als backup monster. </li><li> Centrifugeer splenocyten bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml ijskoude TBS bevattende 1% FBS </li><li> Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml TST buffer (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Incubeer gedurende 20 min op ijs. </li><li> Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 200 ul van de primaire anti-γH2AX antilichaam verdund 1: 150 in TST buffer. Gebruik 200 ul van TST voor de &quot;2e Ab alleen&quot; control monster. </li><li> Position buizen op een roterende schudinrichting bij een hoek van 45 - 60 ° en schud gedurende 1,5 uur bij 300 x g bij kamertemperatuur. </li><li> Terwijl buizen incuberen, stelt een voldoende volume (200 ul / monster) van de geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa-488 bij een 1: 200 verdunning in TST buffer. Opmerking: Alle werkzaamheden met Alexa-488geconjugeerd antilichaam (stappen 5,10-5,16 hieronder) moet onder schemerige lichtomstandigheden worden gedaan en gelabelde monsters moeten worden beschermd tegen het licht door het wikkelen van buizen in aluminiumfolie. </li><li> Nadat de 1,5 uur incubatie voltooid, voeg 1 ml ijskoude TBS bevattende 2% FBS aan elke buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml TBS dat 2% FBS. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 200 pl van het secundaire antilichaam oplossing uit stap 5.8. </li><li> Incubeer de monsters op een schudplateau gedurende 1 uur zoals in stap 5.7. </li><li> Voeg 1 ml ijskoude TBS bevattende 1% FBS. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml ijskoude TBS. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 0,5 ml TBS dat 50 ug / mlpropidium jodide. </li><li> Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. </li><li> Analyseer monsters op een flowcytometer met behulp van instrument-specifieke protocollen 16. Lees minstens 10.000 cellen per monster. </li></ol>

<ol><li>Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptive+response+modifies+latency+for+radiation-induced+myeloid+leukemia+in+CBA%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice.</a> Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).</li>
<li>Shadley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+adaptive+response+in+human+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal adaptive response in human lymphocytes.</a> Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).</li>
<li>Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+%5B3H%5Dthymidine-induced+adaptive+response+of+human+lymphocytes+to+subsequent+doses+of+X-rays+involves+the+induction+of+a+chromosomal+repair+mechanism%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism).</a> Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).</li>
<li>Mitchel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dose+window+for+radiation-induced+protective+adaptive+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Dose-Response%22%5BJournal%5D)">The dose window for radiation-induced protective adaptive responses.</a> Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).</li>
<li>Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+no-threshold+relationship+is+inconsistent+with+radiation+biologic+and+experimental+data%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data.</a> Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).</li>
<li>Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+stability+and+the+DNA+double-stranded+break+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection.</a> Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).</li>
<li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+repairing+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Sensing and repairing DNA double-strand breaks.</a> Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+binding+protein+1+%2853BP1%29+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+%28125%29IdU-induced+DNA+double-strand+breaks+with+gamma-H2AX+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody.</a> Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).</li>
<li>Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus+on+histone+variant+H2AX%3A+to+be+or+not+to+be%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Focus on histone variant H2AX: to be or not to be.</a> FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).</li>
<li>Taneja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+phosphorylation+as+a+predictor+of+radiosensitivity+and+target+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy.</a> J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+histone+H2AX+in+spheroids%2C+tumors%2C+and+tissues+of+mice+exposed+to+etoposide+and+3-amino-1%2C2%2C4-benzotriazine-1%2C3-dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.</a> Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+DNA+double-strand+breaks+is+not+modulated+by+low-dose+gamma+radiation+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice.</a> Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).</li>
<li>Runge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+interpretation+of+ionizing+radiation-induced+gammaH2AX+foci+by+the+novel+pattern+recognition+system+AKLIDES%28R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R).</a> Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).</li>
<li>Jucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FociCounter%3A+A+freely+available+PC+programme+for+quantitative+and+qualitative+analysis+of+gamma-H2AX+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci.</a> Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).</li>
<li>Garty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RABIT%3A+a+rapid+automated+biodosimetry+tool+for+radiological+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage.</a> Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).</li>
<li>Kovalchuk, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+DNA+repair+in+radiation-exposed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice.</a> Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).</li>
<li>Rube, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+in+the+context+of+chromatin%3A+new+molecular+insights+by+the+nanoscale+detection+of+DNA+repair+complexes+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy.</a> DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).</li>
<li>Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+stress+genes+by+low+doses+of+gamma+rays%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of stress genes by low doses of gamma rays.</a> Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen bekende concurrerende financiële belangen zijn.

De in dit document protocol is nuttig voor het uitvoeren van grootschalige muizen in vivo studies die de genotoxische effecten van lage niveaus van verschillende chemische en fysische agentia, zoals ioniserende straling. Onze unieke specifieke pathogeenvrije dier faciliteit uitgerust met een GammaBeam 150 bestraler en een 30 meter lange bestraling hal laat uitvoeren levenslange studies met lage of zeer lage dosering bestralingen op honderden of zelfs duizenden muizen. Kleinere doorstralingsinstallaties voor chr...

Aanzienlijke controverse over de mogelijke schadelijke effecten van een lage of zeer lage doses ioniserende straling en angst publiek van de straling, gedreven door beelden van de Hiroshima en Nagasaki atomaire bombardementen en van zeldzame kerncentrale ongelukken (verergerd door de massamedia), heeft geleid tot een zeer strikte regelgeving en normen die potentieel wetenschappelijk verantwoord zijn niet stralingsbescherming. In de laatste drie decennia praktijk blijken zowel het ontbreken van schadelijke en de aanwezigheid van potentieel gunstige biologische effecten geïnduceerd door een lage dosis straling 1-4 gedocumenteerd. De belangrijkste gezondheidsproblemen straling risicofactor is de kans op kanker, geschat op basis van epidemiologische studies van atomaire bom overlevenden die hoge of gemiddelde stralingsdoses. Lineaire extrapolatie van deze gegevens (zogenaamde lineaire-no-drempel of LNT model) wordt gebruikt om het risico op kanker te schatten bij lage doses. Echter, deze aanpak niet heeft ontvangen wereldwijde wetenschappelijke acceptatieen is zwaar gedebatteerd 5. Het is duidelijk dat er meer studies nodig zijn om deze kwestie te verduidelijken en eventueel te verbeteren stralingsbescherming normen. Dergelijke studies moeten chronische behandelingen (beste benadering van milieu- en beroepsmatige blootstelling), in vivo diermodellen te betrekken (het beste voor het extrapoleren van effecten op mens) en dergelijke eindpunten zoals DNA-schade tarieven, DNA-reparatie en mutagenese. Het is bekend dat DNA is het voornaamste doelwit voor beschadiging stralingseffecten en incomplete of verkeerd onderhoud mogen leiden tot mutagenese en kankerontwikkeling 6. Dubbele DNA-breuken (DSB) is een van de meest schadelijke vormen van DNA-laesies en kan leiden tot celdood en het ontstaan ​​van tumoren 7. Het is daarom belangrijk om in staat om betrouwbaar en nauwkeurig meten van het niveau van DSB na blootstelling aan lage dosis bestraling en / of andere stressoren, zoals chemische stoffen. Een van de meest gevoelige en specifieke markersDNA DSB is gefosforyleerd histon H2AX, genaamd γH2AX 8, maar andere merkers en werkwijzen zijn voorgesteld 9,10. Geschat wordt dat duizenden H2AX moleculen in de nabijheid van een geïnduceerde DSB, zijn betrokken bij de vorming van γH2AX die de detectie van afzonderlijke DSB door immunofluorescentie labeling met een anti-γH2AX antilichaam en fluorescentiemicroscopie 11. De reactie is zeer snel en bereikte zijn maximum tussen 30 en 60 min. Het bewijs bestaat dat γH2AX vergemakkelijkt de reparatie van DNA DSB door het aantrekken van andere reparatie factoren om de sites van de pauzes en door het wijzigen van chromatine structuur om gebroken DNA uiteinden verankeren en bieden toegang voor andere reparatie-eiwitten (beoordeeld in 12). Na voltooiing van de reparatie van DNA DSB, krijgt γH2AX de-gefosforyleerd en / of ondergaat afbraak en nieuw gesynthetiseerde H2AX moleculen vervangen γH2AX in de getroffen gebieden van chromatine 10. Monitoring vorming en verlies van γH2AX kan,Daarom nauwkeurige raming van DNA-DSB-reparatie kinetiek. Deze benadering is gebruikt om herstel van DSB bestuderen verschillende humane tumorcellijnen bestraald met hoge doses straling en de snelheid en overgebleven DSB niveaus bleken te correleren met stralingsgevoeligheid 13-15. We pasten deze experimentele benadering toegepast op een in vivo muis studie waarbij het ​​effect van lage doses van chronische γ- en β-bestraling op DNA-DSB-reparatie en niveaus (figuur 1) te onderzoeken. Ten eerste tonen we een methode om een ​​langdurige chronische blootstelling van muizen uitgevoerd dat β-straling uitgezonden door hetzij tritium (waterstof-3) in de vorm van getritieerd water (HTO) of organisch gebonden tritium (OBT) opgelost in drinkwater . Beide vormen worden geacht te accumuleren en / of anders in het lichaam en daarom distribueren, geven verschillende biologische effecten. Beide vormen zijn potentiële gevaren in de nucleaire industrie. Deze behandelingwordt parallel met chronische blootstelling aan γ-straling bij een equivalente dosistempo een correcte vergelijking van de twee typen straling, wat cruciaal is voor de evaluatie van de relatieve biologische werkzaamheid toe. Beta-straling bestaat uit elektronen, waardoor het erg verschillend van de γ-straling, hoogenergetische fotonen. Als gevolg van dit verschil, Β-straling bestaat hoofdzakelijk interne gezondheidsrisico en kunnen verschillende biologische effecten in vergelijking met γ-straling. Deze complicatie resulteerde in aanzienlijke controverses over de regulering van de blootstelling aan β-straling van HTO. Zo regelgeving niveaus van HTO in drinkwater voor het publiek varieert van 100 Bq / l in Europa tot 75.000 Bq / l in Australië. Het is daarom belangrijk om biologische effecten van HTO gelijkwaardige doses van γ-straling vergelijken. Ten tweede wordt de snelheid van DNA DSB gemeten in geïsoleerde splenocyten na de voltooiing van een chronische blootstelling gebruik immunofluorescently gelabelde γH2AX detecterened door flow cytometrie. Hierdoor kan de evaluatie van de mate van DNA-schade veroorzaakt door de in vivo blootstelling. Echter, is het verstandig om te verwachten dat een dergelijke lage niveau blootstellingen geen detecteerbare tarieven van DNA DSB kunnen produceren; in plaats daarvan, een verborgen wijzigingen / reacties te verwachten dat de cellen in staat zijn om DNA-schade te herstellen zou beïnvloeden. Deze veranderingen, indien gevonden, kan zowel stimulerend (produceren van een gunstig effect) of remmende (produceren van een schadelijk effect). De voorgestelde protocol maakt onthullen dergelijke veranderingen door tegen de splenocyten geëxtraheerd met een hoge dosis straling die een aanzienlijke hoeveelheid schade veroorzaakt (bijvoorbeeld 2 Gy produceert ongeveer 50 DNA DSB per cel of 3 -. 5-voudige toename van de totale γH2AX level) . Vervolgens, de vorming en verlies van γH2AX, die de initiatie en voltooiing van DSB reparatie wordt gecontroleerd door flow cytometrie. Hierdoor kan niet alleen de basale en door behandeling geïnduceerde niveaus van DNA DSB te meten, maarOok de potentiële invloed op de cellen in staat zijn om te reageren en reparatie DNA-schade geïnduceerd door veel hogere niveaus stressor.

<table><tbody><tr><td>HTO: getritieerd water, [3H]</td><td>lokaal verkregen uit een kernreactor&nbsp;</td><td></td><td>voorraadactiviteit 3,7 GBq/mL;&nbsp; kan worden vervangen door HTO van Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organisch gebonden tritium (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Glycine, [2-3H]: organisch gebonden tritium</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organisch gebonden tritium (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>getritieerd water, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>vervanging voor HTO van lokale oorsprong&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>GammaBeam 150 bestralingsapparatuur</td><td>Atomic Energy of Canada Limited</td><td>lokaal vervaardigd</td><td>kan worden vervangen door een andere bron van gammastraling met voldoende lage activiteit&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 met L-Glutamine en HEPES 500mL</td></tr><tr><td>foetaal bovien serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anti-gH2AX antilichaam, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 geit anti-muis antilichaam</td><td>Life Technologies (voorheen Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>propidium jodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P006-EAAN</td><td>500 ml flessen Absolute Ethanol</td></tr><tr><td>1,5 ml buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682550</td><td>microcentrifugebuisjes</td></tr><tr><td>15 ml buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td>steriele polypropyleen centrifugebuizen</td></tr><tr><td>vloeibare stikstof</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm ongekapte glazen buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>wegwerpbare borosilicaatglazen buisjes met vlak uiteinde</td></tr><tr><td>T25 kolven</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc weefselkweekkolf 25ml (leveranciersnr. 156340)</td></tr><tr><td>schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>Wagner schaar 12 cm scherp/scherp</td></tr><tr><td>tang, recht</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>Semken tang 13 cm, recht</td></tr><tr><td>tang, gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Narrow Pattern tang 12 cm, gebogen</td></tr><tr><td>60 mm petrischalen</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD Falcon weefselkweekschaal 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>celzeevers, 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Falcon celzeevers 50/doos</td></tr><tr><td>PBS recept: 1 tablet opgelost in 200 ml gedeïoniseerd water, pH aanpassen naar 7,4 indien nodig.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Fosfaat Buffered Saline Tabletten</td></tr><tr><td>TBS recept: om 10x voorraad te maken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 g TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Trizma hydrochloride</td></tr><tr><td>88 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Natriumchloride</td></tr><tr><td>2 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Kaliumchloride</td></tr><tr><td>Oplossen in 1 L gedeïoniseerd water, pH aanpassen naar 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van dna-schade en herstel in mouse splenocyten na chronische<em&gt; in vivo</em&gt; blootstelling aan zeer lage doses van bèta en gamma-straling

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Lage dosis straling blootstelling kan een verscheidenheid van biologische effecten die verschillen in hoeveelheid en kwaliteit van de door hoge stralingsdoses effecten veroorzaken. Het aanpakken van vraagstukken in verband met de veiligheid van het milieu, het werk en de volksgezondheid in een goede en wetenschappelijk verantwoorde manier sterk afhankelijk is van het vermogen om de biologische effecten van een lage dosis verontreinigende stoffen, zoals ioniserende straling en chemische stoffen nauwkeurig te meten. DNA-schade en herstel zijn de belangrijkste vroege indicatoren van de gezondheidsrisico&#39;s als gevolg van hun mogelijke gevolgen op lange termijn, zoals kanker. Hier beschrijven we een protocol om het effect van chronische in vivo blootstelling aan lage doseringen γ- en β-straling op DNA schade en herstel bij muizen miltcellen bestuderen. Met behulp van een algemeen bekend merker DNA double-strand breaks, gefosforyleerd histon H2AX genoemd γH2AX, laten we zien hoe het gebruikt kan worden om niet alleen de mate van DNA-schade te evalueren, maar ook veranderingenin de DNA-reparatie capaciteit potentieel geproduceerd door lage dosis in vivo blootstelling. Flowcytometrie maakt een snelle, nauwkeurige en betrouwbare meting van immunofluorescently gelabeld γH2AX in een groot aantal monsters. DNA double-strand break repair kan worden geëvalueerd door het blootstellen geëxtraheerd splenocyten een uitdagende dosering van 2 Gy tot voldoende produceren van DNA breuken te herstellen activeren en door het meten van de geïnduceerde (1 uur na bestraling) en resterend DNA schade (24 hrs post-bestraling). Residuele DNA schade indicatief onvolledige reparatie en het risico van langdurige genomische instabiliteit en kanker zijn. In combinatie met andere tests en eindpunten die gemakkelijk kan worden gemeten zoals in vivo studies (bijvoorbeeld chromosoomafwijkingen, micronuclei frequenties in beenmerg reticulocyten, genexpressie, enz.), Deze benadering maakt een nauwkeurige en contextuele evaluatie van de biologische effecten van laag niveau stressoren.

Figuur 2 toont voorbeelden van flowcytometrie grafieken verwacht splenocyten bereid volgens de hieronder beschreven werkwijze. De cellen worden eerst gated gebaseerd op de &lt;elektronische volume-side scatter&gt; scatterplot (figuur 2A en 2D, elektronische volume is gelijk aan voorwaartse verstrooiing). FL3 / propidiumjodide histogrammen (figuur 2B en 2E) bevestigen normale celcyclus distributie. Gemiddelde γH2AX signaal berekend volge...

Een protocol om veranderingen in DNA-schadeniveaus en DNA-reparatievermogen te evalueren die kunnen worden geïnduceerd door chronische in vivo lage dosis bestraling in muis miltlymfocyten, door gemeten gefosforyleerd histon H2AX, een marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken, met behulp van flowcytometrie wordt gepresenteerd.

Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische<em&gt; In Vivo</em&gt; Blootstelling aan zeer lage doses van bèta en gamma-straling

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de DNA-schade en het herstel te meten dat in miltcellen van muizen wordt geïnduceerd door chronische in vivo blootstelling aan lage doses bèta- of gammastraling. Dit wordt bereikt door de muizen eerst bloot te stellen aan interne bèta- of externe gammastraling om potentiële veranderingen in DNA-schade en -herstel uit te lokken. Als tweede stap worden de PLE-cyten geïsoleerd en bestraald met een hoge uitdagingsdosis gammastraling die detecteerbare DNA-schade induceert, om zo de monitoring van het DNA-herstel mogelijk te maken.Na verloop van tijd worden de miltcellen vervolgens fluorescent immunogestuurd gelabeld tegen gamma H2AX om kwantificering van de DNA-schade mogelijk te maken. Uiteindelijk kan de DNA-schade veroorzaakt door doses acute gammastraling van slechts 10 cGy worden gemeten via flowcytometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de radioprotectie, zoals de vraag of lage doses straling, zoals gewoonlijk aangetroffen in een beroepsmatige, medische of publieke setting, daadwerkelijk de waarschijnlijkheid van schadelijke gezondheidseffecten, zoals kanker, verhogen.De belangrijkste

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

We beschrijven hier een platform dat comet assay detectie van DNA-schade met ongekende doorvoer toestaat. De inrichting patronen zoogdiercellen in een microarray en maakt parallelle verwerking van 96 monsters. De benadering maakt analyse van basisniveau DNA schade, blootstelling DNA schade en DNA herstel kinetiek.

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Toediening van twee analogen van thymidine, Edu en BrdU, bij zwangere muizen maakt de analyse van de celcyclus en in neurale voorlopercellen in de embryonale hersenen van muizen. Deze werkwijze is nuttig om de effecten van genotoxische stress, zoals ioniserende straling, tijdens de hersenontwikkeling bepalen.

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

We presenteren een diffuse optische spectroscopische (DOS) aanpak die kwantitatieve optische biomarkers levert van de huidrespons op straling. We beschrijven het ontwerp van DOS-instrumentatie, algoritmen voor het extraheren van optische parameters en de procedure voor het hanteren van dieren die nodig zijn om representatieve gegevens op te leveren vanuit een preklinisch muismodel van door straling veroorzaakt erythema.

Diffuse optische spectroscopie voor de kwantitatieve beoordeling van Acute ioniserende straling veroorzaakte Huidtoxiciteit Met behulp van een muismodel

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

Het maagdarmkanaal is een van de meest gevoelige organen voor letsel bij radiotherapeutische kankerbehandelingen. Het is tegelijkertijd een orgaansysteem met een van de hoogste regeneratieve capaciteiten na dergelijke beledigingen. Het gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om het regeneratieve vermogen van het darmepitheel te bestuderen.

Intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling

Het protocol beschrijft een onderzoek naar de systemische en lokale huideffecten van blootstelling aan ultraviolet B bij muizen.

Onderzoek naar chronische blootstelling van muizen aan ultraviolette B-straling 

Leer DNA-schade en herstel meten in muizenmiltcellen na chronische blootstelling aan lage doses bèta- en gammastraling. Deze flowcytometriemethode met gamma-H2AX-markering helpt bij risicobeoordeling.

Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische In Vivo Blootstelling aan zeer lage doses van bèta en gamma-straling (Video) | JoVE Journal

Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische

Meer video's verkennen