Visualisatie van Chondrocyte Intercalatie en Directional Proliferatie via Zebrabow Klonale Cell Analysis in het Embryonale Meckel's Kraakbeen
21 oktober 2015
Cel organisatie van craniofaciale botten is al lang de hypothese, maar niet direct zichtbaar. Multispectrale cell labeling en in vivo levende beeldvorming maakt visualisatie van de dynamische cel gedrag in de zebravis onderkaak. Hier hebben we detail het protocol te manipuleren Zebrabow transgene vis en direct waar te nemen cel intercalatie en morfologische veranderingen van chondrocyten in de Meckel's kraakbeen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om chondrocytenintercollation en -uitbreiding te visualiseren via zebraboog-klonale celanalyse. Dit wordt bereikt door een SOX 10 ERT twee Cree zebraboog M-lijn te genereren om weefselspecifieke recombinatie in de craniale gezichtskraakbeen en embryo's voor klonale analyse te bereiken. Vervolgens worden de embryo's gedurende drie uur gepulseerd met tamoxifen in het 10 so-mitotische stadium om het recombinatieproces te induceren.
Vervolgens worden embryo's geselecteerd op de expressie van CRE-activiteit en sterke rode fluorescentie of RFP-expressie, en worden de embryo's gemonteerd voor beeldvorming van C craniofaciale kraakbeen. De resultaten tonen multispectrale celanalyse van de craniofaciale chondrocyten op basis van confocale beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals S in blauwe kleuring of transgene lijnen zoals so en GFP of SOX en kde, is dat zebraboog ons in staat stelt om specifiek klonale celpopulaties te observeren en te volgen die betrokken zijn bij een orgaanvorming.
Om de embryocollectie op dag één voor te bereiden, stelt u meerdere mannelijke en vrouwelijke paar sox, 10 ERT twee Cree zebraboog M transgene zebravissen in verdeelde kweektanks in tussen vijf en 6:00 uur de volgende dag, nadat is geverifieerd onder een lichtmicroscoop dat de embryo's de 10 cellulite-fase onder een fluorescentiemicroscoop met een RFP-filter hebben bereikt. Isoleer de felrode embryo's en breng ze over naar een nieuwe petrischaal met vers E drie-medium om Cree-recombinatie te induceren. Voeg 10 micromolar hydroxytamoxifen-oplossing toe aan de petrischaal en incubeer de embryo's gedurende drie uur bij 28,5 graden Celsius.
Decanteer vervolgens de Tamoxifen-oplossing in een biologisch afvalcontainer en gebruik E drie om de embryo's meerdere keren te wassen nadat de embryo's overnacht zijn geïncubeerd tot de 28 tot 29 so-mitotische fase, breng de embryo's over naar E drie PTU-oplossing en plaats ze terug in de incubator. Om de volledig ontwikkelde C craniofaciale structuren te visualiseren, selecteer embryo's op vier DPF met een intens rood signaal en gele Cree-expressie in de retina. Na het anesthetiseren van een embryo in Trica, volgens het tekstprotocol, breng het over in een petrischaal met een druppel Methylcellulose op een schone confocale dia.
Plaats een druppel verse Methylcellulose en gebruik een micro-ladertip om het embryo dorsaal te plaatsen terwijl u ervoor zorgt dat u het niet direct aanraakt met een 25 bij 25 coverslip. Bedek het embryo en gebruik de coverslip om het embryo indien nodig te manipuleren. Gebruik voor het beeldvormen van het embryo een 20 x droog lensobjectief.
Om op het onderwerp te focussen, drukt u op de L 100-knop op de microscoop en selecteert u vervolgens de confocale opstellingsknop. Klik op auto en selecteer de CFP voor kanaal een GFP voor kanaal twee en RFP of M cherry voor kanaal drie. Sluit vervolgens het venster.
Schakel kanalen twee en drie in voordat u op de verwijderinterlock-knop klikt. Klik vervolgens op afspelen om met scannen te beginnen. Na het aanpassen van de instellingen, legt u de gewenste afbeeldingen vast en slaat u deze op in het confocale softwareformaat en ook in TIF-formaat voor beeldverwerking per kanaal.
Om CFP-beeldvorming uit te voeren, schakel kanalen twee en drie uit en schakel kanaal een in zonder het focusgebied te wijzigen. Pas de scaninstellingen opnieuw aan voordat u afbeeldingen vastlegt, sla afbeeldingen op zoals zojuist beschreven en voer beeldverwerking uit zoals beschreven door Pan en collega's zoals hier getoond. Traditionele kraakbeenvisualisatie door volledige Mount Sian blauwe kleuring is van onschatbare waarde geweest bij het observeren van de zich ontwikkelende mekel-kraakbeen en wordt vaak gebruikt om de uiteindelijke cellulaire organisatie te visualiseren om de zich ontwikkelende chondrocyten in de tijd verder te analyseren lijnagetracering.
Het gebruik van SOX 10 kda transgene lijnen is gebruikt om celmigratie en convergentie en extensie in levende embryo's te bestuderen met behulp van live beeldvorming van de zebraboog m transgene lijn. Om de organisatie van chondrocyten in de C craniofaciale skeletstroom verder te bestuderen, onthult dit de processen van chondrocytenintercollation en -verlenging die de extensie en groei van meckel's kraakbeen mediëren. Deze figuur toont de onderkaak van UI zebraboog M Sox 10 ERT twee Cree transgene embryo's tussen 3D PF en vijf dagen na bevruchting.
De onderkaak wordt het beste ventraal afgebeeld om duidelijke weergaven van celorganisatie in het meles-kraakbeen te laten zien, zoals hier getoond. De stabiel gehandhaafde en geërfde kleuren maken gemakkelijke lijnagetracering en craniale neurale topcel-fatumkaart mogelijk. De enkele blauwe cel lijkt te migreren en te interpoleren met zijn naburige cellen, verlengt vervolgens langs de anterieure posterieure as om een uniform gevormde chondrasite te vormen, waardoor de globale vorm van het meles-kraakbeen wordt gehandhaafd terwijl het anterieure uitsteekt.
Deze techniek baant een weg voor onderzoekers op het gebied van katontwikkeling om chondro in zebravisskeletvorming te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het visualiseren van chondrocyt-intercalatie en -extensie in craniofaciële kraakbeen van zebravissen met behulp van Zebrabow-transgene vissen. De techniek maakt directe observatie van dynamisch celgedrag mogelijk tijdens orgaanvorming.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- De organisatie van craniofaciële botten is gehypothetiseerd, maar niet direct gevisualiseerd.
- Chondrocyten spelen een cruciale rol in kraakbeenontwikkeling.
- Bestaande methoden voor het bestuderen van celgedrag hebben beperkingen.
- Zebrabow-technologie maakt clonale analyse van celpopulaties mogelijk.
Doel van de studie
- Om chondrocyt-intercalatie en morfologische veranderingen te visualiseren.
- Om de voordelen van Zebrabow ten opzichte van traditionele methoden te demonstreren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers op dit gebied.
Gebruikte methoden
- Generatie van SOX 10 ERT2 Cre Zebrabow M lijn voor weefselspecifieke recombinatie.
- Pulsing van embryo's met tamoxifen om recombinatie te induceren.
- Selectie van embryo's op basis van CRE-activiteit en RFP-expressie.
- Confocale beeldvorming voor multispectrale analyse van craniofaciële chondrocyten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van chondrocyt-intercalatie en -extensie.
- Demonstratie van clonale celpopulaties betrokken bij orgaanvorming.
- Vergelijking van de Zebrabow-techniek met bestaande methoden.
- Inzichten in dynamisch celgedrag in craniofaciële kraakbeen.
Conclusies
- Zebrabow-technologie biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van craniofaciële ontwikkeling.
- De methode verbetert het begrip van chondrocytdynamiek.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken naar andere gebieden van ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding chondrocyte organization in craniofacial cartilage provides mechanistic insights into mandible morphogenesis, informing target validation for craniofacial disorders. The Zebrabow clonal analysis approach enables direct visualization of cellular behaviors driving tissue extension, supporting predictive confidence in preclinical models of mandibular development. This mechanistic de-risking value aids in prioritizing therapeutic hypotheses related to skeletal patterning and growth.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chondrocyte intercalation mechanisms that drive Meckel’s cartilage extension.
- Scientific Value: Supports functional validation of clonal contributions to craniofacial skeletal patterning.
- Scientific Value: Provides direct observation of cellular behaviors underlying hypoplastic mandible phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates multispectral clonal readouts for quantitative assessment of chondrocyte dynamics.
- Operational Value: Establishes a reproducible lineage-tracing platform for live imaging of cartilage morphogenesis.
- Operational Value: Enables standardized clonal analysis across developmental timepoints for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links clonal chondrocyte behavior to mandibular outgrowth, informing disease-relevant system relevance.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular basis of mandibular hypoplasia.
- Translational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation of craniofacial growth pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The Zebrabow clonal analysis method integrates into early discovery workflows by providing direct readouts of chondrocyte intercalation and elongation, informing target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chondrocyte-driven tissue extension mechanisms in craniofacial development.
- Screening: Delivers quantitative, multispectral clonal outputs enabling reproducible assessment of chondrocyte organization.
- Analytics: Provides clonal lineage tracing and morphological metrics that allow comparison of cellular behaviors across conditions.
- Translational Research: Connects clonal chondrocyte dynamics to mandibular morphogenesis, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clonal imaging platform applicable to multiple organogenesis studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of chondrocyte intercalation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via inherited fluorescent clonal labeling.
- Strategic Value: Reduced biological risk in craniofacial therapeutic development via mechanistic clarity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets affecting mandibular growth and patterning.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic zebrafish handling and clonal lineage tracing.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure for multispectral imaging.
- Necessitates standardized tamoxifen induction protocols for consistent recombination.
- Involves adaptation considerations for applying clonal analysis to other skeletal or tissue systems.
- Limited by the need for precise embryonic staging and fluorescent selection for clonal induction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Embryo Collection, Tamoxifen Treatment, and Embryo Selection
2:46
Mounting Embryos in Methylcellulose and Fluorescence Microscopy
4:33
Results: Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation in ubi:Zebrabow-M;sox10:ERT2-Cre Transgenic Zebrafish
6:15
Conclusion
