Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis In Vitro

Het algemene doel van deze procedure is om een vereenvoudigd systeem te bieden voor de analyse van cel durex waardoor veel zoogdiercellen preferentieel migreren naar een stugger substraat. Dit wordt bereikt door eerst Polymethyl suboxaan of PDMS substraten met gedefinieerde stijfheid voor te bereiden. Vervolgens wordt het bereide PDMS in elke put van een zes-putsplaat gegoten en worden eventuele luchtbellen verwijderd.

De Durex-kamers worden vervolgens voltooid door een gesteriliseerde dekglas op de PDMS in elke put te plaatsen om een overlay te creëren. De laatste stap is om cellen in de Duro taxen-kamers te zaaien met een dichtheid die de cellen voldoende ruimte geeft om te migreren zonder significante interacties met andere cellen. Uiteindelijk wordt levende celmicroscopie gebruikt om axxis in migreren cellen te bestuderen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals polyacrylamide is dat er een enkele stap is tussen de zachte PDMS en het stijve glas in plaats van gradiëntgel alternatieven. Ook het coaten van PDMS met extracellulaire matrix Componenten zoals fibronectine vereist geen chemische cross-linking, wat vereist is voor polyacrylamide gels. Om eerst een zes-puts weefselkweekplaat voor te bereiden, scheurt u de balans met een 50 milliliter conische buis.

Weeg ongeveer 10 gram van de poly dimethyl suboxaan of PDMS basisoplossing in de 50 milliliter buis af. Voor een 90 tot één substraat, verdeel het gemeten gewicht van de PDMS basisoplossing door 90. Om de juiste hoeveelheid crosslinker-oplossing te bepalen, voegt u de berekende hoeveelheid PDMS crosslinker-oplossing toe aan de buis en mengt u krachtig gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met het A-P-D-M-S basis crosslinker mengsel.

Gebruik in dit stadium een kleine spatel, het mengsel zal een kleine hoeveelheid luchtbellen bevatten. Centrifugeer de PDMS substraat in een benchtop centrifuge gedurende vijf minuten bij 50 keer. G. Voeg kamertemperatuur toe om de bellen te verwijderen als er nog steeds bellen zijn.

Na de vijf minuten centrifugeer opnieuw en pipet een milliliter van de 90 tot één PDMS substraat in elke put van de weefselkweek behandelde. Zes-puts plaat. Eventuele resterende luchtbellen in het PDMS kunnen in dit stadium worden geëlimineerd door ze met een 21 gauge naald te doorprikken.

Laat de PDMS zich gedurende 30 minuten in de put verspreiden. Kook vervolgens 12 millimeter glas Nummer één, dekglas in gedistilleerd water gedurende vijf minuten, in totaal drie keer. Plaats een gedroogd dekglas in elke put van de weefselkweekplaat door een zijkant van het dekglas voorzichtig aan te raken.

Schuif het in de PDMS-oplossing en laat vervolgens het dekglas op de PDMS vallen. Terwijl het dekglas zich nestelt, zal de PDMS beginnen om over de randen van het dekglas te gaan, maar het niet volledig te bedekken. Dit zal een interface genereren tussen de PDMS en het glas na het harden.

Incubeer de plaat gedurende 16 uur in een oven op 70 graden Celsius om de PDMS te harden. Plaats ten slotte de plaat in een cellenkweek kap en steriliseer gedurende 10 minuten met UV. Bekleed elke durox-kamer met één milliliter fibronectin in fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium gedurende één uur bij 30 graden Celsius.

Zorg ervoor dat het hele oppervlak is ondergedompeld in de fibronectin in PBS-oplossing. Bereid hitte-genatureerd 1% bovine serum albumine of BSA voor door 0,5 gram BSA af te wegen en het op te lossen in 50 milliliter PBS-filter. Steriliseer een oplossing door een punt 22 micron filter voordat u het gedurende 12 minuten op 80 graden Celsius verwarmt.

Aspireer vervolgens de fibronectin-oplossing en was de kamers drie keer met PBS. Voeg één milliliter hitte-gedenatureerd BSA in PBS toe aan elke put en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, trypsine-ogen, en tel de cellen van keuze terwijl de durex-kamers blokkeren met de hitte. Gedenatureerd BSA aspireert BSA-oplossing uit de kamers net voordat cellen worden geplateerd.

Plateer 10.000 cellen in een volume van twee milliliter in elke put van de doax-kamer. Gebruik het medium dat vereist is voor het specifieke celtype van keuze, laat de cellen vier uur lang aan de substraat hechten en zich verspreiden in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5%CO2, voer levende celbeeldvorming uit op een omgekeerde microscoop met fasecontrast met een 10 x objectief. De microscoop moet zijn uitgerust met een gesloten omgevingsbevochtigde kamer, waardoor de temperatuur op 37 graden Celsius en 5%CO2 kan worden geregeld tijdens langdurige beeldvorming.

Beeldvorming, nadat de cellen zich gedurende ongeveer 3,5 uur hebben verspreid, zet de plaat in de microscoopkamer. Laat de monsters gedurende 30 minuten in de kamer gelijkwaardig worden. Stel geautomatiseerde multi-punt bezoeken op de microscoop in als dat beschikbaar is.

Richt u op de interface tussen de PDMS en de glasdekglas en kies punten om rond de interface te beeldvormen. Met een gemiddelde van 40 punten per Durex-kamerbeeld, worden de cellen elke 10 minuten gedurende maximaal 16 uur opgenomen, het gebied van belang zal verschijnen als twee lijnen, waarbij de buitenste lijn overeenkomt met de rand van het dekglas en de binnenste lijn overeenkomt met de werkelijke interface tussen de PDMS en het dekglas. Om de gegevens te analyseren, genereert u een spreadsheet zoals degene die in het tekstprotocol wordt getoond.

Tel het aantal kruisgebeurtenissen van de PDMS naar het glazen oppervlak en vice versa vanuit elke gegenereerde film. Een kruisgebeurtenis wordt gedefinieerd als het passeren van de celkern over de grens tussen de PDMS en het glas in beide richtingen. Noteer het aantal kruisgebeurtenissen in de juiste kolom in het Excel-spreadsheet om meerdere oversteken te kwantificeren.

Tel het aantal keren dat de cel de interface overstak. Dat aantal moet worden genoteerd in de Excel-kolom die over