Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een vereenvoudigd systeem voor de analyse van celdurotopie, waarbij veel zoogdiercellen bij voorkeur migreren naar een stijvere ondergrond. Dit wordt bereikt door eerst Polydimethylsiloxaan- of PDMS-substraten van een gedefinieerde stijfheid voor te bereiden. Vervolgens wordt het geprepareerde PDMS in elke put van een zes-putjesplaat gegoten en worden eventuele luchtbellen verwijderd.

De Durotaxis-kamers worden vervolgens voltooid door in elke put een gesteriliseerd dekglas bovenop het PDMS te plaatsen om een overlay te creëren. De laatste stap is het inzaaien van cellen in de Durotaxis-kamers met een dichtheid die de cellen voldoende ruimte geeft om te migreren zonder significante interacties met andere cellen. Uiteindelijk wordt live-cell microscopie gebruikt om de as in migrerende cellen te bestuderen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals polyacrylamide, is dat er een enkele overgang is tussen het zachte PDMS en het rigide glas in plaats van gradiëntgel-alternatieven. Daarnaast is het coaten van PDMS met componenten van de extracellulaire matrix, zoals fibronectine, niet afhankelijk van chemische cross-linking, wat wel vereist is voor polyacrylamidegels. Om één weefselkweekplaat met zes putjes voor te bereiden, weegt u eerst het saldo af met een conische buis van 50 milliliter.

Weeg ongeveer 10 gram van de polydimethylsiloxaan of PDMS-basisoplossing af in de buis van 50 milliliter. Voor een substraatverhouding van 90:1 wordt het gemeten gewicht van de PDMS-basisoplossing gedeeld door 90. Om de juiste hoeveelheid benodigde crosslinkerosolutie te bepalen, voegt u de berekende hoeveelheid PDMS-crosslinkerosolutie toe aan de buis en mengt u het PDMS-basis-crosslinker-mengsel vijf minuten lang krachtig bij kamertemperatuur.

Het mengsel bevat op dit moment, door het gebruik van een kleine spatel, een klein aantal luchtbellen. Centrifugeer het PDMS-substraat in een tafelcentrifuge gedurende vijf minuten bij 50 ×g. Laat het mengsel op kamertemperatuur komen om eventuele resterende bellen te verwijderen.

Pipetteer na de vijf minuten opnieuw centrifugeren één milliliter van het 90:1 PDMS-substraat in elke put van de met weefselkweek behandelde zes-wellplaat. Eventuele resterende luchtbellen in het PDMS kunnen in deze fase worden verwijderd door ze met een 21 gauge naald door te prikken.

Laat het PDMS 30 minuten verspreiden in de put. Kook vervolgens 12 millimeter glazen dekglasjes nummer één gedurende vijf minuten in gedestilleerd water, in totaal drie keer. Plaats één gedroogd dekglasje in elke put van de weefkweekplaat door voorzichtig één zijde van het dekglas aan te raken.

Glijd in de PDMS-oplossing en laat vervolgens het dekglas op de PDMS vallen. Terwijl het dekglas neerdaalt, zal de PDMS over de randen van het dekglas beginnen te vloeien, maar zal het niet volledig bedekken. Dit zal na uitharding een interface creëren tussen de PDMS en het glas.

Incubeer de plaat 16 uur lang bij 70 °C in een oven om de PDMS te uitharden. Plaats de plaat vervolgens in een celkweekkap en steriliseer deze 10 minuten lang met UV-licht. Coat elke durox-kamer gedurende één uur bij 30 °C met één milliliter fibronectine in fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium.

Zorg ervoor dat het gehele oppervlak is ondergedompeld in de fibronectine-oplossing in PBS. Bereid hitte-gedenatureerd 1% runder serumalbumine of BSA door 0,5 gram BSA af te wegen en op te lossen in 50 milliliter PBS-filter. Steriliseer een oplossing door een 0,22 micron filter voordat deze 12 minuten lang wordt verhit bij 80 °C.

Aspireer vervolgens de fibronectine-oplossing en was de kamers drie keer met PBS. Voeg één milliliter hitte-gedenatureerd BSA in PBS toe aan elke well en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur, trypsiniseer en tel de gewenste cellen terwijl de durex-kamers worden geblokkeerd met het hitte-gedenatureerde BSA. Aspireer de BSA-oplossing uit de kamers vlak voor het uitplaten van de cellen.

Plateer 10.000 cellen in een volume van twee milliliters in elke put van de doax-kamer. Gebruik het medium dat vereist is voor het gekozen celtype en laat de cellen vier uur lang hechten en spreiden op het substraat in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5%CO2; voer vervolgens live-cell imaging uit op een omgekeerde microscoop met fasecontrast en een 10 x objectief. De microscoop dient te zijn uitgerust met een gesloten, bevochtigde omgevingskamer, waardoor de temperatuur bij 37 °C en 5%CO2 tijdens langdurige imaging kan worden gecontroleerd.

Beeldvorming: nadat de cellen ongeveer 3,5 uur de tijd hebben gehad om uit te spreiden, wordt de plaat in de microscoopkamer geplaatst. Laat de monsters 30 minuten equilibreren in de kamer. Stel, indien beschikbaar, het geautomatiseerde multi-point visiting op de microscoop in.

Focus op de interface tussen de PDMS en het glazen dekglas en kies punten om rondom de interface te imagen. Met een gemiddelde van 40 punten per Durex-kamerbeeld, waarbij de cellen elke 10 minuten gedurende maximaal 16 uur worden vastgelegd, zal het interessegebied verschijnen als twee lijnen, waarbij de buitenste lijn overeenkomt met de rand van het dekglas en de binnenste lijn overeenkomt met de feitelijke interface tussen de PDMS en het dekglas. Om de gegevens te analyseren, maakt u een spreadsheet zoals die wordt getoond in het tekstprotocol.

Tel het aantal oversteekgebeurtenissen van het PDMS naar het glasoppervlak en vice versa voor elke gegenereerde film. Een oversteekgebeurtenis wordt gedefinieerd als het passeren van de celkern over de grens tussen het PDMS en het glas in beide richtingen. Noteer het aantal oversteekgebeurtenissen in de juiste kolom van het Excel-spreadsheet om meervoudige oversteekmomenten te kwantificeren.

Tel het aantal keren dat de cel de interface is overgestoken. Dit aantal moet worden genoteerd in de Excel-kolom die overeenkomt met het substraat waarop de cel zich aan het einde van de video bevond. Herhaal de analyse voor elke cel die in de video de interface oversteekt.

Sluit cellen uit die tijdens de beeldvorming buiten het gezichtsveld migreren. Bereken het percentage cellen dat van PDMS naar het glasoppervlak is gemigreerd en dus durotaxis heeft ondergaan. Doe dit als volgt.

Tel het aantal oversteekgebeurtenissen van zacht naar hard en de meervoudige oversteekgebeurtenissen die op hard eindigden op, en deel dit door het totale aantal oversteekgebeurtenissen. Bereken het percentage meervoudige oversteekgebeurtenissen door het totaal van de meervoudige oversteekgebeurtenissen te delen door het totale aantal oversteekgebeurtenissen om het moleculaire mechanisme te beginnen begrijpen waarmee cellen reageren op mechanische signalen in hun omgeving. Specifieke eiwitten kunnen worden uitgeschakeld met behulp van IRNA, zoals hier wordt getoond.

Ongeveer 70% van de met irna behandelde controlecellen vertoonden axxis. In schril contrast hiermee hadden de cellen geen voorkeur voor migratie naar het harde of zachte substraat wanneer CD gap met RNAi werd uitgeschakeld. Bovendien staken de cellen met CD gap-knockdown de grens herhaaldelijk over.

Terwijl controle-irna-behandelde cellen over het algemeen de grens slechts één keer overschrijden, laten representatieve tracks van controle-irna-cellen zien dat de cellen over het algemeen één keer de grens oversteken en bij voorkeur op het stijvere oppervlak blijven in vergelijking met CD-gap. Irna-behandelde cellen vertoonden geen voorkeur voor een bepaalde stijfheid en staken de grens meerdere malen over.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de PDMS-substraten bereidt, de DURIS-kamers assembleert en de DUR-belastingen kwantificeert.