Name: Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Leer een vereenvoudigde methode om celdurotaxis te bestuderen met behulp van PDMS-substraten met gedefinieerde stijfheid. Dit systeem maakt live-celmicroscopie mogelijk om migratiegedrag te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH R01 GM47607, CA163296 en NSF 1.334.493 te CET. Wij danken de leden van de Turner lab voor kritische lezing van het manuscript. Alle in dit rapport gegevens werden overgenomen met toestemming van Wormer et al. 2014 11.

1. Voorbereiding van Durotaxis Chambers <ol><li> Een 6-well weefselkweek plaat voor te bereiden, tarra de balans met een 50 ml conische buis. Weeg ongeveer 10 g PDMS basisoplossing in de 50 ml buis (de oplossing vrij viskeus). </li><li> Voor een 90: 1 substraat (Overeenstemming van ~ 1 kPa), verdeel het gemeten gewicht van de PDMS basisoplossing in de buis 90 door de juiste hoeveelheid verknopingsmiddel oplossing nodig te bepalen. Voeg de berekende hoeveelheid PDMS crosslinker oplossing dezelfde buis. Voorbeeld: 10 g / 90 = 0,11 g. Voeg 0,11 g PDMS crosslinker oplossing van het PDMS basisoplossing. Opmerking: De basis en crosslinker oplossingen zijn beide voorzien in het PDMS kit. </li><li> Krachtig mengen de PDMS base / crosslinker mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met een kleine spatel. In dit stadium zal het mengsel een groot aantal luchtbellen bevatten. </li><li> Centrifugeer de PDMS substraat in een benchtop centrifuge gedurende 5 minuten bij 50 xg bij kamertemperatuur om het verwijderen bubBles. Als er nog steeds belletjes na 5 min, centrifuge opnieuw. </li><li> Pipetteer 1 ml van 90: 1 PDMS substraat in elk putje van weefselkweek behandelde 6-wells plaat. Eventuele resterende luchtbellen aanwezig in het PDMS kan in dit stadium worden geëlimineerd door popping ze met behulp van een 21 G naald. Laat de PDMS spreiden gedurende 30 min in de put. </li><li> Kook 12 mm glazen dekglaasjes # 1 in gedestilleerd water gedurende 5 min. Herhaal tweemaal en bewaar de dekglaasjes in gedistilleerd water. </li><li> Plaats een gedroogd dekglaasje in elk putje van de weefselkweekplaat door voorzichtig aanraken van één kant van het dekglaasje in het PDMS oplossing dan vallen het dekglaasje op het PDMS. Aangezien het dekglaasje afwikkelt, zal de PDMS beginnen te tasten over de randen van het dekglaasje, maar niet volledig bedekken. Dit zal een interface tussen de PDMS en glazen na uitharding te genereren (zie Figuur 1A, B). </li><li> Incubeer de plaat bij 70 ° C in een oven gedurende 16 uur om uit te harden (harden) het PDMS. Leg het plate in een celkweek kap en UV steriliseren 10 min. NB: Het beste is om de platen te maken binnen een paar dagen van gebruik. Echter de platen in Parafilm gewikkeld zonder buffer en opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken zonder merkbare vermindering van de kwaliteit. </li></ol> 2. Cell Plating Opmerking: Als het bestuderen van het effect van siRNA-gemedieerde knockdown Voer de knockdown volgens de instructies van de fabrikant of geoptimaliseerd protocol voor het celtype gekozen. <ol><li> Coat elk durotaxis kamer met 1 ml van 10 ug / ml fibronectine in PBS zonder calcium en magnesium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Alternatief kan de fibronectine worden toegepast op de dag voorafgaand aan analyse door het incuberen van de PDMS met 10 ug / ml fibronectine in PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak is ondergedompeld in de fibronectine in PBS oplossing. </li><li> Bereid hitte-gedenatureerd 1% BSA. Weeg 0,5 g BSA en oplossen in 50 ml PBS.Filter steriliseren van de oplossing door een 0,22 urn filter en verwarm bij 80 ° C gedurende 12 min. Opmerking: Bereid deze oplossing de dag voorafgaand aan plateren en opslag cel bij 4 ° C. </li><li> Zuig het fibronectine oplossing en was 3 maal met PBS. Voeg 1 ml van hitte gedenatureerd BSA in PBS aan elk putje en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> Trypsinize en te tellen cellen van keuze, terwijl de durotaxis kamers blokkeren met de hitte gedenatureerd BSA. </li><li> Plaat 1 x 10 5 cellen in een volume van 2 ml in elk putje van de durotaxis kamer via de media die voor het specifieke celtype naar keuze. Laat de cellen te hechten en verspreiden op het substraat 4 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2. OPMERKING: U2OS cellen worden routinematig aangehouden in DMEM met 10% FBS, aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, en 10 IU / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine. Opmerking: Het aantal cellen in dit voorbeeld is geoptimaliseerd voorU2OS cellen. Optimalisatie voor andere celtypen vereist zijn. Deze dichtheid geeft de cellen voldoende ruimte te migreren zonder significante interacties met andere cellen. </li></ol> 3. live-cell imaging <ol><li> Live cell imaging op een omgekeerde microscoop, met behulp van fase contrast met een 10x doelstelling. De microscoop moet worden voorzien van een afgesloten milieu, bevochtigde kamer, waardoor temperatuurregeling bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende langdurige imaging. </li><li> Nadat de cellen hebben verspreid voor ongeveer 3,5 uur, de montage van de plaat in de microscoop kamer. Laat het monster (s) equilibreren in de kamer gedurende 30 min. </li><li> Het opzetten van geautomatiseerde, multi-point een bezoek op de microscoop, indien beschikbaar. Richten zich op het raakvlak tussen de 90: 1 PDMS en het glas dekglaasje en kies punten om de afbeelding rondom de interface met een gemiddelde van 40 punten per durotaxis kamer. Afbeelding de cellen elke 10 minuten gedurende maximaal 16 uur. OPMERKING: Het opnieuwgion plaats verschijnt als twee lijnen met de buitenste lijn overeenkomt met de rand van het dekglaasje en de binnenleiding voor het werkelijke interface tussen de PDMS en het dekglaasje. Zie figuur 1B. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Genereer een spreadsheet zoals in tabel 1. </li><li> Tel het aantal events oversteek van de PDMS het glasoppervlak en vice versa van elke film gegenereerd. Noteer het aantal kruising gebeurtenissen in de juiste kolom in het Excel-spreadsheet. Opmerking: Een kruising event wordt gedefinieerd als de celkern die over de grens tussen de PDMS en glas in beide richtingen. </li><li> Om meerdere kruisingen kwantificeren, tel het aantal keren dat de cel stak de interface. Dit aantal dient te worden geregistreerd in de kolom excel overeenkomt met het substraat waarop de cellen werd aan het einde van de film. Herhaal de analyse voor elke cel die de interface kruisen in tHij film. Uitsluiten cellen die migreren uit het gezichtsveld tijdens de beeldvorming. Opmerking: Het is van belang om, door cellen te tellen bij het begin van het experiment dat de cellen kunnen eveneens hechten aan de met fibronectine gecoate PDMS en glazen dekglaasje oppervlakken. </li><li> Bereken het percentage cellen dat gemigreerd van PDMS het glasoppervlak (dwz onderging durotaxis). Voeg het aantal oversteken gebeurtenissen van zacht naar hard en de meervoudige kruising gebeurtenissen die eindigde op harde en delen door het totaal aantal kruising evenementen. </li><li> Bereken het percentage meervoudige kruisingen door het aantal meervoudige kruisingen door het totaal aantal kruisingen. </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Hierin beschrijven we een eenvoudige test om durotaxis bestuderen migrerende cellen. Een grote kracht van deze test is het gemak van de voorbereiding van de durotaxis kamers met behulp van PDMS. De stijfheid van de substraten kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door de verhouding van PDMS base oplossing verknopingsmiddel voor de studie van diverse starheid in de test toe. Echter, een mogelijke beperking van het systeem is dat cellen alleen worden blootgesteld aan een enkele verandering in substraat stijfheid tegenst...

De extracellulaire matrix (ECM) bestaat uit een complexe reeks van structurele en verknopen van proteïnen zoals collageen, fibronectine en laminine. Hoewel het goed is vastgesteld dat de ECM levert belangrijke structurele steun voor cellulaire weefsels, is er steeds meer bewijs om aan te geven dat cellen actief inspelen op de fysieke veranderingen in hun ECM-omgeving om diverse cellulaire processen zoals overleving van de cel, differentiatie en celmigratie reguleren. Zo kunnen verschillen in stijfheid van de ECM mesenchymale stamcellen rijdt richting verschillende geslachten, met zachte substraten (~ 1 kPa) bevordering neurogene lineages terwijl stijve (~ 25 kPa) substraten te bevorderen osteogene differentiatie 1. Ook is een toename van de stromale matrix stijfheid aangetoond mammaire epitheelcellen tumorigenese en invasie in het omringende weefsel 2,3 promoten. Een bijzonder interessant aspect van deze mechanosignaling activiteit leidt tot een proces dat durotaxis, waarbij cellen preferentieel migreren naar een stijver substraat 4,5. Cellen constant zin de fysische eigenschappen van de extracellulaire omgeving via integrine receptor binding aan de ECM. Dit bevordert op zijn beurt de ophoping van talrijke structurele en signaaleiwitten hun cytoplasmatische domeinen van de vorming van lijm structuren bekend als focale adhesies of focale contacten 6,7 drijven. Omdat integrinen zijn geen inherente enzymatische activiteit worden signalen doorgegeven vanuit het ECM door deze additionele eiwitten de reactie van de cel om hun veranderende omgeving 8 coördineren. Dienovereenkomstig is de identificatie en karakterisering van de belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij het reguleren mechanosignaling en durotaxis is een belangrijk onderzoeksgebied. Verschillende modelsystemen ontwikkeld studeren durotaxis in vitro, maar de meeste hebbengebruikt met collageen beklede substraten polyacrylamide 4. Echter, de bereiding van de polyacrylamide substraten technische uitdaging en collageen die in deze testen moeten chemisch verknoopt aan het substraat 9 zijn. Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten bleken vergelijkbare mechanische eigenschappen vertonen om de substraten 10 polyacrylamide. Echter PDMS substraten bereid door eenvoudig mengen van een verhouding van de base om verknopingsmiddel en deze substraten kunnen worden bekleed met ECM eiwitten zonder chemische verknoping, waardoor PDMS makkelijker instrument om de effecten van starheid celgedrag bestuderen. Hierin beschrijven we hoe een eenvoudige durotaxis kamer waarin een zachte PDMS substraat is geïntegreerd met een stijve glazen dekglaasje bereiden. De test, zoals hieronder wordt uiteengezet, verschaft een snelle en eenvoudige methode om durotaxis bestuderen. Voor deze studie gebruikten we de menselijke U2OS osteosarcoomcellen gecombineerd met siRNA-gemedieerdeknockdown van cdGAP om de rol van deze focale adhesie eiwit bestuderen durotaxis 11. Belangrijk is, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast aan de individuele behoeften. Andere celtypen kunnen worden gesubstitueerd voor de U2OS cellen en elk eiwit kan worden neergeslagen of overexpressie gebracht om de effecten op celgedrag tijdens durotaxis bepalen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan fluorescent gemerkte eiwitten te nemen om hun dynamiek en gedrag met behulp van FRAP of FRET benaderingen te analyseren.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td></tr><tr><td>#1 Cover glass 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de cel mechanosensing en durotaxis<em&gt; in vitro</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

De samenstelling en de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix sterk uiteen weefseltypen. Dit bindweefsel stroma diversiteit grote invloed cel gedrag normaal en pathologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie, hechting signalering en directionele migratie te reguleren. In dit verband, het aangeboren vermogen van bepaalde celtypen migreren naar een stijver of minder compatibele matrix substraat wordt genoemd durotaxis. Dit fenomeen speelt een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling, wondgenezing en kankercel invasie. We beschrijven hier een eenvoudige test om durotaxis studie, in vitro, met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten. Bereiding van de beschreven durotaxis kamers creëert een stijfheid interface tussen de relatief zachte gel PDMS en een stijf glazen dekglaasje. In het voorbeeld hebben we deze durotaxis kamers gebruikt om een ​​rol voor de Cdc42 tonen / Rac1 GTPase activerende protein, cdGAP in mechanosensing en durotaxis regelgeving in menselijke U2OS osteosarcoomcellen. Deze test is gemakkelijk aan te passen aan andere typen cellen en / of knock-down van andere eiwitten van de belangen van hun respectieve rollen verkennen in mechanosignaling en durotaxis.

Een schema van de durotaxis kamer wordt getoond in figuur 1A. Soft PDMS substraat (een 90: 1 mengsel van PDMS base oplossingen verknopingsmiddel) is verdeeld in een 6 putjes en een glazen dekglaasje geplaatst bovenop de PDMS, die vervolgens gedeeltelijk bedekt het bovenoppervlak van het dekglaasje waardoor een interface creëren tussen de twee substraten van verschillende compliance. De stijfheid van het zachte PDMS substraat ~ 1 kPa, vergelijkbaar met de typische naleving van hersenweefsel, terwijl de s...

Veel zoogdiercellen migreren bij voorkeur naar een stijvere matrix of substraat via durotaxie. Het doel van dit protocol is om een eenvoudig in vitro systeem te bieden dat kan worden gebruikt om cel durotaxie gedragingen te bestuderen en te manipuleren door het opnemen van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten van gedefinieerde stijfheid, in combinatie met glazen dekglasjes.

Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een vereenvoudigd systeem voor de analyse van celdurotopie, waarbij veel zoogdiercellen bij voorkeur migreren naar een stijvere ondergrond. Dit wordt bereikt door eerst Polydimethylsiloxaan- of PDMS-substraten van een gedefinieerde stijfheid voor te bereiden. Vervolgens wordt het geprepareerde PDMS in elke put van een zes-putjesplaat gegoten en worden eventuele luchtbellen verwijderd.De Durotaxis-kamers worden vervolgens voltooid door in elke put een gesteriliseerd dekglas bovenop het PDMS te plaatsen om een overlay te creëren. De laatste stap is het inzaaien van cellen in de Durotaxis-kamers met een dichtheid die de cellen voldoende ruimte geeft om te migreren zonder significante interacties met andere cellen. Uiteindelijk wordt live-cell microscopie gebruikt om de as in migrerende cellen te bestuderen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals polyacrylamide, is dat er een enkele overgang is tussen het zachte PDMS en het rigide glas in plaats van gradiëntgel-alternatieven. Daarnaast is het coaten van PDMS met componenten van de extracellulaire matrix, zoals fibronectine, niet afhankelijk van chemische cross-linking, wat wel vereist is voor polyacrylamidegels. Om één weefselkweekplaat met zes putjes voor te bereiden, weegt u eerst het saldo af met een conische buis van 50 milliliter.Weeg ongeveer 10 gram van de polydimethylsiloxaan of PDMS-basisoplossing af in de buis van 50 milliliter. Voor een substraatverhouding van 90:1 wordt het gemeten gewicht van de PDMS-basisoplossing gedeeld door 90. Om de juiste hoeveelheid benodigde crosslinkerosolutie te bepalen, voegt u de berekende hoeveelheid PDMS-crosslinkerosolutie toe aan de buis en mengt u het PDMS-basis-crosslinker-mengsel vijf minuten lang krachtig bij kamertemperatuur.Het mengsel bevat op dit moment, door het gebruik van een kleine spatel, een klein aantal luchtbellen. Centrifugeer het PDMS-substraat in een tafelcentrifuge gedurende vijf minuten bij 50 ×g. Laat het mengsel op kamertemperatuur komen om eventuele resterende bellen te verwijderen.Pipetteer na de vijf minuten opnieuw centrifugeren één milliliter van het 90:1 PDMS-substraat in elke put van de met weefselkweek behandelde zes-wellplaat. Eventuele resterende luchtbellen in het PDMS kunnen in deze fase worden verwijderd door ze met een 21 gauge naald door te prikken.Laat het PDMS 30 minuten verspreiden in de put. Kook vervolgens 12 millimeter glazen dekglasjes nummer één gedurende vijf minuten in gedestilleerd water, in totaal drie keer. Plaats één gedroogd dekglasje in elke put van de weefkweekplaat door voorzichtig één zijde van het dekglas aan te raken.Glijd in de PDMS-oplossing en laat vervolgens het dekglas op de PDMS vallen. Terwijl het dekglas neerdaalt, zal de PDMS over de randen van het dekglas beginnen te vloeien, maar zal het niet volledig bedekken. Dit zal na uitharding een interface creëren tussen de PDMS en het glas.Incubeer de plaat 16 uur lang bij 70 °C in een oven om de PDMS te uitharden. Plaats de plaat vervolgens in een celkweekkap en steriliseer deze 10 minuten lang met UV-licht. Coat elke durox-kamer gedurende één uur bij 30 °C met één milliliter fibronectine in fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium.Zorg ervoor dat het gehele oppervlak is ondergedompeld in de fibronectine-oplossing in PBS. Bereid hitte-gedenatureerd 1% runder serumalbumine of BSA door 0,5 gram BSA af te wegen en op te lossen in 50 milliliter PBS-filter. Steriliseer een oplossing door een 0,22 micron filter voordat deze 12 minuten lang wordt verhit bij 80 °C.Aspireer vervolgens de fibronectine-oplossing en was de kamers drie keer met PBS. Voeg één milliliter hitte-gedenatureerd BSA in PBS toe aan elke well en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur, trypsiniseer en tel de gewenste cellen terwijl de durex-kamers worden geblokkeerd met het hitte-gedenatureerde BSA. Aspireer de BSA-oplossing uit de kamers vlak voor het uitplaten van de cellen.Plateer 10.000 cellen in een volume van twee milliliters in elke put van de doax-kamer. Gebruik het medium dat vereist is voor het gekozen celtype en laat de cellen vier uur lang hechten en spreiden op het substraat in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5%CO2; voer vervolgens live-cell imaging uit op een omgekeerde microscoop met fasecontrast en een 10 x objectief. De microscoop dient te zijn uitgerust met een gesloten, bevochtigde omgevingskamer, waardoor de temperatuur bij 37 °C en 5%CO2 tijdens langdurige imaging kan worden gecontroleerd.Beeldvorming: nadat de cellen ongeveer 3,5 uur de tijd hebben gehad om uit te spreiden, wordt de plaat in de microscoopkamer geplaatst. Laat de monsters 30 minuten equilibreren in de kamer. Stel, indien beschikbaar, het geautomatiseerde multi-point visiting op de microscoop in.Focus op de interface tussen de PDMS en het glazen dekglas en kies punten om rondom de interface te imagen. Met een gemiddelde van 40 punten per Durex-kamerbeeld, waarbij de cellen elke 10 minuten gedurende maximaal 16 uur worden vastgelegd, zal het interessegebied verschijnen als twee lijnen, waarbij de buitenste lijn overeenkomt met de rand van het dekglas en de binnenste lijn overeenkomt met de feitelijke interface tussen de PDMS en het dekglas. Om de gegevens te analyseren, maakt u een spreadsheet zoals die wordt getoond in het tekstprotocol.Tel het aantal oversteekgebeurtenissen van het PDMS naar het glasoppervlak en vice versa voor elke gegenereerde film. Een oversteekgebeurtenis wordt gedefinieerd als het passeren van de celkern over de grens tussen het PDMS en het glas in beide richtingen. Noteer het aantal oversteekgebeurtenissen in de juiste kolom van het Excel-spreadsheet om meervoudige oversteekmomenten te kwantificeren.Tel het aantal keren dat de cel de interface is overgestoken. Dit aantal moet worden genoteerd in de Excel-kolom die overeenkomt met het substraat waarop de cel zich aan het einde van de video bevond. Herhaal de analyse voor elke cel die in de video de interface oversteekt.Sluit cellen uit die tijdens de beeldvorming buiten het gezichtsveld migreren. Bereken het percentage cellen dat van PDMS naar het glasoppervlak is gemigreerd en dus durotaxis heeft ondergaan. Doe dit als volgt.Tel het aantal oversteekgebeurtenissen van zacht naar hard en de meervoudige oversteekgebeurtenissen die op hard eindigden op, en deel dit door het totale aantal oversteekgebeurtenissen. Bereken het percentage meervoudige oversteekgebeurtenissen door het totaal van de meervoudige oversteekgebeurtenissen te delen door het totale aantal oversteekgebeurtenissen om het moleculaire mechanisme te beginnen begrijpen waarmee cellen reageren op mechanische signalen in hun omgeving. Specifieke eiwitten kunnen worden uitgeschakeld met behulp van IRNA, zoals hier wordt getoond.Ongeveer 70% van de met irna behandelde controlecellen vertoonden axxis. In schril contrast hiermee hadden de cellen geen voorkeur voor migratie naar het harde of zachte substraat wanneer CD gap met RNAi werd uitgeschakeld. Bovendien staken de cellen met CD gap-knockdown de grens herhaaldelijk over.Terwijl controle-irna-behandelde cellen over het algemeen de grens slechts één keer overschrijden, laten representatieve tracks van controle-irna-cellen zien dat de cellen over het algemeen één keer de grens oversteken en bij voorkeur op het stijvere oppervlak blijven in vergelijking met CD-gap. Irna-behandelde cellen vertoonden geen voorkeur voor een bepaalde stijfheid en staken de grens meerdere malen over.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de PDMS-substraten bereidt, de DURIS-kamers assembleert en de DUR-belastingen kwantificeert.

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De ECIS / Taxi-systeem is een geautomatiseerde, real-time test die cellulaire chemotaxis meet. In deze assay cellen bewegen onder een laag van agarose om tot een doel elektrode. Cellulaire beweging wordt gemeten door het optreden van resistentie tegen wisselstroom 0.

Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis

Om nieuwe mutaties die de mechanosensatie beïnvloeden te identificeren, ontwierpen we een test die de gedragsreactie op tactiele stimulatie van vliegborsten meet in mutante klonen die gegenereerd zijn door de MARCM-methode. De combinatie van technieken maakt het mogelijk om mechanogevoelige mutaties te identificeren die anders dodelijk zouden zijn.

Een Behavioral Assay voor Mechanosensation van MARCM-gebaseerde klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Nieuwe hulpmiddelen voor het mechanobiology onderzoek nodig zijn om te begrijpen hoe mechanische spanning activeert biochemische paden en lokt biologische reacties. Hier presenteren we een nieuwe methode voor selectief mechanische stimulatie van geïmmobiliseerdet dieren met een val van de microfluidic waardoor hoge resolutie beeldvorming van cellulaire reacties.

Met behulp van een Microfluidics apparaat voor mechanische stimulatie en hoge resolutie Imaging van C. elegans

Presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, en de uitvoering daarvan om te sonderen cel mechanica zonder kralen in de Drosophila embryo.

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Het Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) platform automatiseert het proces van het gelijktijdig meten van een breed scala aan chemische en mechanische signalen in aanhangende cellen. iTACS is ontworpen om community-driven ontwikkeling te vergemakkelijken en onderzoekers in staat te stellen alle platformfuncties te gebruiken, ongeacht hun educatieve achtergrond.

Integratieve toolkit om cellulaire signalen te analyseren: krachten, beweging, morfologie en fluorescentie

Dit werk presenteert een flexibel protocol voor het gebruik van fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken (FLECS) -technologie in microwell-formaat voor vereenvoudigde, hands-off kwantificering van contractiele krachten met één cel op basis van gevisualiseerde verplaatsingen van fluorescerende eiwitmicropatronen.

Vereenvoudigde, high-throughput analyse van eencellige contractiliteit met behulp van microgepatterde elastomeren

Het huidige protocol beschrijft het ontwerp, de fabricage en de karakterisering van een microfluïdisch systeem dat in staat is om honderden Drosophila melanogaster-embryo's uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig te comprimeren met minimale tussenkomst van de gebruiker. Dit systeem maakt beeldvorming met hoge resolutie en herstel van monsters mogelijk voor poststimulatieanalyse en kan worden geschaald om plaats te bieden aan andere meercellige biologische systemen.

Mechanostimulatie van meercellige organismen via een microfluïdisch compressiesysteem met hoge doorvoer

Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.

Mechano-Node-Pore Sensing: een snel, labelvrij platform voor multi-parameter single-cell visco-elastische metingen

Leer een vereenvoudigde methode om celdurotaxis te bestuderen met behulp van PDMS-substraten met gedefinieerde stijfheid. Dit systeem maakt live-celmicroscopie mogelijk om migratiegedrag te analyseren.

Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis

Meer video's verkennen