Name: Productie van Nurr-1 Specifieke polyklonale antilichamen Vrij van Cross-reactiviteit tegen zijn naaste Homologen, Nor1 en Nur77 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Leer hoe u de specificiteit van antilichamen tegen homologe eiwitten verhoogt door kruisreactieve antilichamen te verwijderen via affiniteitschromatografie. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van eiwitdetectie aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies (NS070577 en NS084869).

Opmerking: De samenstelling van alle hieronder genoemde oplossingen kunnen worden gevonden in de Materials / Equipment Table. 1. Proteïne A kolom antilichaamzuivering <ol><li> Equilibreer een proteïne A-kolom spin en alle benodigde buffers tot kamertemperatuur gedurende 15 min voor het begin van de procedure. </li><li> Verdun het immune serum 1: 1 met Protein A IgG Binding Buffer. (5 ml serum wordt aanbevolen). </li><li> Tik voorzichtig een proteïne een spin-kolom op de bank boven naar elke hars die in de dop kan worden ingediend verjagen. Verwijder de dop en voorzichtig snap de bodem sluiting. Plaats de kolom in een 15 ml collectie buis en laat opslagoplossing uitlekken. </li><li> Voeg 5 ml Proteïne A IgG bindingsbuffer en laat de oplossing uitlekken. </li><li> Breng het verdunde immune serum op de kolom en verzamel de doorstroom. Voor het beste resultaat, voeg een monstervolume dat een concentratie van antilichamen bevat minder dan 80% van de antilichaambinding capacit de kolomy. </li><li> Was de kolom met 15 ml Proteïne A of IgG bindingsbuffer totdat de absorptie bij 280 nm lager is dan 0,1. </li><li> Voeg 100 pl neutralisatiebuffer vijf gemerkte verzamelbuizen. </li><li> Voeg 5 ml IgG Elution Buffer aan de Proteïne A-kolom en het verzamelen van 1 ml fracties in elk van de buizen met de 100 ui Neutralisatie Buffer. </li><li> Meet de absorptie van elke fractie bij 280 nm en een zwembad fracties met een absorptie van meer dan 0,5. Houd de samengevoegde fracties op ijs pas klaar voor dialyse. </li><li> Regeneratie van de kolom door toevoeging van 8 ml IgG Elution Buffer en laat de oplossing door de kolom. </li><li> Spoel de kolom met Proteïne A IgG bindoplossing tot eluens pH weer 7,4. </li><li> Sla de kolom door toevoeging van 5 ml opslagoplossing (0,02% natriumazide in PBS). Bij benadering 3 ml blijven de kolom cap bodem en zet het bovendeksel. Bewaar de kolom bij 4 ° C. </li><li> Bepaal de lengte of dialyseslang naar behoefte volgens de instructies van de fabrikant. Met behulp van 16 mm diameter platte buis gebruiken 5.47 cm van de buis lengte per ml oplossing worden gedialyseerd. Snij de buis en spoelen met PBS pH 7,4 gedurende 15 tot 30 min. </li><li> Vouwen en clip ene uiteinde van de dialyse tubing, breng de samengevoegde IgG-bevattende fracties dialyseslang geëquilibreerd in PBS pH 7,4 en sluit het andere uiteinde. </li><li> Dialyseer bij kamertemperatuur tegen 200 volumina PBS pH 7,4 gedurende 2 uur. </li><li> Wijzig de dialyse buffer (vers PBS pH 7,4) en dialyze nog eens 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Wijzig de dialyse buffer (vers PBS pH 7,4) en dialyseer gedurende de nacht bij 4 ° C. </li><li> Houd de gedialyseerde antilichaam oplossing bij 4 ° C tot klaar om de vereiste zuiveringsstappen. </li><li> Beoordeel de antilichaamconcentratie met behulp van de absorptie bij 280 nm en de molaire absorptiecoëfficiënt van antilichamen bij 280 nm van 210.000 M -1 cm -1 12. </li></ol> 2. Koppeling van LBD eiwitten AminoLink Coupling Resin <ol><li> Bereid twee kolommen, een voor Nor1 en de andere voor Nur77. Volg hetzelfde protocol voor beide eiwitten. </li><li> Ontdooi de eiwitten te koppelen aan de hars op ijs. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt en de absorptie ervan bij 280 nm 12. <ol><li> Alternatief, gebruik dan een eiwitbepaling assay zoals de bicinchoninezuur assay 13. Wanneer het eiwit wordt opgelost in een amine bevattende buffer dialyseren of bufferuitwisseling tegen de koppelingsbuffer. Wanneer het eiwit in een geschikte buffer (geen vrije amines) verdunnen 4-voudig in koppelingsbuffer. </li></ol></li><li> Gebruik 2 ml hars gedurende 2 mg eiwit. Alle stappen die volgen zijn voor 2 ml hars in een kolom 10 ml. Maximaal 10 mg eiwit worden gekoppeld per 1 ml hars (2 ml 1: 1 suspensie). </li><li> Bereid een 10 ml kolom door op een frit op de bodem en actief PBS pH 7,4 doorheen. Cap tHij bodem van de kolom en voeg 2 ml koppelingsbuffer. </li><li> Het gewenste volume van slurry (4 ml tot 2 ml hars) te verkrijgen aan de kolom, de onderste dop en laat de kolom drain. Spoel de kolom met in totaal 6 ml (3 hars-bedvolume) van koppelingsbuffer en laat de kolom uitlekken. Na de koppeling buffer is uitgelekt, vervangt de onderste dop. </li><li> Voeg 2-4 ml eiwit gesuspendeerd in koppelingsbuffer aan de kolom (houd een aliquot van de eiwitoplossing om de koppeling efficiëntie te evalueren door vergelijking van de eiwitconcentratie van het eluaat in stap 2,11 met behulp van de absorptie bij 280 nm of bicinchoninic assay) . Cap en meng uiteinde over uiteinde om een ​​homogene oplossing te hebben. </li><li> Weeg een lege 1,8 ml microcentrifugebuis en te verplaatsen naar de zuurkast. Overdracht NaCNBH3 (ongeveer 0,05 g) voorzichtig in de vooraf gewogen buizen. Sluit de buis en wegen van de buis met NaCNBH3. Laat de buis niet openen buiten de motorkap. </li><li> Gebaseerd op het gewicht vanNaCNBH3 overgebracht naar de buis maakt een 5 M door toevoeging van 1 M NaOH. Het molecuulgewicht van NaCNBH3 is derhalve 62,84 g 0,05 g gelijk is aan (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 mol) 7,96 x 10 -4 mol. Om een 5 M oplossing add (7,96 x 10 -4/5) 159 pi van 1 M NaOH te maken. </li><li> Meet het totale volume van de reactie van het nemen van de hars volume in aanmerking. Voeg 10 pl van 5 M NaCNBH3 per ml reactiemengsel. <ol><li> Bijvoorbeeld: voor een 4 ml reactievolume voeg 40 ul 5 M NaCNBH3. Voor 1 ml hars en 3 ml eiwit toegevoegd, het totale volume 4 ml. </li></ol></li><li> Cap de kolom en meng uiteinde over einde. Bevestig de kolom op een buis rotator en laat de reactie doorgaan gedurende de nacht bij 4 ° C. </li><li> In de ochtend, brengen de kolom aan de chemische motorkap en verwijder voorzichtig de dop zoals sommige gas kan hebben gevormd. Giet de kolom in een schone buis en sla het eluaat om het eiwit con metencentrering met de absorptie bij 280 nm werkwijze 12 of bicinchoninezuur assay en vergelijken met het uitgangsmateriaal eiwitconcentratie in stap 2.6. </li><li> Was de hars met 4 ml koppelingsbuffer en laat de kolom drain. </li></ol> 3. Blokkering Resterende Sites <ol><li> Was de hars met 4 ml buffer van quenching. Giet af en vervang de onderste dop. Voeg 2 ml buffer doven en de hars te schorten. </li><li> Het totale reactievolume beoordelen door het meten van het volume hars en het doven buffervolume voeg 10 pl van 5 M NaCNBH3 per ml reactievolume. </li><li> Meng voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 30 min end-over-end. Na 30 min, brengt de kolom in de zuurkast. Verwijder voorzichtig de bovenkant en verwijder de onderste dop en laat de kolom drain in een verspilling buis. </li><li> Was de kolom met 5 hars volumes wasoplossing. Controleer de wast de aanwezigheid van residuele eiwitten door meting abso het eluaat vanrbance bij 280 nm. Ontkoppelde eiwitten uit zijn gewassen door de hoge zoutconcentratie. </li><li> Was de hars met 6 ml ontgast PBS pH 7,4 dat 0,02% natriumazide. Houd de kolom bij 4 ° C totdat het nodig is. </li></ol> 4. Zuivering van specifieke antilichamen Nurr1 <ol><li> Spoel de Nur77 LBD combinatie kolom met 10 ml PBS pH 7,4 en laat de kolom drain. Cap de bodem van de kolom en plaats de uitgelekte Nur77 LBD gekoppelde kolom in een nieuwe 15 ml verzamelbuis. </li><li> Voeg 5 ml proteïne A gezuiverde anti-Nurr1 antilichamen cap de kolom en plaats op een rotator bij 4 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de bovenste en onderste kappen en laat de stroom door. Gereserveerd op ijs tot klaar om toe te voegen aan de Nor1 LBD gekoppeld kolom. </li><li> Spoel de Nor1 LBD combinatie kolom met 10 ml PBS pH 7,4 en laat de kolom drain. Cap de bodem van de kolom en plaats de Nor1 LBD gekoppelde kolom in een 15 ml verzamelbuis. </li><li> Voeg de doorstroming van het Nur77 LBD coupLED kolom cap de kolom en plaats op een rotator bij 4 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de bovenste en onderste kappen en laat de stroom door. </li><li> Meet de antilichaamconcentratie door meting van de absorptie bij 280 nm. </li></ol> 5. ELISA-gebaseerde analyse van gezuiverde anti-Nurr1 Antibody <ol><li> Voeg 100 ul proteïne (2,5 ug / ml) aan de putjes van een 96 putjesplaat. Bij testen 3 verschillende eiwitten, voeg 100 pl proteïne 1 aan putjes A1 H4, 100 pl proteïne 2, putjes A5 H8 en 100 pl proteïne 3 aan putjes A9 tot H12. Bedek de plaat en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was de beklede putjes tweemaal met 300 ul per putje van PBS pH 7,4 en voeg 300 ul van ELISA blokkeerbuffer het gehele antigeen beklede putjes en incubeer 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Terwijl de plaat blokkeert stelt een gewenste startpositie verdunning van gezuiverd anti-Nurr1 antilichaam (van 10 tot 100 ug / ml) in ELISA blokkerende buffer. </li><li> Na 2 h blokkering vervangen ELISA blok buffer met 100 pl vers ELISA blokbuffer aan alle putjes. </li><li> Voeg 100 gl verdunde gezuiverde anti-Nurr1 antilichaam aan alle putjes in rij A. In serie verdunde antilichamen door overdracht 100 pi oplossing van rij A in de putjes in rij B, gevolgd door overdracht 100 pi oplossing van rij tot rij B C voortzetting naar G. rij na het mengen van de oplossingen in de putten in rij G gooi de extra 100 ul. Wells in rij H ontvangt alleen de eerste 100 ul van het blokkeren van buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was de plaat drie (3) maal met 300 ui per putje van 0,05% Tween 20 in PBS pH 7,4 en dep de plaat om overmaat wasbuffer te verwijderen. </li><li> Voeg 100 ul van Horse Radish Peroxidase (HRP) geconjugeerd geit anti-konijn IgG verdund in ELISA blok buffer (1: 8000 verdunning; typische bereik is van 1: 5000 tot 1: 25.000). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was de plaat three (3) keer zoals beschreven in 5.6. Spoel alle wells door ze te vullen met 300 pl gedeïoniseerd water. Dep het overtollige water door het omkeren van de plaat op absorberend papier. </li><li> Voeg 100 ul van 3, 3 &#39;, 5, 5&#39; tetramethylbenzidine (verwarmd tot kamertemperatuur) aan alle putjes en incubeer 15-30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Stop de reactie door toevoeging van 50 ui 2 NH 2 SO 4. </li><li> Lees absorptie bij 450 nm af te trekken achtergrond bij 650 nm. </li></ol>

<ol><li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li>
<li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor%2C+NURR1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li>
<li>Zetterström, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li>
<li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li>
<li>Peña de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3%2Fnurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li>
<li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB%3ACBP-dependent+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li>
<li>Colón-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus%3A+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li>
<li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li>
<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li>
<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het succes van dit protocol is gebaseerd op de beschikbaarheid van zuivere eiwitten voor karakterisering van de antilichamen opgewekt tegen een specifiek lid van de eiwitfamilie plaats. Er is geen noodzaak om de antilichamen onder gebruikmaking van proteïne A / G totdat duidelijk is vastgesteld dat er significante kruisreactiviteit met ELISA en Western blotting zuiveren. Zoals in de tekst, is het belangrijk om te voorkomen suspenderen het eiwit (en) worden verknoopt aan de kolom in een amine...

De transcriptiefactor Nurr1 en homologen (Nur77 en Nor1) behoren tot de nucleaire receptor subfamilie 4A (NR4A) 1. Ze zijn ook weesreceptoren omdat hun endogene liganden nog niet zijn geïdentificeerd. Nurr1 werd eerst gekloneerd in 1992 en hoewel bekend is tot expressie in de hersenen 2, werd de essentiële rol voor de ontwikkeling en instandhouding van middenhersenen dopamineneuronen blijkt uit knockout muizen studies 3. Daarnaast werd de belangrijke rol voor het behoud van middenhersenen dopamineneuronen onlangs aangetoond door een conditionele knockout studie 4. Door deze elegante studies tonen Nurr1 kritische rol voor middenhersenen dopamine neuronen, zijn vele verdere studies grotendeels gericht op het dopaminesysteem neuronen en dopamine-gerelateerde neurodegeneratieve stoornis, ziekte van Parkinson (PD) 5. Met name Nurr1 zich niet alleen in de middenhersenen dopamine (MDA) neuronen, maar ook in divers hersengebieden 2, suggereert dat het functionele rol in veel niet-DA gebieden die sterk wordt ondersteund door recente studies aantonen dat Nurr1 speelt een belangrijke rol in diverse hersenfuncties kan hebben. Voor voorbeelden werd aangetoond dat geheugen inducerende activiteiten zoals leren of andere hippocampus-afhankelijke taken resulteert in opwaartse regulatie van Nurr1 expressie in de hippocampus 6,7. Bovendien neerhalen van Nurr1 expressie in de hippocampus was de houdbaarheid op lange termijn geheugen en / of synaptische plasticiteit 8-11 aantasten, wat sterk suggereert dat Nurr1 speelt diverse rollen in verschillende hersengebieden. Dus, met als doel de celtype-specifieke en subcellulaire expressie van Nurr1, is het wenselijk Nurr1-specifieke antilichamen die geen kruis-reactiviteit vertonen met homologen Nur77 of Nor1 gebruiken. Dit artikel beschrijft een pre-adsorptie protocol om Nurr1-specifieke antilichamen en presenteren aanvullende gegevens toont zijn specificiteit te genereren.

<table><tbody><tr><td>Gezuiverde ligand-binding domein van Nurr1, Nor 1 en Nur77</td><td></td><td></td><td>Colomm Opslagoplossing</td></tr><tr><td>AminoLink koppelingshars en kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Protein A spinkolom</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-wels platen met platte bodem, hoge rand, 330 &mu;l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Normaal Geitenserum</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Melk Diluent/ Blokkeer Concentraat&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elutie Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Eiwit Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Paarden Radish Peroxidase geconjugeerd Geiten anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Hars</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Protein A IgG Binding Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elutie Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Colomm Opslagoplossing</td><td></td><td></td><td>Fosfaat Buffered Saline met 0,02% natriumazid</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 voorbehandelde dialysebuizen</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Wegwerp kolommen</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink koppelingsbuffer</td><td></td><td></td><td>0,1M natriumfosfaat, 0,05% NaN3, pH 7,0</td></tr><tr><td>Dempingsbuffer</td><td></td><td></td><td>1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH 7,4</td></tr><tr><td>Wasoplossing</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, 0,05% NaN3</td></tr><tr><td>ELISA Blokkeer buffer</td><td></td><td></td><td>1% Normaal Paardenserum (NHS), 1% Normaal Geitenserum (NGS) in 1X KPL melkdiluent</td></tr><tr><td>Opslagoplossing</td><td></td><td></td><td>PBS pH 7,4 met 0,02% natriumazid</td></tr><tr><td>Micropipetten: 10 &mu;l; 20 &mu;l; 200 &mu;l; 1000 &mu;l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

productie van nurr-1 specifieke polyklonale antilichamen vrij van cross-reactiviteit tegen zijn naaste homologen, nor1 en nur77

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

De nucleaire receptor subfamilie 4 (NR4A) bestaat uit 3 gerelateerde eiwitten die een DNA-bindend domein (DBD) en een ligand-bindend domein (LBD) delen. Het nucleair receptorgerelateerd 1-eiwit (Nurr1 of NR4A2) speelt een sleutelrol bij het onderhoud van het dopaminerge systeem. Dopamine-disfuncties geassocieerd met het Nurr1-gen omvatten onder meer de ziekte van Parkinson, schizofrenie en manisch-depressieve stoornis. Bovendien geeft recent bewijs aan dat Nurr1 ook in andere hersengebieden zoals de hippocampus wordt tot expressie gebracht en een cruciale rol speelt voor leren en geheugen. De andere leden van de familie zijn nerve growth factor IB (Nur77 of NR4A1) en neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 of NR4A3). Om de precieze functionele rollen van Nurr1 in dopaminerge en andere hersengebiedgerelateerde neuronale disfuncties te onderzoeken, waren antilichamen nodig die geen kruisreactiviteit vertonen tegen Nur77 en NOR1. Aangezien de eiwitten meer divergent zijn in hun LBD's dan in hun DNA-bindende domeinen, zou immunisatie met gezuiverde LBD's antilichamen opleveren die specifiek zijn voor Nurr1 met minimale reactiviteit tegen Nur77 en/of NOR1. Hoewel anti-Nurr1-antilichamen met succes werden gegenereerd, vertoonden deze significante immunoreactiviteit tegen de andere leden van de familie. Affiniteitschromatografie over geïmmobiliseerd Protein A gevolgd door pre-adsorptie tegen geïmmobiliseerde Nur77 en NOR1 LBD's leverde Nurr1-specifieke antilichamen op die vrij waren van kruisreactiviteit. Hier richten we ons selectief op antilichamen tegen een specifiek lid van een sterk geconserveerde familie van eiwitten door dieren te immuniseren met hun meest divergente regio's, gevolgd door het verwijderen van kruisreactieve antilichamen door pre-adsorptie. Het doel van het protocol is om de specificiteit van polyklonale antilichamen te verhogen door pre-adsorptie tegen kruisreactieve antigenen.

Een vergelijking van proteïne A-kolom gezuiverd Nurr1-specifieke antilichamen met proteïne A gezuiverde anti-Nurr1 antilichamen, gevolgd door het door Nur77 LBD en Nor1 LBD kolommen in figuur 1. Zoals blijkt, proteïne-A gezuiverde Nurr1 antilichaam vertoonde een sterke binding om Nurr1 LBD. Toch bleek ook significante binding aan Nur77 LBD en Nor1 LBD. Als eiwit-A gezuiverde Nurr1 antilichamen werden verder gezuiverd met Nur77 LBD en Nor1 LBD, de uiteindelijke affiniteit gezuiverde antilichamen die Nurr...

Hier targeten we selectief antilichamen tegen een specifiek lid van een sterk geconserveerde familie van eiwitten door dieren te immuniseren met hun meest uiteenlopende regio's, gevolgd door het verwijderen van kruisreactieve antilichamen door middel van pre-adsorptie.

Productie van Nurr-1 Specifieke polyklonale antilichamen Vrij van Cross-reactiviteit tegen zijn naaste Homologen, Nor1 en Nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

Het algemene doel van deze procedure is om de specificiteit van antilichamen tegen nauw verwante eiwitten te verhogen door kruisreagerende antilichamen te verwijderen. Dit wordt bereikt door eerst de eiwitdomeinen met de grootste divergentie tussen homologe eiwitten te identificeren. De tweede stap is het tot expressie brengen en zuiveren van deze eiwitdomeinen.Vervolgens worden deze proteïnedomeinen via de N- of C-terminus gekoppeld aan een chromatografiematrix. In deze demonstratie wordt Spheros gebruikt. De laatste stap bestaat uit het incuberen van immuunserum met harsen die gekoppeld zijn aan elk kruisreactief domein.Uiteindelijk worden Eliza en Western blotting uitgevoerd om de effectiviteit van de procedure te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van monoclonale antilichamen of affiniteitszuivering, is dat we de affiniteit voor het gewenste doelwit kunnen behouden terwijl bekende kruisreactieve epitopen worden geëlimineerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat het eiwit dat zij proberen te bestuderen instabiel is.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Uri Kim, een postdoctoral fellow uit ons laboratorium. Deze studie vereist twee kolommen, één voor de neuron-afgeleide weesreceptor (nor1) en de andere voor NER-groeifactor IB (nor77). Aangezien hetzelfde protocol van toepassing is op beide eiwitten, zal alleen de preparatie van één kolom worden gedemonstreerd.Ontdooi het eiwit dat aan de hars gekoppeld moet worden op ijs en bepaal vervolgens de eiwitconcentratie met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt en de absorptie bij 280 nanometer. Gebruik twee milliliter hars voor twee milligram eiwit. Alle volgende stappen zijn van toepassing op twee milliliter hars.Bereid in een 10 milliliter kolom een 10 milliliter kolom voor door een FR naar de bodem te duwen en PBS pH 7.4 erdoorheen te spoelen. Sluit de onderkant van de kolom af en voeg twee milliliter koppelingsbuffer toe. Voeg vier milliliter van de slurry toe aan de kolom om twee milliliter hars te verkrijgen.Verwijder de bodemdop en laat de kolom leeglopen. Spoel de kolom met in totaal zes milliliter of drie resinbedvolumes koppelingsbuffer en laat de kolom leeglopen. Plaats de bodemdop terug nadat de koppelingsbuffer is weggestroomd.Voeg vervolgens twee tot vier milliliter proteïne gesuspendeerd in koppelingsbuffer toe aan de kolom. Bewaar een aliquot van de proteïneoplossing om de kopplingsefficiëntie te beoordelen. Sluit de kolom daarna af met een dop en meng door deze end-over-end te schudden.Om een homogene oplossing te maken, meet u het totale volume van de reactie, rekening houdend met het volume van de hars, en voegt u 10 µL van vijf molar natriumcyanoborohydride per milliliter reactie toe. Sluit de kolom af en meng deze door hem om te keren. Bevestig de kolom in een buizenrotator en laat de reactie overnacht doorgaan.Neem de kolom de volgende ochtend bij vier graden Celsius mee naar de zuurkast en verwijder voorzichtig de dop, aangezien er gas gevormd kan zijn. Laat de kolom leeglopen in een schone buis en bewaar de ilu. De proteïneconcentratie van de IIT wordt gemeten en vergeleken met de beginconcentratie van de proteïne.Om de koppelingsefficiëntie te beoordelen, wordt de hars gewassen met vier milliliter koppelingsbuffer en mag de kolom vervolgens uitlekken. Zodra het ligandbindende domein of LBD aan de hars is gekoppeld, is de volgende stap het blokkeren van de resterende plaatsen. Om deze procedure te starten, wordt de hars gewassen met vier milliliter quenching-buffer, waarna de kolom wordt leeggelaten en de bodemdop wordt teruggeplaatst.Voeg twee milliliters quenchingbuffer toe en resuspendeer de hars. Bepaal het totale reactievolume door het volume van de hars en het volume van de quenchingbuffer te meten. Voeg 10 microliters vijf molar natriumcyaanborohydride toe per milliliter reactievolume.Meng voorzichtig gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur door middel van end-over-end rotatie. Breng de kolom na 30 minuten naar de zuurkast. Verwijder voorzichtig de bovenkap, verwijder vervolgens de onderkap en laat de kolom leeglopen in een afvalbuis.Was de kolom met vijf harsvolumes wasoplossing. Controleer de wasbeurten op de aanwezigheid van residuele eiwitten door de absorbentie bij 280 nanometer te meten; niet-gekoppelde eiwitten worden uitgewassen door de hoge zoutconcentratie. Was de hars tot slot met zes milliliters DGAs PBS bevatten 0,02% natriumazide en bewaar de kolom bij vier graden Celsius tot gebruik.Begin de procedure voor het zuiveren van nore-specifieke antilichamen door de NORE 77 LBD-gekoppelde kolom te spoelen met 10 milliliters PBS en de kolom te laten uitlekken; sluit de onderkant van de kolom af en plaats de uitgelekte NORE 77 LBD-gekoppelde kolom in een nieuwe 15 milliliter opvangbuis. Voeg vijf milliliters proteïne-A gezuiverde anti-nore antilichamen toe aan de kolom en sluit deze af. Plaats de kolom op een rotator bij vier graden celsius gedurende één uur.Verwijder vervolgens de boven- en onderkappen en verzamel de doorstroomfractie. Bewaar de doorstroomfractie op ijs totdat deze aan de nor moet worden toegevoegd. Eén LBD gekoppelde kolom.Spoel de no one LBD-gekoppelde kolom met 10 milliliters PBS en laat de kolom leeglopen; sluit de onderkant van de kolom af en plaats de nor one LBD-gekoppelde kolom in een 15 milliliter opvangbuis. Voeg de doorstroomvloeistof van de north 77 LBD-gekoppelde kolom toe. Sluit de kolom af en plaats deze op een rotor bij vier degrees Celsius gedurende één uur.Na één uur worden de boven- en onderdop verwijderd en wordt de doorloop verzameld. De antilichaamconcentratie wordt bepaald door de absorptie bij 280 nanometers te meten.De gezuiverde anti-nore-1-antilichamen worden vervolgens geanalyseerd via ELISA. Voeg 100 µL proteïne toe aan de wells van een 96-wells plaat. Indien er drie verschillende proteïnen worden getest, voeg dan 100 µL van proteïne 1 toe aan wells A1 tot H4, 100 µL van proteïne 2 aan wells A5 tot H8, en 100 µL van proteïne 3 aan wells A9 tot H12.Dek de plaat af en incubeer deze overnacht bij vier graden Celsius tot de volgende ochtend. Was de gecoate wells twee keer met 300 µL PBS per well. Voeg vervolgens 300 µL Eliza-blokkeringsbuffer toe aan alle met antigeen gecoate wells en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Vervang na twee uur blokkeren de ELISA-blokkeringsbuffer in elke well door 100 µL verse ELISA-blokkeringsbuffer. Voeg 100 µL verdunde gezuiverde anti-EU1-antilichaam toe aan alle wells in de rij. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur.Was de plaat drie keer met 0,05% Tween 20 en dep de plaat na de derde wasbeurt droog om overtollige wasbuffer te verwijderen. Voeg 100 µL mierikswortelperoxidase-geconjugeerd geiten anti-rabies IgG, verdund in ELISA-blokkeringsbuffer, toe aan elke put en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de plaat na één uur drie keer met 0,05% Tween 20, zoals eerder beschreven, en dep de plaat na de derde wasbeurt droog.Spoel alle wells door ze te vullen met 300 µL gedeïoniseerd water en dep het overtollige water weg door de plaat omgekeerd op absorberend papier te plaatsen. Voeg 100 µL van 3',5',5'-tetraethylbenadine, opgewarmd tot kamertemperatuur, toe aan alle wells en incubeer gedurende 15 tot 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Stop de reactie door 50 µL van 2 N salicylzuur aan elke well toe te voegen.Meet tot slot de absorbentie bij 450 nanometer. Trek de achtergrond bij 650 nanometer ervan af. Een vergelijking van eiwit. Een gezuiverd eiwit zonder specifieke antilichamen.Gezuiverde anti-Norovirus 1-antilichamen die vervolgens over No. 77 LBD- en No. 1 LBD-kolommen werden geleid, tonen aan dat terwijl gezuiverd anti-No. 1 een sterke binding vertoonde aan No. 1 LBD, het ook een significante binding vertoonde aan No. 77 LBD en aan No. 1 LBD. Verdere zuivering van anti-No. 1 tegen No. 77 LBD en No. 1 LBD verwijderde deze kruisreactiviteit volledig. Deze specificiteit werd verder aangetoond via Western blot-analyse van extracten uit cellen die waren getransfecteerd met expressievectoren die MyC-getagde full-length Nor 1, Nor 1 en Nor 77 bevatten; anti-MyC-antilichamen onthulden dat elk full-length eiwit werd tot expressie gebracht bij het verwachte molecuulgewicht. Gezuiverd anti-Nor 1 detecteerde robuust full-length Nor 1, maar detecteerde ook Nor 1 en Nor 77, zij het minder efficiënt.In tegenstelling hiermee vertoonde het volledig gezuiverde nor one-antilichaam geen detecteerbare kruisreactiviteit met nor one en nor 77. Immunohistochemische analyse van dopaminerge neuronen in de middenhersenen met het volledig gezuiverde nor one-antilichaam bevestigde de prominente expressie van nor one-immunohistochemie. Gebruik van tyrosinehydroxylase onthulde verder dat neuro one ook exclusief tot expressie komt in de kern van dopaminerge neuronen in de middenhersenen in het gebied van de substantia nigra. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee dagen worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd. Vergeet niet dat het werken met natriumionen of hydriden extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast, altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

production-nurr-1-specific-polyclonal-antibodies-free-cross

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a procedure for the production of recombinant antibodies against metallopeptidase. Recombinant plasmids carrying genes for the antibody, green fluorescent protein, and antibiotic resistance are transfected into epithelial cells with lipofectamine. The transfected cells are selected and cultivated to generate recombinant antibodies.

A Method to Produce Recombinant Antibodies Against Metallopeptidase

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Hier beschrijven we een werkwijze uit te drukken en te zuiveren uitstekende kwaliteit norovirus (P) domeinen in E. coli voor röntgen- kristallografie studies. Deze methode kan worden toegepast op andere calicivirus P domeinen, alsmede niet-structurele eiwitten, bijv., Viraal eiwit-gekoppelde genoom (VPG), protease en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp).

De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in<em&gt; E. coli</em&gt; Voor röntgenkristallografie

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Wij hebben ectopically NR1 subeenheid van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescent proteïne in menselijke embryonale cellen (HEK293) als antigeen te detecteren autoantilichamen tegen NMDA receptor in het bloed van patiënten verdacht met auto-immune encefalitis. Deze eenvoudige methode kan geschikt voor screeningonderzoek in klinische instellingen zijn.

Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en de evaluatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten voor gebruik in verschillende immunoassay. Deze procedure omvat immunisatie, celfusie, indirecte competitieve ELISA voor positieve kloon screening en monoclonal hybridoma voorbereiding. De specificaties voor de karakterisering van het antilichaam met behulp van MALDI-TOF-MS en ELISA analyses zijn ook beschikbaar.

Generatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten

Hier presenteren we een cel-gebaseerde stroom cytometry methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen of andere factoren die met de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën in een menselijke matrix, zoals cerebrale spinal fluid (CSF) of menselijk serum interfereren.

Opsporing van antilichamen die de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën met een test van cel-gebaseerde neutraliseren

Het recombinante antilichaameiwit dat tot expressie komt in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen en monoklonale antilichamen geproduceerd met behulp van traditionele hybridoma-technologie kan het varkensaminopeptidase N (APN) -eiwit herkennen en eraan binden.

Productie van monoklonale antilichamen gericht tegen aminopeptidase N in het varkensdarmslijmvliesepitheel

Het meten van de yaw koppel van Drosophila aangebonden met het koppel meter kan de neurowetenschapper uitstekende beheersing van de stimulus situatie van de proefdieren. Samen met de unieke genetische tools beschikbaar zijn in de fruitvlieg, wordt dit paradigma gebruikt voor een breed scala van neurobiologisch onderzoek.

Operante leren van Drosophila bij de Torque Meter

Leer hoe u de specificiteit van antilichamen tegen homologe eiwitten verhoogt door kruisreactieve antilichamen te verwijderen via affiniteitschromatografie. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van eiwitdetectie aanzienlijk.

Productie van Nurr-1 Specifieke polyklonale antilichamen Vrij van Cross-reactiviteit tegen zijn naaste Homologen, Nor1 en Nur77

Meer video's verkennen