Name: Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Leer de fluorescentie biomembraan force probe-techniek voor gelijktijdige meting van receptor-ligand kinetiek en calciumsignalering in T-lymfocyten. Deze methode biedt inzicht in mechanotransductie bij immuunactivering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek gerelateerd aan dit artikel en de ontwikkeling van de fBFP-technologie in het Zhu-lab werden ondersteund door NIH-subsidies AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 en TW008753. We danken Evan Evans voor het uitvinden van deze krachtige experimentele tool, en leden van het Evans-lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong en Ken Halvorsen, voor hun hulp bij het bouwen van de BFP. We danken ook andere Zhu-lableden, Fang Kong, Chenghao Ge en Kaitao Li, voor hun hulp bij de ontwikkeling van de instrumentatie.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+glycoprotein+Ib%2FV%2FIX+and+integrin+alpha+IIbbeta+3-dependent+calcium+signals+cooperatively+regulate+platelet+adhesion+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).</li>
<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een succesvolle fBFP experiment brengt een paar kritische overwegingen. Ten eerste, voor de berekening van krachten betrouwbaar zijn, de micropipet, de RBC en de probe hiel moet worden afgestemd coaxiaal zo dicht mogelijk. De projectie van de RBC in de pipet moet ongeveer één probe pipet diameter zodat de wrijving tussen de RBC en de pipet verwaarloosbaar. Voor een typische humane RBC, de optimale pipet diameter 2,0-2,4 urn, waarbij een beste passing van vergelijking 1 17,30 oplevert. Ten tweede, om te waarbo...

Cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) adhesie wordt gemedieerd door binding tussen celoppervlakreceptoren ECM proteïnen, en / of lipiden 1. Binding cellen mogelijk maakt functionele structuur 1 vormen, alsmede erkennen communiceren, en reageren op de omgeving 1-3. Unlike oplosbare proteïnen (bijvoorbeeld cytokines en groeifactoren) die binden van een driedimensionaal (3D) vloeistoffase op het celoppervlak receptoren, celadhesie receptoren vormen banden met hun liganden over een smalle spleet junctie met twee tegenover elkaar gelegen oppervlakken die moleculaire beperken overbruggen diffusie in een dimensionale (2D) interface van 4-7 twee. In tegenstelling tot 3D kinetiek die vaak worden gemeten met traditionele binding assays (bijvoorbeeld oppervlakte plasmon resonantie of SPR), 2D kinetiek te kwantificeren met gespecialiseerde technieken zoals atomaire kracht microscopie (AFM) 10/08, stromingskamerinfusie 11,12, micropipet 13,14, optischepincet 15 en biomembraan kracht sonde (BFP) 16-21. Meer dan louter fysieke koppeling verschaffen voor mobiele samenhang adhesiemoleculen zijn een belangrijke component van de signalering machines voor de cel te communiceren met de omgeving. Er is toenemende belangstelling voor het begrip hoe ligand betrokkenheid van adhesiemoleculen initieert intracellulaire signalering en hoe de eerste signaal wordt getransduceerd in de cel geweest. Intuïtief, eigenschappen van receptor-ligand binding kan invloed hebben op de signalen induceert. Het is echter moeilijk om mechanistische relaties tussen de extracellulaire en intracellulaire interactie signaleringsgebeurtenissen ontleden met traditionele ensemble van biochemische assays vanwege de vele beperkingen, zoals een slechte tijdsresolutie en het totale gebrek aan ruimtelijke resolutie. Bestaande methoden die zowel biofysische (2D receptor-ligand bindingskinetiek) toestaan ​​en biochemische (signalering) opmerkingen over live-cellen omvatten substraten van instelbare stijfheid 22, elastomeer pijler arrays 23 en stroom kamer / microfluïdische apparaten opgenomen met fluorescentie vermogen 24-26. Echter, uitlezingen van signalering en receptor-ligand binding hebben (meestal door verschillende mogelijkheden) afzonderlijk te verkrijgen, waardoor het moeilijk om temporele en ruimtelijke relaties van obligatiekenmerken met signalerende gebeurtenissen ontleden. Conventionele BFP is een ultragevoelige kracht spectroscopie met hoge spatiotemporele resolutie 17. Het maakt gebruik van een flexibele rode bloedcellen (RBC) als een kracht sensor, waardoor de meting van de single-molecule 2D-kinetiek, mechanische eigenschappen en conformationele veranderingen 14,16,19-21,27-29. Een fluorescerende beeldvorming gebaseerd BFP (fBFP) correleert de receptor-ligand binding kinetiek met de bindende geactiveerd cell signaling in single-molecule schaal. Met deze opstelling, in situ cell signaling-activiteiten in het kader van het oppervlak mechanical stimulering werd waargenomen in T-cellen 27. De fBFP is veelzijdig en kan worden gebruikt voor onderzoek naar celadhesie en signalering gemedieerd door andere moleculen in andere cellen.

<table><tbody><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Fosfaatbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Fosfaatbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Carbonaat/bicarbonaatbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Carbonaat/bicarbonaatbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5%-buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5%-buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5%-buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>N2-5%-buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Beadfunctionalisatie</td></tr><tr><td>Biotin-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>RBC biotinylering</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>RBC osmolariteitsaanpassing</td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxide (NH4OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>Glaskralen silanisering</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>Glaskralen silanisering</td></tr><tr><td>30% Hydrogen Peroxide (H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>Glaskralen silanisering</td></tr><tr><td>Acetic Acid (Glacial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Glaskralen silanisering</td></tr><tr><td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Glaskralenfunctionalisatie</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass beads</td><td>Distrilab Particle Technology</td><td>9002</td><td>Glaskralenfunctionalisatie</td></tr><tr><td>Streptavidin&minus;Maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Glaskralenfunctionalisatie</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Ligand functionaliseren</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>Intracellulair calciumfluorescentie kleurstof laden</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Intracellulair calciumfluorescentie kleurstof laden</td></tr><tr><td>Quantibrite PE Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>Dichtheidskwantificering</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR II</td><td>Dichtheidskwantificering</td></tr><tr><td>Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>Micropipet maken</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>sutter instrument</td><td>P-97</td><td>Micropipet maken</td></tr><tr><td>Pipette microforce</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Micropipet maken</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>Kammersamenstelling</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Kammersamenstelling</td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Kammersamenstelling</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD&nbsp;</td><td>309602</td><td>Kammersamenstelling</td></tr><tr><td>Micropipette holder</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>Kammersamenstelling</td></tr><tr><td>Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. </td><td>Biophysics Instrument</td><td>Alle onderdelen zijn aangepast volgens de CAD-ontwerpen.</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>Microscope (TiE inverted)</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)</td><td>Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>Manual submicron probehead with high resolution remote control</td><td>Karl Suss</td><td>PH400</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>Anti-vibration table (5&rsquo; x 3&rsquo;)</td><td>TMC</td><td>77049089</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>3D manual translational stage</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 3D CAD software</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Version 2012 SP5</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>LabVIEW software</td><td>National Instruments</td><td>Version 2009</td><td>BFP systeem, BFP programma</td></tr><tr><td>3D piezo translational stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>Linear piezo accuator</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>BFP systeem</td></tr><tr><td>Micromanager software</td><td></td><td>Version 1.4</td><td>fBFP systeem, fluorescentiebeeldvorming programma</td></tr><tr><td>Dual Cam (DC-2)</td><td>Photometrics</td><td>77054724</td><td>fBFP systeem</td></tr><tr><td>Dual Cam emission filter (T565LPXR)</td><td>Photometrics</td><td>77054725</td><td>fBFP systeem</td></tr><tr><td>Fluorescence Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>fBFP systeem</td></tr><tr><td>Plastic paraffin film (Parafilm)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM996</td><td>fles afsluiten</td></tr><tr><td>Carbonaat/bicarbonaatbuffer (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td>8,4 g/L natriumcarbonaat (Na2CO3), 10,6 g/L natriumbicarbonaat (NaHCO3)</td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer (pH 6,5-6,8)</td><td></td><td></td><td>27,6 g/L NaFosfaat monobasic (NaH2PO4 &bull; H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfaat dibasic (Na2HPO

fluorescentie biomembraan force probe: concurrent kwantificering van receptor-ligand kinetics en-binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membraan receptor-ligand-interacties mediëren vele cellulaire functies. Bindingskinetiek en downstream signalering veroorzaakt door deze moleculaire interacties worden waarschijnlijk beïnvloed door de mechanische omgeving waarin binding en signalering plaatsvinden. Een recente studie toonde aan dat mechanische kracht antigen herkenning door kunnen regelen en activeren van de T-celreceptor (TCR). Dit werd mogelijk gemaakt door een nieuwe technologie die we ontwikkeld en genoemd fluorescentie biomembraan kracht sonde (fBFP), die single-molecule kracht spectroscopie gecombineerd met fluorescentiemicroscopie. Met behulp van een ultra-soft menselijke rode bloedcellen als gevoelige krachtsensor, een high-speed camera en real-time imaging volgtechnieken, de fBFP is ~ 1 pN (10 -12 N) ~ 3 nm tot ~ 0,5 msec kracht, ruimtelijke en temporele resolutie. Met de fBFP, kan men precies enkele receptor-ligand bindingskinetiek onder dwang regelgeving en tegelijkertijd het binding-geactiveerd intracellulaire cal metenCium signalering op een enkele levende cellen. Deze nieuwe technologie kan worden gebruikt om andere membraan receptor-ligand interactie en signalering bestuderen andere cellen onder mechanische regeling.

Het BFP techniek werd ontwikkeld door het laboratorium in Evans 1995 17. Deze picoforce gereedschap is uitgebreid gebruikt om interacties van eiwitten geïmmobiliseerd op oppervlakken meten, teneinde tweedimensionale kinetiek van adhesiemoleculen analyseren interactie met hun liganden 16,19,20, 30, moleculaire elasticiteit 21,29 meten en te bepalen eiwit conformatieveranderingen 21. Voor een fBFP, een extra set van de epi-fluorescentie-gerelateerde apparaten met de bijbehorende...

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig receptorachtige binding te meten en de door binding geïnduceerde calciumsignalering in een enkele cel te observeren. Dit wordt bereikt door eerst biotine te isoleren en de osmolariteit van menselijke rode bloedcellen of RBC's aan te passen om deze te gebruiken als een ultrasensitieve krachttransducer. De tweede stap is het functionaliseren van microscale glaskralen, wat het reinigen, dilateren en het coaten met liganden omvat.Vervolgens worden de T-cellen geïsoleerd en geïncubeerd met de calciumkleurstof fewer 2:00 AM, wat de observatie van de intracellulaire calciumionconcentratie mogelijk maakt. De laatste stap is het klaarmaken van de micropipetten in de experimentele kamer die specifiek vereist zijn voor de opstelling van het experiment. Ten slotte wordt de fluorescentie-biomembraan-krachtsonde of BFP-techniek gebruikt om de adhesie van een cel aan een met ligand gecoate kraal aan te tonen, de bindingskinetiek tussen receptor en ligand te meten en gelijktijdig het intracellulaire calciumgehalte te monitoren.Deze techniek is nuttig voor het begrijpen van hoe mechanische kracht door T-cellen wordt waargenomen via androgeenhe

fluorescence-biomembrane-force-probe-concurrent-quantitation-receptor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

In this video, biomembrane force probes (BFPs) are used to measure the forces between receptors and ligands. This technique can detect interactions by monitoring the pressure needed to break the bonds between the pMHC conjugated on the probe beads and the TCRs on the target cells.

Biomembrane Force Probe to Quantitate Receptor-Ligand Interactions

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

We beschrijven een beeldvormings aanpak voor de bepaling van de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor oligomeren geïnduceerd door ligand binding in het plasma membraan van levende cellen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N &amp; B) analyse.

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Hier beschrijven we een reeks methoden voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met membranen van cellen of microvesicles.

Analyse van de interactie van fluorescerende gelabelde eiwitten met kunstmatige fosfolipide microvesicles met behulp van kwantitatieve flowcytometrie

Leer de fluorescentie biomembraan force probe-techniek voor gelijktijdige meting van receptor-ligand kinetiek en calciumsignalering in T-lymfocyten. Deze methode biedt inzicht in mechanotransductie bij immuunactivering.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel (Video) | JoVE Journal

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Meer video's verkennen