Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig receptorachtige binding te meten en de door binding geïnduceerde calciumsignalering in een enkele cel te observeren. Dit wordt bereikt door eerst biotine te isoleren en de osmolariteit van menselijke rode bloedcellen of RBC's aan te passen om deze te gebruiken als een ultrasensitieve krachttransducer. De tweede stap is het functionaliseren van microscale glaskralen, wat het reinigen, dilateren en het coaten met liganden omvat.

Vervolgens worden de T-cellen geïsoleerd en geïncubeerd met de calciumkleurstof fewer 2:00 AM, wat de observatie van de intracellulaire calciumionconcentratie mogelijk maakt. De laatste stap is het klaarmaken van de micropipetten in de experimentele kamer die specifiek vereist zijn voor de opstelling van het experiment. Ten slotte wordt de fluorescentie-biomembraan-krachtsonde of BFP-techniek gebruikt om de adhesie van een cel aan een met ligand gecoate kraal aan te tonen, de bindingskinetiek tussen receptor en ligand te meten en gelijktijdig het intracellulaire calciumgehalte te monitoren.

Deze techniek is nuttig voor het begrijpen van hoe mechanische kracht door T-cellen wordt waargenomen via androgeenherkenning. Een belangrijk voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat FBIP receptor-ligandbindingskinetiek en intracellulaire signalering gelijktijdig kan meten. De uitdagende onderdelen van dit protocol omvatten het handmatig produceren van micro pep-paden met de juiste diameters, het oppakken van cellen en kralen met micro PEP's en het assembleren van de krachtsonde, wat in eerste instantie kan mislukken, hoewel hij niet aanwezig kon zijn voor de demonstratie in deze video.

Co-auteur Arnold G, die onlangs zijn PhD in mijn laboratorium heeft voltooid, heeft aanzienlijk bijgedragen aan de initiële validatie van de fabricage van het FBAP-protocol. Neem acht tot 10 µL bloed via een vingerprik en voeg dit toe aan 1 mL carbonaat-bicarbonaatbuffer; vortex of pipetteer het mengsel en centrifugeer gedurende één minuut bij 900 G. Verwijder het supernatant voordat u de carbonaat-bicarbonaatbuffer uitvoert. Was nogmaals.

Meng vervolgens 10 µL van het resulterende RBC-pack met 171 µL carbonaat-bicarbonaatbuffer en 1049 µL biotinyl-PEG-NHS-linkeroplossing en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was het resulterende RBC-mengsel, gebruikmakend van dezelfde wasprocedures als voorheen, één keer met carbonaat-bicarbonaatbuffer en daarna twee keer met N twee 5%buffer.

Verdun vervolgens Nystatine in N twee 5%buffer. Om een eindconcentratie van 40 µL/mL te verkrijgen, mengt u vijf µL van de gebiotinylerde RBC met 71,4 µL Nystatine-oplossing en incubeert u dit gedurende één uur bij 0 °C. Was de monsters tot slot tweemaal met N twee 5%buffer en bewaar de gebiotinylerde RBC met N twee 5%buffer plus 0,5% BSA in de koelkast; monteer één stuk van drie inch micropipet op de micropipet-puller.

Klik op de trekknop zodat het midden van de capillair door de machine wordt verhit en de capillair aan beide uiteinden wordt uitgetrokken om twee capillairen met scherpe punten te maken, wat de ruwe pipetten zijn. Monteer vervolgens een ruwe pipet op de pipethouder van de micropipet-smeder en verhit deze om de glazen bol op de smeder te smelten. Steek de punt van de ruwe pipet in de glazen bol.

Koel de glazen bol af en trek aan de onbewerkte pipet om deze van buitenaf te breken, waarbij de tip in de bol achterblijft. Herhaal deze procedure totdat de gewenste opening van de tip is bereikt om de celkamer te bouwen; snijd eerst een dekglas van 40 millimeter bij 22 millimeter bij 0,2 millimeter met een glasnijper in twee stukken van 40 millimeter bij 11 millimeter bij 0,2 millimeter. De celkamer wordt gebouwd op de basis van een zelfgemaakte kamerhouder, bestaande uit twee metalen vierkante platen en een handvat dat deze met elkaar verbindt.

Lijm met behulp van grace glue één dekglas aan de onderzijde van de kamerhouder, zodanig dat het de twee metalen vierkanten overbrugt. Lijm op dezelfde wijze het andere dekglas aan de bovenzijde, waardoor een parallelle kamer van dekglazen wordt gevormd. Gebruik vervolgens de pipet om 200 µL experimentele buffer tussen de twee dekglazen te injecteren.

Zorg ervoor dat de buffer aan beide dekglasjes hecht. Roteer en schud de kamer voorzichtig zodat de buffer beide uiteinden van de kamer raakt. Injecteer vervolgens voorzichtig minerale olie aan beide zijden van de kamer, flankerend aan de experimentele bufferzone, om zo de buffer af te sluiten van de buitenlucht.

Injecteer suspensies van prob. Beads, bcs en targets respectievelijk in de bovenste, middelste en onderste regio's van de bufferzone. Zet de microscoop en de lichtbron aan om te beginnen met het BFP-experiment.

Plaats de kamer op de hoofdtabel van de microscoop. De volgende stap is het installeren van alle drie de micropipetten van de BFP. De probe aan de linkerzijde is bedoeld om een RBC te grijpen.

Het doel aan de rechterkant is om de cel te grijpen en de helper rechtsonder dient om een kraal te pakken voor installatie; gebruik een micro-injector om een micropipet te vullen met experimentele buffer. Neem de micropipet uit de pipethouder en houd deze lager om vloeistof uit de tip te laten druppelen. Steek de micropipet snel in de houder-tip, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbel in de micropipet terechtkomt.

Draai tijdens de insertie de houderschroef vast en monteer vervolgens elke pipethouder op de bijbehorende micromanipulator. Duw de micropipet richting de kamer zodat de tips het buffergebied van de kamer binnendringen. Pas de positie van de micropipet aan en breng deze in beeld onder de microscoop.

Verplaats de houder van de kamer over de tafel om de kolonies van de drie elementen te vinden. Pas één voor één de positie van de overeenkomstige micropipet aan door aan de knoppen van de manipulatoren te draaien, zodat de tip van de micropipet één cel of kraal nadert, en aspireer de cel of kraal. Door de druk in de betreffende micropipetten aan te passen, zullen alle drie de micropipetten hun overeenkomstige elementen vastleggen.

Beweeg de houder van de kamer over de tafel om een open ruimte te vinden, uit de buurt van de kolonies van de geïnjecteerde elementen, waar het experiment zal worden uitgevoerd. Schakel de visuele modus van de microscoop in om het beeld in het computerprogramma te kunnen zien. Verplaats alle drie de elementen op de pipetpunten naar het gezichtsveld van het programma.

Lijn vervolgens de probe-kraal en de RBC uit en manoeuvreer de probe-kraal voorzichtig naar de apex van de RBC. Druk de kraal nu kortstondig tegen de RBC en trek deze voorzichtig terug; pas de druk van de hulp-micropipet aan om de kraal voorzichtig weg te blazen, zodat deze vastgeplakt blijft aan de apex van de RBC. Verplaats de hulppipet en lijn het doelwit en de probe-kraal uit in het programma.

Gebruik in het venster van het gezichtsveld de programmatools om de respectieve radii van de micro-pipetsonde, de RBC en het cirkelvormige contactoppervlak tussen de RBC en de sonde-kraal te meten. Deze waarden maken het mogelijk om de veerconstante van de RBC te schatten aan de hand van de vergelijking die in het tekstprotocol staat vermeld. Nadat de gewenste veerconstante van de RBC in het programma is ingevoerd, trekt u een horizontale lijn over de apex van de RBC, wat in het aangrenzende venster een curve oplevert die de helderheid van elke pixel aangeeft.

Sleep de drempellijn langs deze as naar ongeveer de helft van de diepte van de curve. Selecteer vervolgens de gewenste experimentele modus: thermische fluctuatie-assay, adhesiefrequentie-assay of force clamp-assay. Stel de parameters naar wens in.

Klik op start, waardoor het programma de doelpipet kan verplaatsen en het doel in en uit contact met de probe kan drijven; de gegevensverzameling wordt parallel uitgevoerd, waarbij de positie van de pro-bead in realtime wordt geregistreerd. Stop het programma door op de knop stop experiment te klikken, waarna er een venster verschijnt. Om de verworven gegevens op te slaan, dient de fluorescentiefunctie van het BFP-systeem te worden gebruikt door de excitatielichtbron en de fluorescentiecamera in te schakelen, welke door een apart programma worden aangestuurd.

Select vervolgens de parameters voor de fluorescentiebeeldvorming, waaronder de gain, de belichtingstijd en de excitatiekanalen. Volg alle voorbereidingen in het BFP-experimentprotocol, inclusief het uitlijnen van de probe en het doelwit om visualisatie van het live fluorescentiebeeld van de doelcel mogelijk te maken, geëxciteerd door excitatielicht van 340 nanometer of 380 nanometer. Gebruik het sectiehulpmiddel om ruwweg het gebied af te bakenen waarbinnen de cel gedurende de gehele opnameperiode zal blijven.

Klik vervolgens gelijktijdig op opnemen en start het klikken. De opnamefunctie zorgt ervoor dat licht van 340 nanometer en 380 nanometer afwisselend de intracellulaire fluorescentiekleurstof exciteren. Er wordt afwisselend een paar corresponderende fluorescentiebeelden opgenomen, ongeveer één per seconde.

Door op start te klikken, begint het BFP-experiment voor de analyse van moleculaire interacties en het fluorescentie-imaging-experiment om intracellulaire calciumsignalering te monitoren; ga vervolgens over tot het analyseren van de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. In de ruwe datcurves van tijd-kracht is de kracht afgeleid van het volgen van de positieverandering van de pro-bead. Bij een gebeurtenis zonder adhesie zal de kracht terugkeren naar nul in het omgekeerde tijd-krachtsignaal nadat de doelcel van het bead-oppervlak is teruggetrokken.

Omgekeerd zal bij een rupture force-gebeurtenis de adhesie zich manifesteren door een snelle stijging van de kracht naar een positief niveau tijdens de retractie, gevolgd door een snelle daling terug naar nul. Bij een lifetime-gebeurtenis zal de positieve kracht worden geklemd om een plateau te realiseren. De lengte van dit plateau is de lifetime.

Door herhaaldelijk VFP-experimentcycli uit te voeren, wordt een kracht-tijdcurve afgeleid. Hier worden de fluorescentiebeelden getoond van enkele of twee beladen T-cellen na excitatie door 340 nanometer en 380 nanometer lichtkanalen. Beide beelden tonen duidelijke contouren van de cel, wat aangeeft dat de cel goed was gekleurd. Nadat de bindingskinetiekgegevens en fluorescentiegegevens van een T-cel waren afgeleid, worden zowel de cumulatieve levensduurcurve als de calciumspiegelcurve in dezelfde figuur gepresenteerd om de correlatie tussen beide te bepalen.

Nu zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het A-F-B-I-P-experiment moet worden uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te controleren of er defecten zijn aan de krachtsonde, zoals de diameter van de micropipet, de lengte van de projectie van de rubberen cel en de positie van de kraal.

Dit alles zal de nauwkeurigheid van de krachtmeting beïnvloeden. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers op het gebied van de moleculaire mechanische biologie om het mechanisme van mechanische transductie in alle mogelijke biologische systemen te bestuderen.