Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel
4 augustus 2015
We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.
Het algemene doel van deze procedure is om tegelijkertijd receptorachtige en bindende processen te meten en om de door binding geïnduceerde calciumsignalering op een enkele cel te observeren. Dit wordt bereikt door eerst biotin te isoleren en de osmolariteit van menselijke rode bloedcellen of RBC's aan te passen om ze te gebruiken als een ultragevoelige krachttransducer. De tweede stap is het functioneel maken van microscopische glazen kralen, wat het schoonmaken, verwijden en bekleden met liganden omvat.
Vervolgens worden de T-cellen geïsoleerd en geïncubeerd met de calciumkleurstof fewer 2:00 AM, waardoor de observatie van intracellulaire calciumionconcentratie mogelijk wordt. De laatste stap is het voorbereiden van de micropipetten in de experimentele kamer die speciaal vereist zijn voor de experimentele opstelling. Uiteindelijk wordt de fluorescentie bio membraankrachtsonde of BFP-techniek gebruikt om de hechting van een cel aan een met ligand beklede kraal te tonen, de receptor-ligandbindingskinetiek te meten en ondertussen het intracellulaire calciumniveau te monitoren.
Deze techniek is nuttig om te begrijpen hoe mechanische kracht wordt gevoeld door T-cellen via androgenherkenning. Een groot voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat FBIP zowel receptor-ligandbindingskinetiek als intracellulaire signalering kan meten. De uitdagende delen van dit protocol omvatten het handmatig produceren van micro pep paden met de juiste diameters, het oppikken van cellen en bijen met micro PEP's en het samenstellen van de krachtsonde, wat bij de eerste keer kan mislukken. Hoewel hij niet hier kon zijn voor de demonstratie van deze video.
Co-auteur Arnold G, die onlangs zijn doctoraat in mijn laboratorium heeft voltooid, heeft aanzienlijk bijgedragen aan de initiële fabricagevalidatie van het FBAP-protocol. Neem acht tot tien microliter bloed van een vingerprik en voeg toe aan één milliliter koolzuurwaterstofcarbonaat, buffer jet laat vortex of pipet de mix en centrifugeer gedurende één minuut bij 900 G. Gooi de supernatant weg voordat u de koolzuurwaterstofcarbonaat buffer uitvoert. Was nogmaals.
Meng vervolgens 10 microliter van de resulterende RBC-pack 171 microliter koolzuurwaterstofcarbonaatbuffer en 1049 microliter biotin. PEG NHS linkeroplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik dezelfde wasprocedures voordat u de resulterende RBC-mix eenmaal met koolzuurwaterstofcarbonaatbuffer en vervolgens tweemaal met N twee 5% buffer wast.
Verdun vervolgens Nystatin in N twee 5% buffer. Om een eindconcentratie van 40 microliter per milliliter te maken, meng vijf microliter van de biotinyleren RBC met 71,4 microliter Nystatin-oplossing en incubeer gedurende een uur bij nul graden Celsius. Was tenslotte de monsters tweemaal met N twee 5% buffer en bewaar de biotinyleren RBC met N twee 5% buffer plus 0,5% BSA in de koelkast. Monteer een stuk van drie inch micro pipet op de micro pipet puller.
Klik op de pull knop zodat het midden van de capillair zal worden verwarmd door de machine en de capillair zal worden getrokken op de twee uiteinden om twee capillairen met scherpe uiteinden te maken, dit zijn de ruwe pipetten. Monteer vervolgens een ruwe pipet op de pipethouder van de micro pipet Forge verwarm om de glazen bol op de forge te smelten. Steek de punt van de ruwe pipet binnen in de glazen bol.
Laat de glazen bol afkoelen en trek de ruwe pipet om hem van buitenaf te breken, waardoor de punt binnenin de bol achterblijft. Herhaal deze procedure tot de gewenste puntopening is verkregen om de celkamer te bouwen, eerst gesneden tot 40 millimeter door 22 millimeter door 0,2 millimeter dekglas met behulp van een glassnijder in twee stukken van 40 millimeter door 11 millimeter door 0,2 millimeter. De celkamer is gebouwd op de basis van een zelfgemaakte kamerhouder bestaande uit twee stukken metalen vierkanten en een handvat dat ze met elkaar verbindt.
Gebruik grace lijm om één dekglas aan de onderkant van de kamerhouder te lijmen op een manier dat het de twee metalen vierkanten overbrugt. Lijm op vergelijkbare wijze het andere dekglas aan de bovenkant, wat een parallelle dekglas celkamer zal vormen. Gebruik vervolgens de pipet om 200 microliter experimenteel buffer tussen de twee dekglazen te injecteren.
Zorg ervoor dat de buffer aan beide dekglazen hecht. Draai en schud voorzichtig de kamer om de buffer beide uiteinden van de kamer te laten raken. Injecteer vervolgens voorzichtig minerale olie in beide zijden van de kamer, flankerend de experimentele bufferzone, waardoor de buffer wordt afgesloten van de open lucht.
Injecteer suspensies van prob. Kralen zijn bcs en doelen in de bovenste, middelste en onderste regio's van de bufferzone. Om het BFP-experiment te beginnen, zet de microscoop en lichtbron aan.
Plaats de kamer op het hoofdmicroscoopstadium. De volgende stap is het installeren van alle drie de micro pipetten van de BFP. De sonde aan de linkerkant is om een RBC te grijpen.
Het doel aan de rechterkant is om de cel te grijpen en de helper aan de onderste rechterkant dient om een kraal te grijpen om te installeren, gebruik een micro-injector om een micro pipet terug te vullen met experimentele buffer. Neem de micro pipet van de pipethouder en houd hem op een lagere plaats om vloeistof van de punt te laten druppelen. Steek snel de micro pipet in de houder punt, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de micro pipet komen.
Tijdens het inbrengen, draai de houderschroef vast, monteer vervolgens elke pipethouder op zijn corresponderende micro manipulator. Duw de micro pipet naar de kamer zodat hun uiteinden de kamer buffergebied binnengaan. Pas een positie van de micro pipet aan en vind ze onder het microscoop veld van zicht.
Beweeg rond de kamerhouder om de kolonies van de drie elementen te vinden. Pas één voor één de positie van de corresponderende micro pipet aan door de knoppen van de manipulatoren te draaien om de punt van de micro pipet naar één cel of kraal te laten naderen, aspireer de cel of kraal. Door de druk in de corresponderende micro pipet aan te passen, zullen alle drie de micro pipetten hun corresponderende elementen vastleggen.
Beweeg rond de kamerhouder om een open ruimte weg van de kolonies van de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een techniek voor het gelijktijdig meten van receptor-ligand binding kinetics terwijl calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt wordt waargenomen. De methode maakt gebruik van biotinylerde rode bloedcellen als krachttransducers en microschaal glazen kralen voor functionering.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Immunologie
- Biofysica
Achtergrond
- Het begrijpen van receptor-ligand interacties is cruciaal voor immunologisch onderzoek.
- Calciumsignalering speelt een sleutelrol in T-cel activering.
- Gelijktijdige meettechnieken verbeteren de gegevensnauwkeurigheid.
- Krachttransductie methoden kunnen inzichten bieden in binding kinetics.
Doel van het Onderzoek
- Om receptor-ligand binding kinetics in real-time te meten.
- Om calciumsignalering geïnduceerd door bindingsgebeurtenissen waar te nemen.
- Om een methode te ontwikkelen die toepasbaar is op single-cel analyse.
Gebruikte Methoden
- Isolatie van biotin en aanpassing van de osmolariteit van humane rode bloedcellen.
- Functionering van microschaal glazen kralen met liganden.
- Isolatie en incubatie van T-cellen met calcium kleurstof.
- Voorbereiding van micro pipetten in een experimentele kamer.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle meting van receptor-ligand binding kinetics.
- Real-time monitoring van intracellulaire calcium niveaus.
- Demonstratie van de fluorescentie bio membraan krachtsonde techniek.
- Inzichten in T-cel adhesie dynamica.
Conclusies
- De techniek biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van single-cel interacties.
- Het verbetert het begrip van T-cel activeringsmechanismen.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken naar andere celtypen en signaleringsroutes.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Measuring receptor-ligand binding kinetics and downstream signaling under physiological force conditions addresses a critical gap in target validation for immunotherapies. The fluorescence biomembrane force probe (fBFP) enables concurrent quantification of molecular interactions and intracellular calcium flux in single live cells, providing mechanistic de-risking for T-cell receptor-targeted biologics. This capability supports predictive confidence in early discovery by linking biophysical binding parameters to functional signaling outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating receptor-ligand binding kinetics under force with calcium signaling activation in T cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of binding and signaling, reducing mechanistic ambiguity in immuno-oncology target selection.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying ligands that induce sustained signaling under physiologically relevant mechanical conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (biotinylated RBCs as force sensors, ligand-coated beads) for downstream screening applications requiring force-regulated binding readouts.
- Operational Value: Delivers quantitative, reproducible measurements of binding kinetics (force, lifetime, rupture events) and calcium signaling with high spatiotemporal resolution (~1 pN, ~3 nm, ~0.5 msec).
- Assay Readiness: Enables scalable compound evaluation by providing a platform that integrates force transduction with fluorescent signaling readouts for hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses primary human T cells and physiological force ranges to model disease-relevant TCR-ligand interactions in immunological contexts.
- Mechanistic De-risking: Links binding kinetics to calcium signaling outcomes, informing structure-function relationships for lead optimization in T-cell engagers or checkpoint modulators.
- Preclinical Model: Supports disease-relevant system validation by demonstrating how mechanical regulation affects antigen recognition and triggering in T cells.
Pipeline & Workflow Integration
The fBFP method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, where binding kinetics and signaling correlation inform go/no-go decisions before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how mechanical force regulates TCR-ligand binding and downstream calcium flux in live T cells.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs (binding lifetime, rupture force, calcium flux) that enable comparison of ligand variants or therapeutic candidates under controlled force conditions.
- Analytics: Provides correlated force versus time curves and fluorescence intensity readouts that allow teams to link biophysical binding parameters to functional signaling responses.
- Translational Research: Connects single-cell binding kinetics to calcium signaling continuity, supporting biomarker alignment for T-cell activation states in preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for studying any membrane receptor-ligand interaction under mechanical regulation, applicable across immunology, oncology, and neuroscience targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity between binding events and functional outcomes in immune cell targets.
- Operational Value: Standardizes force-regulated binding and signaling measurements through calibrated ultra-sensitive RBC force transducers and real-time imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying ligands that produce sustained signaling under physiological force, reducing late-stage biological risk in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on correlated binding kinetics and signaling thresholds observed in single live cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell manipulation, micro pipette fabrication, and fluorescence microscopy for force probe assembly and calibration.
- Depends on instrumentation including high-speed cameras, micro manipulators, force feedback systems, and dual-excitation fluorescence setups for calcium imaging.
- Necessitates cross-team standardization of RBC preparation, bead functionalization, and calcium dye loading protocols to ensure reproducibility across users.
- Involves adaptation considerations for different cell types (beyond T cells) and ligand pairs, requiring optimization of osmolarity, biotinylation, and force clamp parameters.
- Includes practical limitations such as low throughput due to manual cell/bead capture and dependence on operator skill for micro pipette tip quality and chamber sealing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:28
Human RBCs Isolation, Biotinylation and Osmolarity Adjustment
4:07
Preparation for Micropipettes and a Cell Chamber
6:24
BFP Experiment
10:25
Fluorescence BFP (FBFP) Experiment
11:51
Results: Representative T-cell Receptor and Peptide MHC Binding Kinetics Data & Calcium Fluorescence Data from the FBFP Experiment
13:14
Conclusion
