Engineered Gevasculariseerd Muscle Flap
11 januari 2016
Tot op heden worden defecten in dik weefsel meestal gereconstrueerd door autologe weefselflaps of geconstrueerde weefsels aan te brengen. In dit protocol presenteren we een nieuwe methode voor het maken van een gevasculariseerd weefselflap met een autologe steel, die dient als alternatief voor autologe flaps.
Het algemene doel van deze procedure is om een goed gevasculariseerd weefselflap te creëren dat kan worden gebruikt voor de reconstructie van defecten in de volledige dikte van de buikwand. Dit wordt bereikt door eerst een biodegradeerbaar polylactisch zuur poly lactic-co-glycolzuur scaffold voor te bereiden. Vervolgens worden endotheelcellen, spiercellen en fibroblasten gezaaid en wordt het graft in vitro gekweekt om de cellen zelf te laten assembleren.
Vervolgens wordt het geëngineerde weefsel geïmplanteerd rond de femorale slagader en aderen van de muis, waar het anastomose ondergaat met gastheervaten en hoog gevasculariseerd wordt. Ten slotte wordt het weefsel als pedikkelflap overgebracht naar een defect in de volledige dikte van de buikwand. Uiteindelijk wordt de graftvascularisatie bewezen door middel van echografie, T dextran injectie en immunokleuring voor CD31, en wordt de flapstijfheid onderzocht met behulp van een biodynamisch testinstrument.
De belangrijkste voordelen hiervan boven bestaande methoden zijn lagere mobiliteit van de donorsite en hoge levensvatbaarheid van het geëngineerde flap dat kan worden gebruikt voor de constructie van volledige dikte zachte weefsels. Deze methode kan helpen bij patiënten met defecten in de volledige dikte van de buikwand. Het demonstreren van de procedure wordt gedaan door Dr. Dana Egozi, een plastisch chirurg, in samenwerking met mijn laboratorium, en Anina Freimann zal haar bijstaan.
Na het voorbereiden van de scaffolds en het inbedden van cellen volgens het tekstprotocol, autoclaveer de volgende chirurgische instrumenten: een kleine fijne rechte schaar, een veerschaar, een fijne rechte pincet, een gekarteld pincet, Hudson pincet, een naaldhouder en een nummer 15 mes. Bereid een mengsel van 425 microliter ketamine en 75 microliter silodsin in een microcentrifugebuis en breng het over in een spuit. Verdun vervolgens 0,3 milligram per milliliter buprenorfine een op twintig in steriele zoutoplossing.
Na het anesthesieren van de muis volgens het tekstprotocol, plaats deze op een podium, verwarm hem tot 37 graden Celsius om de normale lichaamstemperatuur te behouden en gebruik een pleister om hem op het podium te bevestigen. Gebruik met wattenstaafjes jodium gevolgd door 70% ethanol om de incisieplaats te reinigen om een aseptisch werkveld te creëren. Na controle van de sedatieniveau, maak met een mes een incisie door de huid van het knie tot de inguinale ligament parallel aan de femorale vaten tot de femorale slagader en aderen blootgelegd zijn.
Gebruik clips of naalden om de huid vast te houden. Gebruik vervolgens veerschaar en pincet, beginnend bij de femorale AV onder de profunda en boven de bifurcatie naar de tibiale en peroneale AV, om de femorale slagader en aderen voorzichtig te isoleren van het omliggende weefsel. Laat de profunda onaangeroerd om de bloedstroom naar het been te behouden en om verdere ischemie te voorkomen.
Vouwen vervolgens het eerder voorbereide graft rond de blootgestelde femorale AV onder de profunda en boven de bifurcatie naar de tibiale en peroneale AV en gebruik 8-0 zijden hechtdraad om de uiteinden te verbinden. Om implantaatvascularisatie te waarborgen door capillairen die uit de femorale AV vaten ontspruiten, legt u een stuk gesteriliseerd latex onder het graft en wikkelt u het vervolgens om het graft en hecht het met 6-0 zijden hechtdraad. Gebruik vervolgens 4-0 zijden hechtdraad om de overliggende huid te sluiten.
Injecteer bupreorfine twee keer per dag gedurende twee tot drie dagen onderhuids. Bewaak de muis nauwgezet tot herstel van de anesthesie en dagelijks daarna totdat het graft als flap wordt overgebracht. Een tot twee weken na implantatie, na het anestheseren van de muis, plaatst u het dier op het verwarmde podium en bevestigt u het.
Na het reinigen van de incisieplaats zoals eerder in deze video is aangetoond, gebruik schaar en pincet om de hechtingen in de huid voorzichtig te openen en maak met een mes een incisie in de huid loodrecht op de inguinale ligament, doorgaand door de ventrale huid. Maak met een mes een incisie in de ventrale buikwand. Verwijder voorzichtig het latexstuk en leg het gevasculariseerde flap bloot.
Gebruik vervolgens schaar en pincet om het weefselflap van het omliggende weefsel te disseceren. Ligeer de distale uiteinden van de femorale AV met 8-0 zijden hechtdraad om bloeding uit de AV te voorkomen. Cauteriseer vervolgens de AV bij het knie, distaal van het gevouwen geïmplanteerde weefsel en de 8-0 hechtdraden. Breng voorzichtig de femorale AV omhuld door het graft naar de ventrale buikwand, waarbij u schade aan de slagader vermijdt, om te bepalen op welke afstand het defect van volledige dikte moet worden gemaakt.
Maak met veerschaar een incisie in de rectus abdominis spier en verwijder een segment van ongeveer een centimeter bij 0,8 centimeter van de spier met de overliggende huid. Breng de femorale AV omhuld door het gevasculariseerde graft als een axiale flap over naar het defect van volledige dikte in de ventrale buikwand, met behulp van 8-0 zijden hechtdraad om hernia te voorkomen. Hecht de flap aan het omliggende spierweefsel.
Hecht vervolgens met 4-0 zijden het beenhuid. Laat de ventrale huid bloot om het effect van een volledige buikwanddefect na te bootsen. Bedek de wond in de huid met gejodeerd gaas en een steriele bandage om besmetting van het blootgestelde gebied te voorkomen.
Dien buprenorfine toe zoals eerder in deze video beschreven. Bewaak het dier nauwgezet tot herstel van de anesthesie en dagelijks daarna tot herstel van de flap voor studies zoals beschreven in het tekstprotocol. Eén en twee weken na implantatie toonde een grove observatie van het graftgebied levensvatbare en hoog gevasculariseerde weefselgraften aan, zoals bepaald door positieve CD31 immunokleuring.
De weefselgraften waren ook hoog geperfundeerd, zoals te zien is door FITC-dextran injectie in de staartader en ultrageluidmetingen. Deze grafiek laat zien dat er al na één week na implantatie veel vaten waargenomen werden, een aantal dat significant steeg na
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een nieuwe methode voor het engineeren van een gevasculariseerde weefselflap met een autoloog pedikel, bedoeld voor de reconstructie van volledige dikte defecten van de buikwand. De aanpak maakt gebruik van een biologisch afbreekbare scaffold om de celassemblage en vascularisatie te ondersteunen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Tissue Engineering
- Regeneratieve Geneeskunde
- Vasculaire Biologie
Achtergrond
- Traditionele reconstructiemethoden maken gebruik van autologe weefselflappen.
- Gemanipuleerde weefsels bieden een potentieel alternatief voor complexe weefseldefecten.
- Vascularisatie is cruciaal voor de levensvatbaarheid van gemanipuleerde weefsels.
- Deze studie onderzoekt een methode om de vascularisatie in weefselflappen te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een gevasculariseerde weefselflap te ontwikkelen voor de reconstructie van de buikwand.
- Om een autologe steel te gebruiken om de integratie van het transplantaat te verbeteren.
- Om de effectiviteit van het biotechnologisch vervaardigde weefsel in een preklinisch model te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een biologisch afbreekbaar polymelkzuur-steunmateriaal.
- Het zaaien van endotheelcellen, spiercellen en fibroblasten op het steunmateriaal.
- In vitro cultuur om cel-zelfassemblage te bevorderen.
- Implantatie van het weefsel uit tissue engineering rond de arteria femoralis en venen in een muismodel.
Belangrijkste resultaten
- Het weefsel uit technische constructie onderging met succes een anastomosis met de vaten van de gastheer.
- Significante vascularisatie werd bevestigd via echografie en immunokleuring voor CD31.
- De stijfheid van de flap werd geëvalueerd met een biodynamisch testinstrument.
- De methode toonde potentieel als alternatief voor autologe flaps.
Conclusies
- De studie presenteert een levensvatbaar alternatief voor traditionele methoden voor weefselreconstructie.
- Verbeterde vascularisatie is haalbaar via de beschreven engineering-aanpak.
- Deze techniek kan de resultaten in de reconstructieve chirurgie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het ontwikkelen van gevasculariseerde spierflappen pakt een kritieke barrière in de levensvatbaarheid van weefselconstructen aan door de levering van zuurstof en voedingsstoffen mogelijk te maken bij klinisch relevante diktes. Deze mogelijkheid ondersteunt de translationele vooruitgang in de reconstructieve en regeneratieve geneeskunde, in het bijzonder voor full-thickness weke delen defecten. De aanpak verhoogt het voorspellend vertrouwen voor weefselintegratie en functioneel herstel in preklinische modellen, wat bijdraagt aan portfoliobeslissingen voor biomaterialen van de volgende generatie.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar vascularisatiemechanismen in engineered weefsels mogelijk voor functionele validatie.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door in vivo integratie en perfusie van constructen aan te tonen.
- Faciliteert voorspellende beoordeling van weefsellevensvatbaarheid en mechanische eigenschappen in preklinische settings.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een reproduceerbaar platform voor het evalueren van scaffold-celcombinaties onder fysiologische vascularisatie.
- Standaardiseert de kwantitatieve beoordeling van graftperfusie en mechanische sterkte met behulp van imaging en biodynamische tests.
- Maakt screening van biomateriaalformuleringen mogelijk voor optimale integratie en een verminderd afstotingsrisico.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Lijnt technisch ontwikkelde constructen uit met ziekte-relevante modellen voor reconstructie van de buikwand en zacht weefsel.
- Ondersteunt de continuïteit van in vitro assemblage tot in vivo functionele validatie en integratie.
- Informeert de risico-gecorrigeerde voortgang van tissue engineering-kandidaten richting klinische translatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode voor een vasculair gemanipuleerde lap vormt een brug tussen vroege ontdekking, preklinische validatie en translationeel onderzoek voor reconstructieve weefseltechniek.
- Discovery Biology: Demonstreert hypothesetoetsing voor vasculaire integratie en weefsellevensvatbaarheid in vivo.
- Screening: Levert kwantitatieve output over perfusie, vascularisatie en mechanische eigenschappen voor de vergelijking van kandidaten.
- Analytics: Maakt gebruik van echografie, immunokleuring en biodynamische tests om reproduceerbare resultaten te genereren.
- Translational Research: Biedt een preklinisch model voor het evalueren van de prestaties van engineered weefsel in klinisch relevante defecten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een workflow die aanpasbaar is aan verschillende weefseltypen en biomateriaalkplatforms.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in weefsellevensvatbaarheid en -integratie voor regeneratieve toepassingen.
- Operationele waarde: Standaardiseert vascularisatie- en mechanische testprotocollen voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go beslissingen mogelijk voor biomateriaal- en tissue engineering-programma's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten met aangetoonde in vivo prestaties.
Overwegingen bij de Implementatie
- Vereist expertise in de fabricage van scaffolds, celkweek en microsurgische implantatie.
- Vereist toegang tot beeldvormingsmodaliteiten (echografie, immunokleuring) en instrumenten voor mechanische testen.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor een reproduceerbare voorbereiding en analyse van de constructen.
- Aanpasbaar aan verschillende celtypen en defectmodellen door optimalisatie van het protocol.
- Beperkt door de noodzaak van in vivo validatie en gespecialiseerde chirurgische vaardigheden.
