Maat ontworpen laser gebaseerde Verwarming Apparaten voor gestuurde release van cisplatine van temperatuurgevoelige liposomen met Magnetic Resonance Image Guidance

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de werking van een op maat gebouwd, lasergebaseerd verwarmingsapparaat dat kan worden gebruikt om subcutane tumoren lokaal te verhitten voor de toediening van een hittegeactiveerde liposoomformulering. Dit wordt bereikt door eerst de HTLC-formulering voor te bereiden via lipidefilmvorming, hydratatie-extrusie en dialyse. In de tweede stap wordt een donormuis geïnoculeerd met cervicale carcinoomcellen.

Na vier tot vijf weken wordt de tumor weggesneden, in fragmenten gesneden en individueel geïmplanteerd in een recipiënte muis. In de laatste stap wordt de tumor van de recipiënte muis lokaal verhit tot 42 °C met behulp van het lasergebaseerde verwarmingssysteem. Het lasergebaseerde verwarmingsapparaat is MR-compatibel, wat monitoring van de veranderingen in weefseltemperatuur tijdens de lichttoediening mogelijk maakt, en is klein en draagbaar, wat zorgt voor een eenvoudige en effectieve verwarming van de tumor in de bore van de kleine-dieren-MR.

Uiteindelijk kan de door warmte geactiveerde afgifte van het thermosensitieve HTLC worden gemonitord via real-time magnetische resonantiebeeldvorming. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van een waterbad en een verwarmingskatheter, zijn dat onze techniek een conforme methode biedt om warmte aan de tumor toe te dienen binnen één tot twee minuten na het starten van de warmtebehandeling en dat het real-time aanpassing van het laservermogen mogelijk maakt, waardoor temperatuurschommelingen tijdens de procedure worden geminimaliseerd. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we begonnen met het uitvoeren van in vivo studies met onze thermosensitieve HTLC-liposoomformulering.

We stelden vast dat de bestaande methoden niet in staat waren om efficiënt lokale verhitting van een subcutane tumor te bewerkstelligen. De procedures voor de bereiding van liposomen zullen worden gedemonstreerd door myung, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin bij het bereiden van de liposomen met het mengen van een vers bereid lipidemengsel met een vers bereid lipide-geneesmiddelmengsel, gevolgd door een uur hydratatie met vortexen elke 15 tot 20 minuten terwijl het lipidemengsel hydrateert. Assembleer de 10 milliliter extruder met twee stacks van 200 nanometer polycarbonaatfilters; plaats de thermobuis van de extruder in een circulerend waterbad dat is ingesteld op 70 °C en sluit het apparaat aan op een stikstoftank onder druk.

Verplaats direct na de hydratatie de lipiden naar de extrudeerkamer en open de stikstofstroom. Extrudeer vervolgens de liposomen bij een druk van 200 PSI door de membranen en vang de liposomen op in een conische buis van 50 milliliter in een waterbad van 70 °C. Nadat de liposomen vijf keer zijn geextrudeerd, demonteert u het apparaat en bouwt u het opnieuw op met twee stapels polycarbonaatfilters van 100 nanometer.

Stel de druk in op 400 PSI en extrudeer de liposomen 10 keer, zoals zojuist gedemonstreerd. Verzamel de liposomen van de laatste extrusie in een conische buis van 15 milliliter en laat de liposomen afkoelen tot kamertemperatuur, gevolgd door precipitatie van het onoplosbare cisplatin door centrifugatie; dialyseer de liposomen vervolgens overnacht tegen 0,9% saline in dialysis tubing met een molecular weight cutoff van 15.000 onder steriele omstandigheden. Om het cervicale tumorxenograft te implanteren, oogst je 180 cellen uit een 90%confluente cultuur en tel je het aantal levensvatbare cervicale carcinoomcellen met een hemocytometer.

Cytometer, verdun vervolgens de cellen tot 1 × 10⁶ cellen per 100 µL. Al het dierproefwerk werd uitgevoerd bij het Star Innovation Center; inoculeer vrouwelijke SCID-muizen via intramusculaire injectie in de musculus gastrocnemius van het achterpootje. Meet met een schuifmaat de resulterende tumorgrootte totdat de tumoren 9 tot 12 mm hebben bereikt in hun grootste dimensie. Exciteer vervolgens de tumor uit de donormuis en versnij deze in fragmenten van 2 tot 3 mm³.

Scheer nu de linkerachterpoot van het ontvangende dier en maak een incisie in de kale huid. Breng één stuk van de donortumor subcutaan in via de incisie en gebruik één tot twee wondclips om de huid drie tot vijf dagen na de implantatie te sluiten. Verwijder de clips en laat de tumor twee tot drie weken groeien voordat de hittebehandeling wordt uitgevoerd.

Sluit eerst één uiteinde van een laservezel aan op het laserapparaat en het andere uiteinde op de illuminator. Plaats vervolgens een injectiekatheter van 27 gauge in de laterale staartvene van een geanestheseerde recipientmuis, gevolgd door de inbreng van een katheter van 22 gauge in het centrum van de tumor. Plaats daarna een glasvezeltemperatuursonde in de holle katheter om eventuele temperatuurveranderingen te monitoren en bedek de gehele tumor met de illuminator. Klaar.

Stel het vermogen in op 0,8 tot één watt, zet vervolgens de laser aan en wacht tot de temperatuur stijgt, waarbij het laservermogen gedurende de behandeling handmatig wordt aangepast tussen 0,1 en 0,8 watt om de temperatuur van de tumor op 42 °C te houden, zoals geïllustreerd in deze afbeelding van een dwarsdoorsnede door een warmtebehandelde tumor. Uitgaande van een totaal vermogen van één watt, is de maximale fluentiegraad op elk punt in de tumor 70 mW/cm², waarbij de fluentiegraad in de tumor op huiddiepte 50% van de maximale fluentiegraad bedraagt, zoals bevestigd door proton resonance frequency shift voor magnetische resonantie thermometrie verhitting. Het gebruik van de lasergebaseerde verhittingsopstelling genereert een relatief uniforme temperatuurdistributiekaart, getoond in de afbeelding, die de relatieve temperatuurverandering volgt ten opzichte van een absolute basislijnmeting die vóór verhitting door de puntbron is verkregen. De verhitte tumor vertoont de hoogste relatieve signaaltoename in vergelijking met de onverhitte turt-spier na toediening van gad HTLC, zoals bepaald door magnetische resonantie signaalanalyse, waarbij het signaal behouden blijft tot het einde van de verhittingsperiode. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan 15 minuten worden opgezet mits correct uitgevoerd, wat een waardevol instrument biedt voor de preklinische evaluatie van thermosensitieve liposoomformuleringen.

Vergeet niet dat het werken met een klasse 4 laser extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van een veiligheidsbril, bij het uitvoeren van deze procedure.