Name: Het gebruik van enzymatische biosensoren te kwantificeren endogene ATP of H 2 O 2 In de nier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer hoe u enzymatische micro-elektrode biosensoren gebruikt voor real-time meting van ATP en waterstofperoxide in nierweefsel. Deze methode maakt ex vivo en in vivo toepassingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij waarderen Sarissa Biomedical voor hun werk in de ontwikkeling van de bij de huidige manuscript sensoren. Dit onderzoek werd gesteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute verleent HL108880 (A. Staruschenko), HL 116.264 (A. Cowley) en HL 122.662 (A. Staruschenko en A. Cowley), een project gefinancierd door de Medical College of Commissie Wisconsin Onderzoeks zaken # 9306830 (O. Palygin) en Het bevorderen van een gezondere Wisconsin Research and Education Program # 9.520.217, en de Young Investigator Grant van de National Kidney Foundation (O. Palygin).

De volgende dierlijke procedures gehandeld op grond van de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren. Voorafgaande goedkeuring werd verkregen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). OPMERKING: Herziening van de sensor instructies van de fabrikant moet worden gedaan tijdens het experiment ontwerp en voorafgaand aan het gebruik ervan. Naar aanleiding van deze instructies optimale resultaten bij gebruik van de sensoren. 1. Sensor Calibration <ol><li> Bereid verse stamoplossingen vóór de start van het experiment. </li><li> Maak Buffer A met 10 mM NaPi-buffer, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2 en 2 mM glycerol. Breng de pH op 7,4 met NaOH. Bewaren bij 2-8 ° C. </li><li> Met een voorraad ATP-concentratie (100 mM) bewaard bij -20 ° C, een frisse 10 mM ATP ijkoplossing door toevoeging van 10 ul bouillon aan 90 ui buffer A. </li><li> Hydrateren de ATP sensor door het plaatsen van de punt (figuur 2) in tHij rehydratatie kamer die buffer A gedurende ten minste 10 minuten bij 2-8 ° C. OPMERKING: Na rehydratatie de sensoren niet bloot aan lucht langer dan 20 sec of de gevoeligheid van de sensor kan worden verminderd. Als lange blootstelling aan lucht worden verwacht, dompel de sensor kort in een oplossing van glycerol. De sensoren kunnen worden gebruikt voor meerdere experimenten maar deze moet gebeuren op dezelfde dag als sensor rehydratatie. De sensoren kunnen worden opgeslagen in de rehydratie kamer met buffer A tot 24 uur. </li><li> Schakel de tweekanaals potentiostaat (figuur 3) en start de opname-systeemsoftware. </li><li> Bereid een kalibratiekamer met 3 ml buffer A. Plaats de referentie-elektrode in de kalibratiekamer. Neem elke sensor uit de rehydratie kamer, dan hechten aan de manipulator en steek deze in de kalibratie kamer oplossing. OPMERKING: Gebruik een standaard siliconen gecoate petrischaal als een kalibratie kamer. Voer alle kalibraties en studies in een kooi van Faraday op een high-performance lab lucht tafel signaal lawaai tijdens de amperometrie opnamen (figuur 4) te verminderen. Ijkingen best zo dicht mogelijk bij het begin van de gegevensverzameling mogelijk. Voor in vivo toepassingen de optimale tijd voor de kalibratie tijdens het dier na de operatie herstelperiode. </li><li> Ex vivo kalibratie <ol><li> Voer cyclische voltammetrie in de kalibratie kamer door fietsen de sensoren van -500 mV tot 500 mV bij een snelheid van 100 mV / sec gedurende 10 cycli. Dit verbetert sterk de gevoeligheid van de sensoren. Zie Figuur 5 voor de waargenomen uit de 10 cycli sporen. </li><li> Polariseren de sensoren om 600 mV na de laatste cyclus. De sensor stroom zal vervallen tot een asymptoot. Een stabiele meting wordt verkregen na minimaal 5 min. Noteer de nul lezen. </li></ol></li><li> In vivo sensorkalibratie <ol><li> Laat de cyclische voltammetrie niet uit te voeren op de in vivo sensors. In plaats daarvan polariseren de sensor in de kalibratie kamer voor 30 sec tot 500 mV. Stel de potentiostaat tot 0 mV en laat de sensorstroom stijgen tot een asymptoot. De sensor stroom zal minstens 2 min naar asymptoot. Noteer de nul lezen. </li></ol></li><li> Achtereenvolgens set hoeveelheden ATP-oplossing toe te voegen in de kamer om een ​​kalibratie lijn omvat een gewenste detectiebereik te produceren. De ATP-oplossing produceert een scherpe piek in het sensorsignaal aanvankelijk, gevolgd door een verval als ATP diffundeert gelijkmatig door de kamer. Record signaal waarden zodra het signaal niveau is gestabiliseerd na elke ATP toevoeging. Figuren 6A en 7 tonen sporen en stelde ATP concentraties voor zowel ex vivo en in vivo studies, respectievelijk. NB: Het is belangrijk de selectiviteit van de elektrodes te bevestigen met behulp van aaseters van de analyten. Het huidige protocol gebruikt apyrase om de specificiteit van de ATP-sensor en catalase voor de H &lt;testensub&gt; 2 O 2 signaal (figuur 6B). Als geneesmiddelen worden toegediend, dienen metingen van hun reactiviteit met de sensoren worden vastgesteld vóór de studie. </li><li> Voeg 3 ul van apyrase uit een voorraad van 2 mg / ml (89 UN / mg) om specificiteit van de ATP sensor (actuele door ATP beroep te reduceren tot het nulniveau (figuur 7) te testen. </li><li> Voeg 3 ul van catalase uit een voorraadoplossing van 2 mg / ml (100 UN / mg) om de specificiteit van de nul-sensor (de stroom door H 2 O 2 beroep te reduceren tot de nulwaarde) testen. </li></ol> 2. Animal Chirurgie Voor Sensor Studies <ol><li> Chirurgie voor ex vivo <ol><li> Verdoven van het proefdier met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) / medische kwaliteit O 2 of een andere goedgekeurde methode. 15 &#39;12 dieren moeten voortdurend worden gecontroleerd om een adequaat niveau van anesthesie te garanderen. Ststaat ademfrequentie en teen knijpen reactie worden gebruikt om de juiste verdoving bevestigen. Opmerking: Euthanaseren het dier volgens de goedgekeurde IACUC protocollen. Bij de voltooiing van alle niet-survival procedures euthanaseren diep verdoofde dieren door thoracotomie induceren pneumothorax aan de humane ondergang van het dier 12 te waarborgen. </li><li> Plaats de rat op een temperatuur-gecontroleerde chirurgische tafel in een liggende positie. Met behoud van een goede verdoving diepte, maakt een incisie van ongeveer 5 cm in lijn met de linker nier en de distale abdominale aorta bloot te leggen. </li><li> Wikkel een ligatuur rond de buikholte en de superieure mesenteriale slagaders, en de abdominale aorta boven deze slagaders, maar niet ligeren. Wikkel twee ligaturen rondom de abdominale aorta onder de nierslagaderen. </li><li> Klem de abdominale aorta boven de ligaturen. Bind de lagere ligatuur. Katheteriseren de abdominale aorta met een polyethyleen buis (PE50). Zet de katheter met de tweede aorta ligatuur. </li><li> Verwijder de klem en ligeren de mesenteriale en coeliakie slagaders. Perfuseren van de nier bij 6 ml / min met Hanks gebalanceerde zoutoplossing bij kamertemperatuur 2-3 min tot de nier volledig geblancheerd. </li><li> Accijnzen de nier en de katheter, verbonden gedeelte van de aorta. Plaats de nier in een 3 ml petrischaal gevuld met badoplossing. Opmerking: Experiment protocol kan bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. De badoplossing bevat in mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH 7,35 ingesteld met NaOH. </li></ol></li><li> Chirurgie voor in vivo <ol><li> Verdoven van de rat met behulp van goedgekeurde IACUC protocollen. Voor in vivo analyse verdoven de ratten met ketamine (20 mg / kg im) en inactine (50 mg / kg ip). Dieren moeten voortdurend worden gecontroleerd om een ​​adequaat niveau van anesthesie te garanderen. Een stabiele ademhaling en teen knijpen reactie worden gebruikt om de juiste verdoving bevestigen. </li><li> Na een goede verdoving diepte is te verkrijgened, plaats de rat in een liggende positie op een temperatuur-gecontroleerde geaard oppervlak ligt aan de lucht tafel. De ondergrond moet worden voorverwarmd en gehandhaafd op 36 ° C. </li><li> Met behoud van goede verdoving diepte, maakt een incisie van ongeveer 5 cm overeenkomstig de nieren. </li><li> Gebruik een hechting te buigen en verankeren de huid en onderhuids weefsel, zodat het hele nier zichtbaar. Plaats de nier in een nier cup elke beweging artefacten te minimaliseren. </li><li> Gebruik een intraveneuze infusie van 2% BSA: 0,9% NaCI bij 1 ml / 100 g / uur via de jugulaire ader bloedvolume te handhaven. Canule beide urineleiders voor urine collectie. Plaats de banden rond de superieure mesenteriale en coeliakie slagaders en de distale aorta voor het manipuleren van renale perfusie druk (figuur 10A). </li><li> Indien de toepassing van farmacologische middelen is vereist tijdens de in vivo experimenten, is het inbrengen van een katheter interstitiële aanbevolen (figuren 10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> 3. Data Acquisition Setup <ol><li> Open het data acquisitie programma en stel de polariteit zowel ex vivo en in vivo experimenten om anodische positief. Stel het programma om gegevens op te slaan als ASCII-code. </li><li> Plaats de micromanipulators snel inbrengen van de sensoren in de nieren. OPMERKING: U kunt ook gebruik maken van een dummy sonde verbonden aan de micromanipulator te helpen bereiken van de gewenste plaatsing van sensoren. </li><li> Ex vivo data-acquisitie <ol><li> Perfuseren de nieren badoplossing (van 2.1.6) via de aorta canule met een constante snelheid van 650 ul / min. Met behulp van chirurgische schaar, verwijder voorzichtig de nier capsule, die nodig is voor de sensor inbrengen is. </li><li> Zet de nieren met elastiekjes vastgebonden over de nieren en aan de siliconen beklede schaal met pinnen. </li><li> Plaats de referentie-elektrode nabij de nieren in de petrischaal met ondergedompelde inde bufferoplossing. </li></ol></li><li> In vivo data acquisitie <ol><li> Plaats de nier in een nier cup. Afhankelijk van de soort en de leeftijd van het dier gebruik een gewenst kopje dat de nier losjes houdt. Figuur 8 toont twee maten nier cups. Soortgelijke cups worden gebruikt voor verschillende fysiologische benaderingen gericht op de analyse van nierfunctie zoals micropuncture etc 16. Opmerking: De positie van de nier cup is cruciaal voor de mechanische geluid van het dier ademhaling verwijderen maar mag niet verstoren of blokkeren nier perfusie of urinestroom. </li><li> Sta 45 min van herstel tijd voor het uitvoeren van het verzamelen van gegevens. </li><li> Met een 26-30G naald, maak een gaatje op de gewenste locatie en diepte van de sensor in de nier. Dep het oppervlak gat straalde bloed te verwijderen. Voeg glycerol oplossing aan het oppervlak van de nier. Dit voorkomt dat de nier oppervlak uitdroogt tijdens het experiment. </li&gt; <li> Verwijder de eerste sensor van de rehydratie kamer en bevestig deze aan de micromanipulator. Snel, binnen 20 seconden, plaats de elektrode in de vers gemaakt gat in de nier. Herhaal stap 3,5-3,9 voor de nul sensor. </li><li> Plaats de referentie-elektrode in de nier, ongeveer 1 cm vanaf de sensoren. </li></ol></li><li> Zet de potentiostaat en activeert het opnameprogramma op de computer. Figuur 9 toont de uiteindelijke opstelling van de ex vivo nier data acquisitie. Figuur 10 toont de uiteindelijke opstelling van de in vivo nier data acquisitie met een ingebrachte katheter. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Importeer het ASCII-gegevensbestand in Origin of enige andere gelijksoortige software. </li><li> Concentratie huidige relatie <ol><li> Gebruik de lineaire fit / extrapoleren functie om een lineaire concentratie (x-as) te bouwen om de huidige (y-as) relatie voor de ATP of H 2 </sub&gt; O 2 kalibratiepunten (figuren 6 en 7). lineaire fit lijn: y = mx + b </li></ol></li><li> Gelijk de stroom concentratie </li><li> Trek de gemeten sporen van de null sensor van die van de ATP sensor om de werkelijke stroom door intracellulair ATP verkrijgen. </li><li> Omzetten van de ATP-waarden in pA verkregen door amperometrie aan nm met behulp van de kalibratie vergelijking beschreven in 4.2.1. Bepaal de concentratie van de data afgetrokken spoor van de ATP sensor door de invoer van elke ingestelde stroom in de &quot;x&quot; waarde en het oplossen van y (de concentratie analyt). </li><li> Evenzo berekent H 2 O 2 concentratie van de kalibratievergelijking indien nodig. </li></ol>

<ol><li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li>
<li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li>
<li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li>
<li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li>
<li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices%3A+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li>
<li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger%2C+H2O2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li>
<li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li>
<li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747(2014).</li>
<li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+depolarization+evokes+ATP%2C+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus%3A+a+microelectrode+biosensor+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li>
<li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes%3A+potential+roles+in+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li>
<li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats%3A+role+in+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li>
<li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li>
<li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1(2014).</li>
<li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+electrode+biosensors%3A+theory+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem+Anal%22%5BJournal%5D)">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li>
<li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li>
<li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li>
<li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li>
<li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li>
<li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly%28pyrrole-ammonium%29+and+poly%28pyrrole-lactobionamide%29+films+as+host+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li>
<li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li>
<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li>
<li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li>
</ol>

Sensoren voor de video-opname van dit manuscript werden door Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Verenigd Koninkrijk).

De huidige protocollen werden ontwikkeld om verbeterde temporele en ruimtelijke resolutie van ATP te bieden en H 2 O 2 signalering voor ex vivo geïsoleerde, geperfuseerd en in vivo bloed geperfundeerde nieren. De verschillen tussen de protocollen en de hier gebruikte sensoren zorgen voor een optimale data-acquisitie voor zowel farmacologische middelen of fysiologische studies. De protocollen bestaan ​​uit 1) sensorkalibratie, 2) chirurgische ingreep, 3) data-acquisitie setup, en 4...

Enzymatische micro-elektrode biosensoren (ook genoemd sensoren in dit manuscript) een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van dynamische processen signalering in levende cellen en weefsels is. De sensoren zorgen voor meer temporele en ruimtelijke resolutie van cell signaling moleculen in biologisch relevante concentraties. In plaats van bemonstering en analyse extracellulaire vloeistoffen genomen met tussenpozen gedurende lange tijdsperioden, deze sensoren antwoorden zo snel als de enzymen reageren op de analyt, onder vorming van real-time metingen 1,2. Snelle detectie van interstitiële concentraties van autocriene en paracriene factoren, zoals purinen of waterstofperoxide en de dynamiek van de vrijgave kan worden gebruikt om een profiel vast te stellen voor de effecten van drugs in normale en pathologische condities 3. Momenteel is de meerderheid van de applicaties met behulp van sensoren in hersenweefsel plakjes en celculturen 4-10 geweest. De protocollen beschreven in dit manuscript doelroepen om real-time concentraties analyten geheel nieren nauwkeurig te meten. De volgende protocollen werden ontwikkeld om interstitiële ATP en H 2 O 2 signalering in nieren bestuderen. In de natuurlijke omgeving van de nier, wordt extracellulair ATP snel gekataboliseerd door endogene ectonucleotidases in zijn derivaten (ADP, AMP en adenosine). De hier gebruikte sensoren zijn zeer selectieve ATP boven andere purines of ATP afbraakproducten 11. Dit biedt een groot voordeel omdat het maakt nauwkeurige controle van de constante en dynamische concentraties ATP vrijgave en de signaleringsfunctie. Interstitiële ATP concentratie wordt gemeten met de combinatie van twee micro-elektroden, een ATP sensor en een sensor Null. De Null sensor in combinatie met catalase toepassingen kan interstitiële detecteren H 2 O 2 concentraties 12. De volgende protocollen gebruik maken van twee verschillende ontwerpen van Sensors die optimale eigenschappen voor zowel ex vivo en in vivo toepassingen. Beide ontwerpen zijn gebaseerd op de achtereenvolgende katalytische omzetting van glycerol kinase en glycerol-3-fosfaat oxidase in een sensor enzymatische laag en wordt aangedreven door de aanwezigheid van ATP. In de set van sensoren die worden gebruikt in de ex vivo studies, H 2 O 2, het uiteindelijke enzymatische reactie product, wordt gedetecteerd door oxidatie over een platina / iridium (Pt-Ir) draadelektrode. Sensoren voor in vivo studies in plaats daarvan gebaseerd op H 2 O 2 korting op een mediator beklede gouden electrode ontworpen voor bloed geperfuseerde weefsel. Weergegeven in figuur 1 is een schema van beide protocollen in dit manuscript beschreven. De Null sensor identiek is met het overeenkomstige ATP sensor behalve het mist de gebonden enzymen. Daarom, in aanvulling op de detectie van H 2 O 2 met catalase enzym, de Null sensor meagelen niet-specifieke storingen. ATP concentraties worden berekend door de niet-specifieke Null gedetecteerde storingen en achtergrond H 2 O 2 van het ATP sensorsignaal. Meerdere sensoren zijn ook commercieel beschikbaar voor andere analyten zoals adenosine, ionosine, hypoxanthine, acetylcholine, choline, glutamaat, glucose, lactaat, d-serine voor ex vivo toepassingen of adenosine, ionosine en hypoxanthine voor in vivo detecteren wanneer deze is gekoppeld met de bijbehorende Null sensor. Het vermogen van de sensor om nauwkeurig te detecteren analyten afhankelijk van de juiste pre- en post kalibraties 13. Dit zorgt ervoor dat de analyse verklaart de drift in sensorgevoeligheid die tijdens gebruik in biologische weefsels. De sensor heeft een depot van glycerol die wordt gebruikt als een reagens in de sensor enzymatische reacties. Als de sensor niet wordt gebruikt in bad oplossingen die glycerol, zal het uitspoelen tijd. Kortere rOpnam tijden zijn dan nodig om de sensor drift minimaliseren. Bovendien sensor aangroei van endogene proteasen en eiwitfragmenten kan sterk verminderen de gevoeligheid van de sensoren 14. De onderhavige manuscript stelt het gebruik van micro-electrode enzymatische biosensoren voor ex vivo en in vivo nieren preparaten. Real-time te analyseren kwantificering biedt ongekend detail van cellulaire signalering die nieuwe inzichten in de mechanismen van nierziekten en farmacologische middelen kunnen onthullen.

<table><tbody><tr><td>Sensor Kit</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>Het kit bevat opslagfles, rehydratiekamer, elektrodenleidingen en referentie-elektroden.&nbsp; Ook inbegrepen in het kit is de keuze van de gebruiker van sensoren.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>Bewaar op 2-8 oC vóór gebruik</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 μm</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>Bewaar op 2-8 oC vóór gebruik</td></tr><tr><td>Sarissaprobe null sensor 125 μm</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>Bewaar op 2-8 oC vóór gebruik</td></tr><tr><td>Sarissagold null sensor 50 μm</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>Bewaar op 2-8 oC vóór gebruik</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Manual</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td></tr><tr><td>Faraday kooi&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual kanaal potentiostaat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Type II Faraday kooi</td></tr><tr><td>Data acquisitieprogramma</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Perfusiepomp</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>Vezeloptische verlichter</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator magnetische standaard</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>luchttafel</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>isofluraan ventilator</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>naald</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>pinnen</td><td></td><td></td><td>Standaard dissectiepinnen</td></tr><tr><td>katheter</td><td></td><td></td><td>Polyethyleen buis (PE50)</td></tr><tr><td>katheter weefsel lijm</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>naad</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>rubberen banden</td><td></td><td></td><td>elke 2-4 mm brede rubberen banden</td></tr><tr><td>silicone</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>klem</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>standaard dissectiekit</td><td></td><td></td><td>Kit moet scalpel en dissectie schaar bevatten&nbsp;</td></tr><tr><td>Nierbeker</td><td></td><td></td><td>Van eigen ontwerp</td></tr><tr><td>standaard chemicaliën</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP oplossing</td></tr><tr><td>waterstofperoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isofluraan</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

het gebruik van enzymatische biosensoren te kwantificeren endogene atp of h<sub&gt; 2</sub&gt; o<sub&gt; 2</sub&gt; in de nier

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatische micro-elektrode biosensoren zijn op grote schaal gebruikt om extracellulaire signalen in real-time te meten. De meeste van hun gebruik is beperkt tot hersencoupes en neuronale celkweken. Recentelijk is deze technologie toegepast op het gehele organen. Vooruitgang in de sensor ontwerp hebben mogelijk gemaakt door het meten van cell signaling in-bloed perfusie in vivo nieren. De huidige protocollen lijst van de stappen die nodig zijn om de ATP en H 2 O 2 signalering in de rat nier interstitium meten. Twee afzonderlijke sensor ontwerpen worden gebruikt voor ex vivo en in vivo protocollen. Beide sensoren zijn bedekt met een dunne enzymatische biolayer bovenop een perm-selectiviteit laag snel reageert gevoelige en selectieve biosensoren geven. De perm-selectiviteit laag beschermt het signaal van de interfererende in biologisch weefsel, en de enzymatische laag maakt gebruik van de opeenvolgende katalytische omzetting van glycerol kinase en glycerol-3-fosfaatfosfaat oxidase in de aanwezigheid van ATP H 2 O 2 produceren. De set van sensoren die worden gebruikt voor de ex vivo studies verder gedetecteerd analyt door oxidatie van H 2 O 2 op een platina / iridium (Pt-Ir) draadelektrode. De sensoren voor de in vivo studies worden in plaats daarvan gebaseerd op de reductie van H 2 O 2 op een mediator beklede gouden electrode ontworpen voor bloed geperfuseerde weefsel. De eindconcentratie wijzigingen worden gedetecteerd door real-time amperometrie gevolgd door kalibrering met bekende concentraties analyt. Bovendien kan de specificiteit van de amperometrische signaal bevestigd door de toevoeging van enzymen zoals catalase en apyrase die breken H 2 O 2 en ATP dienovereenkomstig. Deze sensoren ook sterk afhankelijk van nauwkeurige ijking vóór en na elk experiment. De volgende twee protocollen stellen de studie van real-time detectie van ATP en H 2O 2 in nierweefsels en kunnen verder worden gemodificeerd om de beschreven werkwijze te breiden voor gebruik in andere biologische preparaten of hele organen.

Het ontwerp van de micro-elektrode enzymatische biosensor maakt het real-time detectie van analyten geheel nieren. Het algemene experiment ontwerp voor zowel ex vivo en in vivo studies wordt geïllustreerd in figuur 1 .De sensors gebruikt en de chirurgische procedures verschillen naargelang de studie is ex vivo of in vivo. Om reproduceerbare resultaten nauwkeurig pre- en post kalibraties verkrijgen cruciaal. Figuur 6A</stro...

Enzymatische micro-elektrode biosensoren maken real-time metingen van extracellulaire celsignalering in biologisch relevante concentraties mogelijk. De volgende protocollen breiden de toepassingen van biosensoren uit naar de ex vivo en in vivo detectie van ATP en H2O2 in de nier.

Het gebruik van enzymatische biosensoren te kwantificeren endogene ATP of H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; In de nier

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Het algemene doel van deze procedures is om de endogene interstitiële concentraties van een TP en waterstofperoxide in gehele nieren in real-time te meten. Dit wordt bereikt door eerst sensoren te rehydrateren en te kalibreren voor ex vivo en in vivo toepassingen naar bekende concentraties van een TP en waterstofperoxide. Voor de ex vivo installatie van de sensor werd de nier chirurgisch geïnstrumenteerd en gereinigd van bloed.Deze procedure wordt uitgevoerd door de nier via de aorta door te spoelen. Vervolgens wordt de ratnier chirurgisch geïsoleerd, in een registratiekamer geplaatst en geperfuseerd met zoutoplossing. Een TP en waterstofperoxide worden gemeten met ex vivo sensoren voor de in vivo procedure.Er wordt een incisie gemaakt om visualisatie van de doorbloede nier mogelijk te maken. De nier wordt in de stabilisatiekap geplaatst en er kan een interstitiële katheter worden geïnstalleerd voor de toediening van geneesmiddelen. Verder worden de interstitiële renale ATP- en waterstofperoxideconcentraties gemeten met in vivo sensoren.Uiteindelijk faciliteren deze protocollen het gebruik van enzymatische micro-elektrode biosensoren voor real-time metingen van TP en waterstofperox

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De effecten van activering van eiwit kinase C (PKC) isozymen op mitochondriële functies geassocieerd met ademhaling en oxidatieve fosforylering en cellevensvatbaarheid beschreven. De aanpak past adenovirale techniek om selectief PKC overexpressie isozymen in primaire celkweek en verschillende assays voor mitochondriële functies en energie status van de cel te bepalen.

Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

This video demonstrates a thin-layer chromatography-based enzyme assay to determine pyrophosphokinase activity using radiolabeled nucleotides. The method provides insights into nucleotide synthesis and phosphotransfer reactions.

Thin Layer Chromatography Based Enzyme Activity Assay: A Technique to Determine In Vitro Pyrophosphokinase Activity Using Thin Layer Chromatography

We beschrijven een methode om de activiteit van K+-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb+ of Li+ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

We beschrijven het gebruik van twee ratiometrische, genetisch gecodeerd biosensoren, die zijn gebaseerd op GFP, om mitochondriale redox staat en ATP-spiegels te controleren bij subcellulaire resolutie in levende gistcellen.

Ratiometrische Biosensoren dat mitochondriaal Redox Staat en ATP Meet in Living gistcellen

Hier beschrijven we biochemische analyses die kunnen worden gebruikt om ATP-afhankelijke chromatine-hermodelleringsenzymen te karakteriseren op hun vermogen om 1) ATP-afhankelijk nucleosoomglijden te katalyseren, 2) te interageren met nucleosoomsubstraten en 3) ATP te hydrolyseren op een nucleosoom- of DNA-afhankelijke manier.

Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.

Meten<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Proteasen zijn strak gereguleerde enzymen die betrokken zijn bij de fundamentele biologische processen en dysregulated protease-activiteit stations progressie van complexe ziekten zoals kanker. Doel van deze methode is het creëren van nanosensors die door het produceren van een decollete-signaal dat is aantoonbaar uit host urine en discrimineert ziekte protease activiteit in vivo meten.

Nanosensors om te detecteren Protease activiteit In Vivo Noninvasive Diagnostics

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

De Protease Fluorescent Detection Kit is ontworpen voor de meting van de protease-activiteit met behulp van fluorometrie. Het is ook geschikt voor de detectie van sporen van protease besmetting. De methode is gebaseerd op de proteolytische hydroysis van een eigen formulering van een FITC-gelabelde caseïne substraat.

Gebruik van de Protease Fluorescerende Detection Kit om Protease activiteit te bepalen

Leer hoe u enzymatische micro-elektrode biosensoren gebruikt voor real-time meting van ATP en waterstofperoxide in nierweefsel. Deze methode maakt ex vivo en in vivo toepassingen mogelijk.

Het gebruik van enzymatische biosensoren te kwantificeren endogene ATP of H

Meer video's verkennen