Name: Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Leer een colliculo-thalamocorticale hersensnijtechniek voor auditieve neurowetenschap met behulp van muizenhersenen. Deze methode behoudt de integriteit van belangrijke auditieve verbindingen voor verder onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 aan D. A. Llano en F31-DC-013501 aan B. J. Slater, evenals de Carver Foundation.
De auteurs willen Jason MacLean en Matthew Banks bedanken voor het technische advies met calciumbeeldvorming.

Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Illinois. Alle dieren werden ondergebracht in dierlijke zorginstellingen door de Amerikaanse Vereniging voor Accreditatie van Laboratory Animal Care goedgekeurd. Elke poging werd gedaan om het aantal gebruikte dieren zoveel mogelijk te beperken en om lijden te verminderen in alle fasen van het onderzoek. 1. Voorbereiding op en verwijdering van de hersenen van de muis te snijden <ol><li> Bereid je voor perfusie en slice incubatie. <ol><li> Ongeveer 30 minuten alvorens te snijden, bereiden hoge sucrose snijden oplossing en lage calcium aCSF voor incubatie van de slice voorafgaand aan de opname of beeldvorming. </li><li> Lay-out van alle noodzakelijke instrumenten (grote stomp uiteinde schaar, kleine lente schaar, anatomische pincet, grote schaar of guillotine, iris schaar, juweliers tang, 10 ml spuit met 27G x 1/2 inch naald, klein stukje van 1 cm x 2 cm filter papier en een gebroken getipt Pasteur pipet voor slice transfer) voor perfusie en snijden, en voor te bereiden perfusie lade. </li><li> Opgezet incubatie kamer met zuurstofrijk aCSF in een 32 ° C waterbad en een cultuur schotel gevuld met cutting-oplossing. </li></ol></li><li> Bereid snijden podium voor het onderuit. <ol><li> Snij een klein stukje 3% agar ongeveer 1 cm tot 3 als een vangnet voor de hersenen en 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm voor een bult te gebruiken om het faillissement van de IC. </li><li> Lijm de terugloopblokkering op het podium met cyanoacrylaatlijm alsmede de bult aan de rechterzijde van de terugloopblokkering zodanig dat zij een 80 o hoek. </li></ol></li><li> Verwijder de hersenen. <ol><li> Diep verdoven een p12-p20 (idealiter p14-18) muis met ketamine 100 mg / kg en xylaxine 3 mg / kg (of vergelijkbare ethische commissie goedgekeurde procedure). Opmerking: Bevestig de juiste anesthesie-niveau via het gebrek aan reactie op teen knijpen. Aangezien het dier onder narcose kort oogzalf overbodig. </li><li> Met behulp van stompeeinde schaar, de ribbenkast blootstellen van het zwaardvormig proces om de hals. <ol><li> Vind de zwaardvormig proces, en maak een horizontale snede van ongeveer 1,5 cm. </li><li> Maak twee verticale delen uit de uiteinden van de vorige horizontale snede om de schouders, ongeveer 1,5 cm. </li></ol></li><li> Dwars door het middenrif en de costochondral knooppunten naar het hart bloot te leggen. </li><li> Met spring schaar, een kleine, 2-5 mm gesneden in het rechter atrium, van de ventrale voor van het hart dorsale. </li><li> Met behulp van een injectiespuit van 10 ml met een 27G x 1/2 inch naald, injecteren de linker hartkamer en snel perfuseren het dier met hoge sucrose snijden oplossing. </li><li> Zodra het bloed helder is, gebruiken grotere schaar om het hoofd te verwijderen. Let op: We hebben niet systematisch onderzocht het nut van perfusie. Echter, in onze ervaring, transcardiale perfusie in muizen deze jonge kan worden gedaan met bijna 100% succes, en heeft het voordeel van het elimineren van rode blood cellen, die fluoresceren en interfereren met beeldvorming. </li><li> Snijd de huid beneden de middellijn aan de schedel bloot te leggen. </li><li> Met behulp van gebogen iris schaar, knip de schedel tussen de ogen, dan vanaf de snede tussen de ogen, zorgvuldig gesneden van anterior naar posterior over de middellijn hechting verzorgen niet naar de hersenen eronder beschadigen. Opmerking: De dura komt meestal af met de schedel. Indien nodig, verwijder de dura voordat zorgvuldig verwijderen van de hersenen. </li><li> Met behulp van een tang juweliers, wrikken open de schedel en verwijder voorzichtig de hersenen, plaats dan de hersenen in het snijden oplossing. Zorg om beschadiging van de cortex. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiden Brain voor snijden <ol><li> Het voorbereiden van de hersenen voor montage op vibratome podium. <ol><li> Met behulp van een slide gemarkeerd met twee lijnen bij 90 ° en een diagonale lijn op 17 o van linksboven naar rechtsonder, waar de twee kruisende lijnen samenkomen, plaats de hersenen dorsale kant naar boven, viaeen scheermesje, verwijder 2-4 mm van de rostrale einde hersenen waardoor een vlakke ondergrond. </li><li> Plaats de hersenen caudale kant naar boven op de nieuw gecreëerde plat oppervlak, en lijn het dorsale oppervlak van de hersenen met de horizontale en de middellijn van de hersenen met de verticale lijn. </li><li> Lijn het scheermes met de 17 o lijn, tilt het scheermes in een hoek van 30 ° en verwijder ongeveer 3 mm van de rechter cortex in een dubbele diagonale snede (17 o van horizontale vlak en 60 ° van de coronale). </li></ol></li><li> Montage hersenen op vibratome podium. <ol><li> Leg een klein stukje filtreerpapier 1 cm x 2 cm aan de ventrale kant van de hersenen zodat de lengterichting loodrecht op de middellijn. </li><li> Gelden voorzichtig een kleine hoeveelheid cyanoacrylaat lijm op het gebied voor de terugloopblokkering (en links van de bump). </li><li> Plaats een dubbele schuin gesneden hersenen gezicht om de lijm, zodat het caudale deel van de hersenen en achterhersenen zijn prstatus krijgen op de bult en de rechterkant van de hersenen tegen de backstop. </li><li> Fijn druk op het brein, zodat het gehele oppervlak in contact met het snijden kamer. </li></ol></li></ol> 3. Het verkrijgen van de Colliculo-thalamocorticale Slice <ol><li> Neem snel de snij podium en plaats in de vibratome, vullen het podium met het snijden oplossing. </li><li> Lijn het mes met de bovenkant (ventrale zijde) van de hersenen. </li><li> Verwijder 1-1,5 mm vanaf de bovenkant van de hersenen, verwijder 300-500 urn plakjes en evalueren diepte na verwijdering. Opmerking: Wanneer de IC, de MGB, en de laterale nucleus geniculate (LGN) zijn alle zichtbare, en de dentate gyrus vormt een &#39;C&#39; vorm te krijgen 01:59 600 micrometer plakjes. Zie figuur 3A. </li><li> Plaats plakken in verwarmde (32 ° C) houden kamer. </li></ol> 4. Imaging van de Slice <ol><li> Voorbereiding voor flavoproteïne autofluorescentie imaging. <ol> &lt;li&gt; Bereid aCSF voor perfusie van segment in een standaard elektrofysiologische opname kamer, bubble aCSF met 95% O2 / 5% CO 2. </li><li> Trek glas elektrode voor stimulatie. Merk op dat meerdere verschillende stimulerende elektroden en configuraties (glas, wolfraam, carbon fiber, monopolaire, bipolaire) Alle werken heel goed samen met flavoproteïne autofluorescentie imaging. </li><li> Zet de computer, camera, micromanipulator, lichtbron, stimulatie software, image capture software. </li><li> Perfuseren de opname kamer met zuurstofrijk aCSF, plaatst aangepaste brug (ontwerp beschikbaar in Aanvullende Materials) om slice te verheffen in de kamer. Opmerking: perfusiesnelheid kan variëren met elke individuele opgericht; 5-15 ml / min wordt hier gebruikt. </li><li> Plaats slice in de kamer, hoe lager het vloeistofniveau in de kamer om te voorkomen dat de slice van het opheffen van de brug, terwijl het plaatsen van speciaal gebouwde harp dan slice, zorg om te voorkomen dat het plaatsen van harp snaren dan paden van interest (Figuur 1A). Verhoog vloeistofniveau tot ongeveer 1-2 mm boven slice te aCSF stroom boven en onder de plak te handhaven. Opmerking: Als herpositionering nodig is, gebruik maken van de gebroken einde Pasteur pipet of laat de aCSF niveau te stijgen en een tang met uiterste zorg. </li><li> Plaats zilverchloride elektrode in glas elektrode gevuld met aCSF, plaatst het glas elektrode in micromanipulator en verbinding te isolator stimulus, en zorgvuldig plaats glazen elektrode in IC / witte stof leidt tot thalamus (zie figuur 1A). </li></ol></li><li> Flavoproteïne autofluorescentie beeldacquisitie. <ol><li> Verzamel beelden met 4 Hz (onder toepassing van een oneindig gecorrigeerde 2X macro objectief (NA 0,13)) en een camera 105 sec, terwijl het elektrisch stimuleren (elk stimulatiekanaal uit 1 sec van 40 Hz 2 msec pulsen weefsel bij 0,05 Hz vijfmaal) terwijl lichtdoorlatende het weefsel met blauw licht 470-490 nm en het vastleggen van boven 515 nm. Zorg ervoor dat het beeld is niet aano donker, noch geblazen zie figuur 3 linkerkolom voor referentie. Opmerking: Collection tijd verzamelen frequentie en stimulatiefrequentie kan worden gewijzigd om het experiment aangepaste programma opgenomen in aanvullende materiaal kan worden gemodificeerd als zodanig aan te passen. </li><li> Afbeeldingen exporteren naar Matlab, en het gebruik van de op maat geschreven programma beschikbaar in aanvullende materialen om spectrale kracht van de beelden te analyseren op 0,05 Hz. Het resulterende beeld wordt aangesloten wegen tonen. Opmerking: Het aangepaste programma gebruikt een snelle Fourier-transformatie van de pixelwaarden in de tijdreeks om het beeld te produceren. </li></ol></li><li> Voorbereiding voor calcium beeldvorming. <ol><li> Bereid kleine incubatiekamer behulp van een 3 cm cultuur schotel en getogen cultuur membraan om aCSF aan zowel de boven- en onderkant van de slice en plaats te bereiken op een verwarmingselement om de temperatuur te handhaven op ongeveer 32 o C. </li><li> Vul kleine incubatiekamer met warme aCSF en langzaam bel met 95% O2/5% CO 2. </li><li> Meng 2 pl Pluronic F-127 zuur en 50 ug 02:00 Fura-opgelost in 48 pl DMSO. </li><li> Plaats slice in kleine incubatiekamer op verhoogde membraan en voorzichtig met een micropipet toe kleuring mengsel direct boven de MGB (of een andere structuur van belang). </li><li> Cover plakjes bleken voorkomen voorafgaand aan beeldvorming en laat plakken incuberen 45 minuten - 1 uur. </li><li> Verwijder plakjes tot verhitte houden kamer voor 10-15 minuten te wassen overtollig materiaal. </li><li> Volg de stappen 4.1.1 tot 4.1.6 voor de voorbereiding te stimuleren en het imago van de colliculo-thalamocorticale slice. </li></ol></li><li> Calcium beeldacquisitie. <ol><li> Verzamel beelden bij 10 Hz (met behulp van een 20X water immersie objectief) voor 25 sec, terwijl het elektrisch stimuleren (elk stimulatie bestaat uit een 2 msec puls) weefsel op 0,2 Hz vijf keer terwijl het verlichten van het weefsel met 365 nm licht en het vastleggen van fluorescentie boven 510 nm. </li&gt; <li> Afbeeldingen exporteren naar Matlab en het gebruik van de op maat geschreven programma beschikbaar in aanvullende materialen om spectrale kracht van de beelden te analyseren op 0,2 Hz. Het resulterende beeld zal actieve cellen vertonen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li>
<li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+%28barrel%29+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li>
<li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+thalamocortical+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+meth%22%5BJournal%5D)">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li>
<li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li>
<li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li>
<li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li>
<li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li>
<li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Paradigm+for+Optical+Imaging%3A+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li>
<li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li>
<li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse%3A+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft verbeteringen ten opzichte van een eerder beschreven colliculo-thalamocorticocerebrale herfsnede bij p12-20 muis om de informatiestroom in het gehoorsysteem te bestuderen1. Deze methode heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere, vergelijkbare, herfsnede bereidingen door het behoud van verbindingen tussen meer hersengebieden in een enkele snede, wat onderzoekers nieuwe hulpmiddelen biedt om de interactie en het samenspel tussen auditieve kernen in de voorhersenen te begrijpen. E...

In het gehoorsysteem, hoewel er een aanzienlijke verwerking van informatie tussen de sensorische periferie en de inferior colliculus, er aanzienlijke extra bewerkingen voordat de auditieve cortex bereikt. We weten heel weinig over hoe dat de verwerking wordt gedaan en dus weinig over hoe die transformatie kan de hersenen om binnenkomende zintuiglijke informatie te interpreteren. Met uitzondering van de reukzin elk van de betekenissen heeft een soortgelijke organisatie met perifere signalen aanvankelijk doorgifte met high fidelity die afneemt als het signaal stijgt naar de cortex. De cortex stuurt projecties lagere structuren om de binnenkomende gegevens verder te moduleren. Dit complex systeem werd bestudeerd op verschillende wijzen in vivo als in een aantal in vitro preparaten. In het eerste, alle verbindingen intact zijn, zodat de onderzoeker aan een set van verbindingen sonde, terwijl het beheersen van de zintuiglijke input en metenproductie in een bepaalde omgeving. Met deze benadering is er weinig tot geen controle over de grote verscheidenheid van andere inputs, waaronder andere sensorische inputs, opwinding en aandacht, hetgeen leidt tot een intens complex uitgang. In vitro, hebben hersenen plakjes gesneden tot een enkele set vangen projecties, of twee verbonden hersengebieden, die het mogelijk maken de onderzoekers te stimuleren en te evalueren diverse afferenten of hersengebieden. Deze zijn vaak ofwel thalamocorticale of tectothalamic segmenten wanneer hetzij de inbreng in de thalamus of de thalamus en de uitvoer naar de cortex bewaard 2-5. Deze preparaten maken een groot aantal farmacologische, elektrische en optogenetic manipulaties. Maar met slechts twee hersengebieden, zij hoofdzakelijk beoordeelt de informatieoverdracht en missen het vermogen om de transformatie van informatie te beoordelen als het door de thalamus passeert. Ook de reticulo-thalamische projectie, die een rol kunnen spelen in de aandacht modulatie 6-9 pr isESENT in dit stukje. Hier laten we verbeteringen bij onze voorafgaande conditionering 1, waarbij de onderzoeker controle van diverse input voor de thalamus toelaat een uniek perspectief hoe de thalamus poorten en filters informatie. Koppelen we deze roman slice voorbereiding met flavoproteïne autofluorescentie imaging voor het beoordelen van slice connectiviteit en grootschalige activering analyse, calcium beeldvorming in de thalamus voor neuronale populatie analyse en enkele cel opname om de impact van de verschillende ingangen op een enkele cel niveau te meten. Om u te helpen bij het handhaven van deze wijdverspreide verbindingen hebben we ontwikkelde ook een aantal wijzigingen van de normale slice anker (aka &quot;harp&quot;) voor het houden van de hersenen slice op zijn plaats en een brug naar de slice voor een betere doorbloeding te verheffen. De harp is ontworpen in een gewijzigde hoefijzervorm aan de slice omringen en zorgen voor aanpasbare bevestigingspunten voor de harp snaren. Drie snaren zijnverbonden zodanig dat i) een horizontaal ligt langs de mediale rand van de plak, ii) een zich vanaf de caudale kant van de IC aan de caudale kant van de AC en iii) een zich diagonaal uitstrekt vanaf de mediale rand van het segment naar een gebied rostraal van de AC (zie figuur 1A). Kleine inkepingen in het frame voor het verlijmen (met cyanoacrylaatlijm) van de harpsnaren zorgen voor een verlaagde hoeveelheid druk op het segment om slice integriteit te behouden (zie figuur 1B). Door driedimensionale afdrukken, kunnen wij aangepaste ontwerp harpen onze unieke specificaties en bruggen die het mogelijk maken ideale stroming van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) boven en onder het weefsel. Dit houdt ook grote gebieden voor licht aan het weefsel voor patch clamp elektrofysiologie dringen.

<table><tbody><tr><td>Hoge sucrose snijoplossing</td><td></td><td></td><td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Lage calcium aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Stimulus Isolатор</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Lot: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Lot: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Lot: 1499369</td></tr><tr><td>Grote kweekschaal</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13</td><td>100 x 15 mm kweekschaal</td></tr><tr><td>Kleine kweekschaal</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm kweekschaal</td></tr><tr><td>Verhoogde kweekmembraan</td><td>Millicell</td><td>PICMORG50</td><td>Wordt gebruikt om geoxideerde vloeistofperfusie aan beide kanten van de slice te onderhouden.</td></tr><tr><td>Flavoproteïne beeldvorming fluorescentie kubus</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&ndash;490 nm excitatie, 505 nm dichroic, 515 nm emissie lange doorlaat. We hebben gevonden dat vrijwel elke groene fluorescentie-eiwitfilterkubus hier zal werken.</td></tr><tr><td>Calciumbeeldvorming fluorescentie kubus</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 365 nm excitatie, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emissie</td></tr><tr><td>Agar voor het blokkeren van hersenen</td><td></td><td></td><td>3% per gewicht in water</td></tr><tr><td>Viper si Stereo litografie apparaat</td><td>3D Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modificatie van een colliculo-thalamocorticale mouse brain slice, integratie 3-d printen van chamber components en multi-scale optische beeldvorming

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Het vermogen van de hersenen om sensorische informatie te verwerken, is afhankelijk van zowel opgaande als afgaande projecties. Tot voor kort was de enige manier om deze twee systemen en hun interactie te bestuderen door gebruik te maken van in vivo preparaten. Er zijn grote vooruitgangen geboekt met acute hersensneden die de thalamocorticale en cortico-thalamische paden bevatten in de somatosensorische, visuele en auditieve systemen. Met belangrijke verfijningen van onze recente modificatie van de auditieve thalamocorticale snede1 zijn we in staat om betrouwbaarder de projecties tussen de meeste van de belangrijke auditieve middenhersenen en voorhersenen structuren vast te leggen: de inferior colliculus (IC), mediale geniculate lichaam (MGB), thalamic reticulair nucleus (TRN) en de auditieve cortex (AC). Met delen van al deze verbindingen behouden, zijn we in staat om gedetailleerde vragen te beantwoorden die aanvullende informatie geven op de vragen die kunnen worden beantwoord met in vivo preparaten. Het gebruik van flavoproteïne autofluorescentie beeldvorming stelt ons in staat om snel de connectiviteit in elke willekeurige snede te beoordelen en het daaropvolgende experiment te leiden. Door gebruik te maken van deze snede in combinatie met opname- en beeldvormingstechnieken zijn we nu beter uitgerust om te begrijpen hoe informatieverwerking plaatsvindt op elk punt in de auditieve voorhersenen terwijl informatie opstijgt naar de cortex, en de impact van afgaande corticale modulatie. 3D-printen om componenten van de snedekamers te bouwen, maakt dubbelzijdige perfusie en brede toegang tot netwerken binnen de snede mogelijk en behoudt de wijdverbreide verbindingen die essentieel zijn voor het volledig gebruik van deze voorbereiding.

Een voorbeeld van colliculo-thalamocorticale muizenhersenen slice verkregen P15 muizen wordt weergegeven in figuur 2. De ideale plak de vier grote middenhersenen en de voorhersenen auditieve structuren IC, MGB, TRN, en AC, die allemaal geactiveerd wanneer de IC wordt gestimuleerd bevatten (Figuur 2A). Met behulp van Fourier-analyse, wordt het spectrale vermogen gemeten op de elektrische stimulatie frequentie, verbonden met hersengebieden blijkt activiteit die periodiek ...

Met behulp van meerdere hoeken om de muis pup hersenen snijden, verbeteren we op een eerder beschreven acute hersenen slice, die de verbindingen tussen de meeste van de grote auditieve middenhersenen en de voorhersenen structuren vangt.

Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van de corticale plak van de Calot Thal met vier belangrijke auditieve structuren: de nucleus colliculus inferior, de auditieve thalamus, het auditieve gedeelte van de nucleus reticularis thalami en de auditieve cortex. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen uit de muis te verwijderen. De tweede stap is het blokkeren van de hersenen ter voorbereiding op het snijden.Snijd vervolgens het brein om plakjes te verkrijgen die de corticale verbinding van de Calot-thal bevatten. De laatste stap is het gebruik van flavoproteïne-imaging om de connectiviteit te beoordelen. Uiteindelijk kan het breinplakje met de carotale corticale verbinding worden gebruikt voor diverse experimenten om de informatieverwerking in de auditieve regio's van het midden- en vierhersenen beter te begrijpen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen om het brein te blokkeren vóór het snijden moeilijk aan te leren zijn; dit vereist namelijk een complexe dubbele hoeksnede, wat cruciaal is voor het verkrijgen van intacte projecties.De techniek zal worden gedemonstreerd door BJ Slater, een promovendus in mijn laboratorium. Om de

modification-colliculo-thalamocortical-mouse-brain-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor...

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

In dit artikel presenteren we een eenvoudige, praktische techniek voor cerebrovasculaire gieten, dat is eenvoudig uit te voeren en kan worden gebruikt om het imago van de vasculaire boom van de volwassen hersenen van muizen.

Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

In dit protocol, updaten we de recente vooruitgang in de beeldvorming...

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

This video demonstrates the brain's neural activity recording through an optical window in transgenic mice. The mice express a fluorescent protein that enables the detection of neural activities. A small portion of the skull is carefully removed to install an optical window, and the skull is then covered with black cement to block light before imaging.

Installation of Optical Windows in the Brain of Transgenic Mice to Image Neural Activities

In dit artikel beschrijven we de volledige experimentele procedure te reconstrueren, met een hoge resolutie, de fijne hersenen anatomie van fluorescent gelabelde muis hersenen. De beschreven protocol bevat monstervoorbereiding en clearing, specimen montage voor imaging, data post-processing en multi-schaal visualisatie.

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Met behulp van MRI-scans (menselijk), 3D-beeldvormingssoftware en immunohistologische analyse documenteren we veranderingen in de laterale ventrikels van de hersenen. Longitudinaal 3D-mapping van veranderingen in het volume van de laterale ventrikels en de karakterisering van periventriculaire cellulaire veranderingen die optreden in de menselijke hersenen als gevolg van veroudering of ziekte worden vervolgens gemodelleerd bij muizen.

3D modellering van de laterale ventrikels en histologische karakterisering van periventriculaire Tissue bij de mens en muis

Hier presenteren we een procedure voor het uitvoeren van grootschalig Ca 2+ beeldvorming met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrij bewegende muizen. Honderden actieve cellen kunnen tegelijkertijd worden waargenomen met behulp van een miniatuur kop microscoop gekoppeld met een geïmplanteerde prisma sonde.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Beeldvorming in vrij bewegende muizen met prisma sonde en geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopie

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

Een innovatieve methode om uitbreidbare hersenmatrices te bouwen om zowel coronale als sagittale sneden te snijden, wordt beschreven voor toepassing op neonatale biggen. Deze budgetvriendelijke aanpak maakt gebruik van acrylplaten die zijn gesneden met sjablonen uit agarosegel-hersenvormen, wordt toegepast op meerdere soorten en maakt uitbreiding mogelijk om hersengroei mogelijk te maken.

Fabricage van een uitbreidbare hersenmatrix die aanpasbaar is over ontwikkelingsstadia

Leer een colliculo-thalamocorticale hersensnijtechniek voor auditieve neurowetenschap met behulp van muizenhersenen. Deze methode behoudt de integriteit van belangrijke auditieve verbindingen voor verder onderzoek.

Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming (Video) | JoVE Journal

Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming

Meer video's verkennen