Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming
September 18th, 2015
Met behulp van meerdere hoeken om de muis pup hersenen snijden, verbeteren we op een eerder beschreven acute hersenen slice, die de verbindingen tussen de meeste van de grote auditieve middenhersenen en de voorhersenen structuren vangt.
Het algemene doel van deze procedure is om de Calot Thal-corticale plak voor te bereiden met vier belangrijke auditieve structuren, de inferieure colus, de auditieve thalamus, de auditieve portie van de thalamische reticulaire kern en de auditieve cortex. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen van de muis te verwijderen. De tweede stap is om de hersenen te blokkeren ter voorbereiding op het snijden.
Vervolgens snijdt u de hersenen om plakken te verkrijgen die de Calot thal-corticale verbinding bevatten. De laatste stap is om flavoproteïnebeeldvorming te gebruiken om de connectiviteit te beoordelen. Uiteindelijk kan de hersensnede die de carotale corticale verbinding bevat, worden gebruikt voor verschillende experimenten om de informatieverwerking in de auditieve gebieden van het midden en de vier hersenen beter te begrijpen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen om de hersenen te blokkeren vóór het snijden moeilijk te leren zijn omdat het een complexe dubbele hoekige snede vereist, die essentieel is voor het verkrijgen van intacte projecties.
De techniek zal worden gedemonstreerd door BJ Slater, een afgestudeerde student in mijn laboratorium. Om de snedevoorbereiding voor het snijden voor te bereiden, snijdt u een klein stukje van 3% auger van ongeveer één kubieke centimeter om als achterstop voor de hersenen te worden gebruikt, en een ander stukje van 1,5 centimeter bij 1,5 millimeter bij drie millimeter om als uitsteekje te worden gebruikt om de inferieure colliculus te ondersteunen. Lijm vervolgens de achterstop op de trap met cyanoacrylaatkleefstof en lijm vervolgens het uitsteekje aan de rechterkant van de achterstop zodat ze een hoek van 80 graden vormen op een dia gemarkeerd met twee lijnen op 90 graden en een diagonale lijn op 17 graden van linksboven naar rechtsonder. Plaats de hersenen met de dorsale kant omhoog op het snijpunt van de twee lijnen. Gebruik een scheermes om twee tot vier millimeter van het rostrale uiteinde van de hersenen te verwijderen om een vlakke oppervlakte te creëren.
Plaats vervolgens de hersenen met de coddle-kant omhoog op het nieuw gecreëerde vlakke oppervlak. Lijn de dorsale oppervlakte van de hersenen uit met een horizontale lijn en de middenlijn van de hersenen met een verticale lijn gemarkeerd op de dia. Richt vervolgens het scheermes uit met een lijn van 17 graden.
Kanteel het scheermes in een hoek van 30 graden en verwijder ongeveer drie millimeter van de rechtercortex in een dubbele diagonale snede om de hersenen op de vibrato-trap te monteren. Plaats een klein stukje filterpapier op de ventrale kant van de hersenen zodat de lange dimensie loodrecht op de middenlijn staat. Breng voorzichtig een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatkleefstof aan op het gebied voor de achterstop en links van het uitsteekje.
Plaats vervolgens de dubbel diagonaal gesneden hersenenkant op de lijm zodat het coddle-gedeelte van de hersenen en de achterhersenen op het uitsteekje worden ondersteund en de rechterkant van de hersenen tegen de achterstop. In deze procedure plaatst u snel de snijtrap in de vibrato, bouwt u een trap met snijoplossing. Richt vervolgens het mes uit met de bovenkant van de hersenen.
Verwijder een tot 1,5 millimeter van de bovenkant van de hersenen. Snijd vervolgens en verwijder meer plakken van 300 tot 500 micrometer terwijl u dieper gaat. Wanneer de inferieure colliculus, de mediale ate-lichaam en de laterale ICT-kern allemaal zichtbaar zijn, zou de dentate gyrus er als een C-vorm uit moeten zien en de structuur zou in lijn moeten zijn.
Verkrijg ongeveer twee plakken van 600 micrometer. Dit zijn de carotale corticale plakken. Breng ze daarna over naar de houderkamer van 32 graden Celsius.
Om de Flavoproteïne Autofluorescentiebeeld te verkrijgen, verzamelt u de beelden bij vier hertz gedurende 105 seconden. Verlicht het weefsel met blauw licht van 470 tot 490 nanometer en leg boven de 515 nanometer vast om ervoor te zorgen dat het beeld niet te donker of te helder is. Gebruik vervolgens elektrische stimulatie om het weefsel te activeren om een calciumbeeld te verkrijgen.
Verzamel beelden bij 10 hertz gedurende 25 seconden. Verlicht het weefsel met 365 nanometer licht en leg fluorescentie boven 510 nanometer vast. Zorg er opnieuw voor dat het beeld niet te donker of te helder is.
Gebruik vervolgens elektrische stimulatie om de cellen te activeren. Dit beeld toont de bevestiging van de carotale corticale verbinding in de hersensnede door Flavoproteïne Autofluorescentie. Elektrische stimulatie gegeven op 0,05 hertz naar de inferieure colus werd afgebeeld bij vier hertz en vier verwerkt om de kracht bij die stimulatie te tonen.
Frequentie, de auditieve thalamus, thalamisch, reticulair, kern en auditieve cortex worden synaptisch geactiveerd. Hier is een onverbonden plak. Elektrische stimulatie van de inferieure colus met activering werd alleen gezien in de auditieve thalamus.
De hele route werd waarschijnlijk niet vastgelegd vanwege een van de sneden die iets uit het vlak was. Met Alam corticale projecties. Dit beeld toont atypische activering van de auditieve cortex.
Elektrische stimulatie van de inferieure colus activeerde de auditieve cortex zonder zichtbaar signaal. In de auditieve thalamus is het waarschijnlijk dat de thalamus nog steeds werd geactiveerd, maar het was niet op het beeldoppervlak. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een AAL-thalamische corticale plak kunt verkrijgen en de connectiviteit ervan kunt beoordelen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het bereiden van de Calot Thal corticale plak, met focus op belangrijke auditieve structuren in de muizenhersenen. De techniek verbetert het begrip van connectiviteit in auditieve regio's.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Auditieve verwerking
- Technieken voor hersenensnijden
Achtergrond
- Het onderzoek richt zich op het onderzoeken van auditieve verwerking in de muizenhersenen.
- Het focust op vier belangrijke auditieve structuren: de inferior colliculus, auditieve thalamus, thalamic reticulaire kern en auditieve cortex.
- Het begrijpen van deze connecties is cruciaal voor het verkennen van informatieverwerking in auditieve regio's.
- De methode omvat complexe snijtechnieken om de hersenstructuur te behouden.
Doel van het onderzoek
- Om hersenplakken te bereiden die de integriteit van auditieve connecties behouden.
- Om experimenten te faciliteren die het begrip van auditieve informatieverwerking verbeteren.
- Om de belangrijkheid van precieze snijtechnieken bij de bereiding van hersenplakken aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Verwijdering van de muizenhersenen voor het snijden.
- Blokeren van de hersenen ter voorbereiding op het snijden.
- Uitvoeren van een dubbele hoeksnede om plakken te verkrijgen.
- Gebruik van flavoproteïne beeldvorming om connectiviteit in de plakken te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De methode legt met succes de connecties vast tussen belangrijke auditieve structuren.
- Flavoproteïne beeldvorming onthult de integriteit van de auditieve paden.
- Heeft de effectiviteit van de dubbele hoeksnede in het behoud van projecties aangetoond.
- Biedt een betrouwbare techniek voor toekomstige auditieve verwerkingsexperimenten.
Conclusies
- Het onderzoek presenteert een verfijnde methode voor het bereiden van auditieve hersenplakken.
- Het benadrukt het belang van precieze snijtechnieken in neurowetenschappelijk onderzoek.
- De bevindingen dragen bij aan een beter begrip van auditieve informatieverwerking.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Preserving colliculo-thalamocortical connectivity in mouse brain slices enables rigorous interrogation of auditory information processing across multiple brain regions. This approach supports predictive confidence in mechanistic studies by maintaining both ascending and descending pathways, critical for target validation and pathway de-risking in early discovery. The integration of 3-D printed chamber components and multi-scale optical imaging enhances reproducibility and cross-study comparability, strengthening portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional mapping of auditory circuits for mechanistic de-risking.
- Supports validation of synaptic connectivity across midbrain and forebrain structures.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of sensory information flow.
- Provides a platform for assessing the impact of cortical modulation on subcortical processing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized brain slice preparations for reproducible functional assays.
- Allows rapid assessment of connectivity using flavoprotein autofluorescence imaging.
- Supports quantitative evaluation of network activation in response to electrical stimulation.
- Enables scalable preparation of slices for compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo auditory processing for translational continuity.
- Permits investigation of disease-relevant disruptions in auditory pathways.
- Supports biomarker discovery by linking functional activation patterns to molecular readouts.
- Facilitates risk-adjusted advancement of targets with validated circuit-level effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling multi-scale analysis of auditory circuits from single-slice preparations. It supports workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Provides a robust platform for testing circuit-level hypotheses and clarifying pathway function.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts of network activation for assay development.
- Analytics: Delivers optical and electrophysiological measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro circuit function to in vivo sensory processing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable preparation for diverse mechanistic and screening studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets with validated circuit engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in complex brain slicing and alignment techniques.
- Needs access to 3-D printing for custom chamber components and advanced optical imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of slicing and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Connectivity assessment is limited by slice quality and imaging depth.
