Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

Het algemene doel van deze procedure is om de chemosensitiviteit van primaire cellen van multiple myeloom te kwantificeren ten opzichte van een panel van chemotherapeutica. Dit wordt bereikt door eerst multiple myeloomcellen, geïsoleerd uit een vers beenmergaspiraat, te mengen met voorgestructureerd, patiëntafgeleid stroma en collageen. In de tweede stap wordt het CEL-mengsel uitgezaaid op een multi-wellplaat.

De cellen worden vervolgens behandeld met de chemotherapeutische middelen van belang, en de plaat wordt overgebracht naar de incubator van een gemotoriseerde tablemicroscoop voor sequentiële beeldvorming van de cellen gedurende een incubatieperiode van 96 uur. Uiteindelijk kan een digitaal beeldanalyse-algoritme worden gebruikt om levensvatbaarheidscurves te genereren voor elk middel en elke concentratie. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande endpoint-levensvatbaarheidstesten zijn dat deze kan worden gebruikt om verschillende chemotherapeutische middelen te testen tegenover één enkel patiëntmonster, en dat de levensvatbaarheid van de patiëntcellen longitudinaal over meerdere dagen kan worden gemeten zonder dat de cellen van het stroma of de matrix hoeven te worden gescheiden.

De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van hematopoëtische tumoren, aangezien deze theoretisch gebruikt kan worden om de klinische respons op specifieke chemotherapieprotocollen te voorspellen. We kwamen voor het eerst op het idee voor dit protocol toen we beseften dat het vervangen van onze oorspronkelijke microfluïdische slides door multi-well platen de kosten en de tijd die nodig zijn om het experiment te voltooien aanzienlijk zou verminderen. Om primaire multipel myeloom en uit het beenmerg afgeleide mesenchymale stamcel-coculturen met een multi-kanaals pipetteur voor te bereiden, begint u met het suspenderen van de cellen in RPMI 1640 tegen zes keer de uiteindelijke concentratie.

Meng vervolgens 50 µL van elk celtype met vers bereid type I collageen tot een eindvolume van 300 µL. Gebruik daarna een multichannel-pipet om handmatig 8 µL van het celmatrixmengsel in het midden van elke put van een 384-wells plaat te pipetteren en centrifugeer de plaat om alle cellen in hetzelfde brandpuntvlak te concentreren.

Na het centrifugeren worden de platen één uur onder celkweekcondities geïncubeerd om de gel te laten polymeriseren. Voeg vervolgens 80 µL aangevuld groeimedium toe aan elke well en incubeer de plaat overnight om het stroma aan de bodem van de plaat te laten hechten. Om co-culturen van multipel myeloomstroma met een robotpipetteerapparaat voor te bereiden, begint u met het suspenderen van 300 µL CD138-positieve multipel myeloomcellen en 300 µL stromale cellen in RPMI 1640-medium tegen zes keer de uiteindelijke gewenste dichtheid, zoals zojuist gedemonstreerd.

Meng vervolgens beide celtypen samen in een 1,5 milliliter buisje met het label CD 1 38 positive en plaats het buisje in een celkweekincubator. Suspendeer daarna 60 µL van de betreffende multiple myeloom-cellijn en 60 µL van de stromale cellen in RPMI 1640-medium tegen zes keer de uiteindelijke gewenste dichtheid en meng beide celtypen samen in een 1,5 milliliter buisje met het label this second tube cell line, en incubeer dit eveneens bij 37 °C. Laad het scriptbestand voor het uitzaaien van de cellen op de robotpipetteur.

Plaats vervolgens een doos met 200 µL pipetpunten in station A, een microtiterplaat in station B en een steriele 3 84-wells plaat in station E van de robot. Meng daarna het CD 1 38 positieve celmengsel met de buis met vers bereid CD 1 38 voormengmedium en breng 1,5 mL van de resulterende celoplossing over naar well nummer één van de microtiterplaat.

Plaats de rest van de cellen op ijs en start het programma. De robot zal de eerste 176 putjes van de 384-wellplaat zaaien en vervolgens pauzeren. Gebruik deze tijd om de overige CD 1 38-positieve cellen over te brengen naar putje nummer twee van de microtiterplaat en hervat het programma.

De robot zal de resterende 144 wells van de plaat detecteren en opnieuw pauzeren. Meng nu de cellen uit de cellijnbuis met een buis vers bereid cellijn-premix en breng de inhoud over naar well nummer drie van de microtiterplaat. Voortzet vervolgens het programma, zodat de robot de resterende 64 wells van de 3 84-wells plaat kan zaaien.

Wanneer de laatste put is gezaaid, centrifugeer de cellen kort en plaats de coculturen in de celkweekincubator voor collageenpolymerisatie. Na één uur laadt u het script voor de medialaag op de robot en plaatst u een doos met 120 µL pipetpunten in station A, een reagentiereservoir met 31 mL RPMI 1640-medium aangevuld met foetaal runderserum, patiëntenplasma en antibiotica in station B en de CED 3 84-wells plaat in station E. Start vervolgens het programma. De robot zal 81 µL van het aangevulde medium naar elke put overbrengen.

Wanneer de robot klaar is, plaatst u de cellen terug in de incubator zodat het stroma gedurende de nacht aan het substraat kan hechten. Om de gezaaide cellen te behandelen met het betreffende geneesmiddel, laadt u eerst het script voor de drug-plaat in de medialaag in de gebruikersinterface van de robotpipetteerder. Plaats vervolgens een doos met pipetpunten van 120 µL in station A, een reservoir met 21 mL RPMI 1640 aangevuld met FPS-patiëntenplasma en antibiotica in station B en een lege 3 84-wellplaat in station E; start het programma, waarna de robotpipetteerder 30 µL medium aan alle wells zal toevoegen.

De 3 84-wells plaat. Voeg vervolgens, volgens het sjabloon, 200 µL van het geneesmiddel met 20 keer de maximale concentratie toe aan elke well van een microtiterplaat voor de controle. Voeg aan de control-well medium toe, aangevuld met FBS, patiëntenplasma en antibiotica.

Plaats vervolgens een doosje met 120 µL pipetpuntjes in station A, de microtiterplaat met geneesmiddelen in station B en een 384-wells plaat met medium in station C en start het programma voor het laden van de drugplaat. De robotpipetteur zal een seriële verdunning van 1:3 maken, zoals geïllustreerd in deze figuur. Plaats nu een nieuw doosje met 120 µL pipetpuntjes in station A, de 384-wells plaat met verdund geneesmiddel in station B en de 384-wells plaat met gezaaide cellen in station C en start het programma voor het toevoegen van het geneesmiddel.

De robotpipetteur zal acht µL van het geneesmiddel overbrengen van elke put van de drug-plaat naar de overeenkomstige put in de celplaat. Nadat de laatste put is behandeld, wordt de celplaat onmiddellijk overgebracht naar de incubator van de digitale microscoop. Om de cellen vervolgens te beelden, wordt de binnenzijde van de benchtop-incubator gereinigd met een ethanol-natdoekje en wordt het deksel van de plaat voorzichtig vervangen door het deksel van de incubator.

Volg vervolgens de softwarestappen voor het toevoegen van de landmarks voor de regio's van interesse die tijdens het experiment opeenvolgend worden afgebeeld. Breng tenslotte de cellen in focus met behulp van een objectief met een 5- of 10-voudige vergroting, totdat de multipel myeloomcellen verschijnen als heldere schijven omringd door een donkere ring en de stromale cellen nauwelijks zichtbaar zijn. In dit experiment werden de levende multipel myeloomcellen pseudo-gekleurd in het groen, waarbij aan het einde van het experiment bij de hoogste drugconcentratie, wanneer alle multipel myeloomcellen dood waren, weinig tot geen groen signaal werd waargenomen in de stromale cellen en de endotheelcellen van de menselijke navelstrengvene.

De robotsoftware werd vervolgens gebruikt om het geleidelijke verlies van levensvatbaarheid te starten, resulterend uit de blootstelling aan de verschillende drugconcentraties over tijd. Het is belangrijk om alle gezaaide wells zorgvuldig te inspecteren voordat het imagingproces wordt gestart, aangezien artefacten de software voor beeldanalyse kunnen misleiden en tot foutieve resultaten kunnen leiden. Hier wordt bijvoorbeeld het resultaat getoond van een excessieve dichtheid van stromale cellen of een te lange tijd tussen de trypsinisatie en het zaaien, wat resulteert in de vorming van celaggregaten, zoals te zien is in deze afbeelding.

Wanneer cellijnen bij twee hoge dichtheden worden gezaaid, vormen ze kolonies tijdens de replicatie, waardoor de nauwkeurigheid van het algoritme voor digitale beeldanalyse afneemt omdat het steeds moeilijker wordt om cellen van elkaar te onderscheiden; hier zijn te weinig multipel myeloomcellen gezaaid wanneer het aantal multipel myeloomcellen verkregen uit het beenmergaspiraat lager is dan 500 000. Het is noodzakelijk om het dode volume voor de gebruikte buis te bepalen voordat de cellen worden gezaaid en dit volume in de verdunningsberekeningen op te nemen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee tot drie uur worden uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het vooraf gemengde medium dat collageen bevat, op ijs moet worden bewaard om polymerisatie te voorkomen voordat de cellen gereed zijn. Het heeft daarnaast geholpen om te onderzoeken hoe de heterogeniteit van de chemosensitiviteit van de tumorlast de diepte en duur van de respons van de patiënt kan bepalen.