Name: Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Leer chromosoomspreiding en immunokleuring van gistcellen voor visualisatie van chromosoomgebonden eiwitten. Deze methode maakt fluorescentiemicroscopie van meiotische kernen en eiwitlokalisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie GM50936 aan DKB.

OPMERKING: Enkele stappen van het protocol hieronder vereisen werken in een schone zuurkast. Bovendien vereist de werkwijze een gist viertal dissectie microscoop uitgerust met een 10X objectief lange werkende afstand spheroplasting controleren. De microscoop moet worden ingesteld in de komende tijd kap. Verwijder de micromanipulator arm en plaat houder van het toepassingsgebied en plaats deze items op een veilige plaats uit de buurt van het werkgebied. 1. Bereiding van Sferoplasten <ol><li> Grow gist onder gewenste omstandigheden. Met ongeveer 2 x 10 8 cellen voor elk monster, bijvoorbeeld 4 ml van een kweek bij OD600 = 1,4 5 x 10 7 cellen / ml. Hoewel directe verwerking van de monsters bij voorkeur in sommige gevallen kan, voor de meeste toepassingen, cel monsters kunnen worden opgeslagen op ijs gedurende maximaal 8 uur alvorens te worden verwerkt. </li><li> Overdracht celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis en draaien in een klinische centrifuge bij stand 5 (2345 rpm / 857,5 x g) gedurende 3 minuten om de cellen te pelleteren. </li&gt; <li> Giet het medium verzorgen niet om cellen te verliezen van de pellet. Voorzichtig resuspendeer de cellen in 1 ml ZK buffer en voeg 40 ul 1 M dithiothreitol (DTT). Incubeer 2 min met voorzichtig mengen. Pellet cellen als voorheen (zie stap 1.2). </li><li> Resuspendeer pellets in 1 ml ZK buffer. Voeg 5 ul van een vers bereide oplossing van zymolyase 100T die grondig gemengd. Incubeer 20-30 minuten bij 30 ° C om de celwand te verwijderen en sferoplasten. </li><li> Assay Een 10 ul druppel celsuspensie op een microscoopglaasje te bepalen of spheroplasting voltooid. Cellen bekeken onder de microscoop dissectie zonder dekglaasje. De cellen moeten opgeblazen en rond in plaats van iets langwerpige verschijnen en moet lyseren na toevoeging van 20 ul van water. Indien cellen niet lyseren, het monster tot 30 ° C en opnieuw assay elke 10 minuten totdat het water veroorzaakte lysis gemakkelijk wordt waargenomen. Pellet cellen als voorheen (zie stap 1.2). </li><li> Voorzichtig mengen en wassen celpellet in 2,5 ml koud MES / sorbitol buffer. Pellet cellen als voorheen (zie stap 1.2). Voorzichtig resuspendeer celpellet in 300-400 ul koude MES / sorbitol buffer. Cellen kunnen worden bewaard op ijs in dit stadium enkele uren. </li></ol> 2. Chromosome Spreading LET OP: De glazen oppervlakken waarop chromosomen wordt gespreid-ofwel dia&#39;s of dekglaasjes-moeten van tevoren worden voorbereid. Elke dia of dekglaasje worden ondergedompeld in water, daarna EtOH, daarna laten drogen en gepolijst met lenspapier. Als chromosomen zal worden verspreid op dekglaasjes, moet het dekglaasje worden aangebracht op een dia met Scotch tape of rubber cement. Tenzij anders vermeld, wordt de rest van het protocol beschreven verspreiding op hetzij een objectglaasje of dekglaasje <ol><li> Met behulp van een pipet P20 Pipetteer 20 ul celsuspensie op het oppervlak van een schoon objectglas. </li><li> Met behulp van een P200 pipet, voeg 40 ul van de 3% PFA / sucrose-oplossing en meng de solution door &quot;wervelende&quot; de dia met de hand tot Schlieren lijnen verdwijnen. Plaats de dia onder de microscoop en bevestigen dat cellen in focus. De PFA oplossing dient vers bereid in de zuurkast op de dag van gebruik. Opmerking: Als het eiwit van belang niet door de werkwijze eerder onderzocht, is het raadzaam om extra slides via oplossingen die 2 en 4% PFA bevat om te bepalen of retentie van het eiwit gevoelig voor fixatie omstandigheden bereiden. Een 4% PFA / sucrose oplossing wordt gebruikt wanneer het gewenst is geassocieerd tubuline microtubuli zichtbaar is. Het nadeel van de hogere concentratie fixeermiddel dat de chromosomen worden &quot;underspread,&quot; 2% PFA beoogt ook &quot;underspread&quot; chromosomen geven. </li><li> Met behulp van een pipet P200, voeg 80 ul van 1% Lipsol, wervelen zoals voorheen oplossingen te mengen zo volledig mogelijk, start een timer. Als Lipsol niet beschikbaar is, kan 80 pi 1% NP40 of 80 ul dH 2 O zijnvervangen (zie Representatieve resultaten, figuur 2). </li><li> Kijk naar de cellen zorgvuldig en voorzichtig wervelen de schuif om de 15 sec. Bij ongeveer 80% van de cellen zijn gelyseerd (verdwenen) stopt de timer, onmiddellijk verwijderen van de dia uit de microscoop, voeg 80 ul van PFA / sucrose-oplossing en krul te mengen. Lysis optreedt van tussen 30 en 90 seconden na het starten van de timer. OPMERKING: Als er meerdere slides zien lysis op ongeveer hetzelfde moment, kan men uiteindelijk weglaten microscopische controle voor de rest van de dia&#39;s en gewoon zorgvuldig tijd dat de periode tussen toevoeging van lipsol en de toevoeging van de laatste portie van fixatief. Echter, deze korte cut is alleen betrouwbaar bij het voorbereiden van meerdere dia&#39;s van hetzelfde monster. Het beste is om te controleren lysis van elk monster microscopisch wanneer verschillende dia&#39;s worden bereid uit monsters genomen op verschillende tijdstippen of uit verschillende culturen. </li><li> Plaats de dia op een schone vlakke ondergrond en de verspreiding van de vloeistof over het gehele unfrosted surface van de slede via de zijkant van een schone, wegwerpbare pipet Weiland onder de meniscus van de &quot;puddle&quot;, maar boven het oppervlak van de schuif zelf, dwz bij. geen &#39;rake&#39; het oppervlak van de slede met de pipet. Heeft pipet op verschillende dia niet opnieuw om verontreiniging van monsters te voorkomen. </li><li> Laat de dia&#39;s om &#39;s nachts te drogen in de zuurkast. Onoplosbare nucleaire componenten zullen vestigen op de dia oppervlak en binden aan het. Voor grote experimenten, de planning van het gebruik van de ruimte voor het drogen stap is belangrijk. </li><li> Eenmaal gedroogd worden de beste resultaten verkregen door ontwikkelen tot het stadium immunokleuring op dezelfde dag. De gedroogde sacharoseoplossing sluit de spreiding chromosomen in een &quot;honing&quot; dat bevriezing monsters toelaat: slides kunnen worden overgebracht naar een plastic dia doos en bewaard bij -20 ° C gedurende jaren. </li></ol> 3. Immunokleuring <ol><li> Dip dia&#39;s in 0,2% Foto-Flo voor 30 sec. om honing te verwijderen. Lean dia&#39;s opeen rand, de rand die op een papieren handdoek om resterende foto-Flo verwijderen. </li><li> Dip dia&#39;s in 1x TBS gedurende 5 minuten om zich te wassen. Verwijder overtollige vloeistof door te leunen dia&#39;s op een rand, maar laat ze niet uitdrogen. </li><li> Leg slides matte kant naar boven, pipet 300 ul TBS / BSA op de dia over de unfrosted deel van de dia. </li><li> Incubeer in een vochtige kamer bij RT gedurende 15 min. (Grote plastic container vol met water verzadigd papieren handdoeken onder een geperforeerde metalen plaat of plastic dia doos met verzadigd papieren handdoeken). </li><li> Afvoer dia door te rusten van een korte zijde van de dia op een papieren handdoek en leunend de dia tegen een passende ondersteuning (zoals een reageerbuis rack). Sta niet toe dat oppervlak drogen. </li><li> Onmiddellijk toepassen 80 ul van TBS / BSA-buffer met de juiste verdunning van primair antilichaam. Als antilichaam wordt beperkt, gebruik 40 ul en 22 x 22 mm dekglaasje. Voor ruwe konijn serum, is dit meestal tussen een 1/50 en 1/500 verdunning. LET OP:Voer titraties voor nieuwe antilichaam preparaten. De meeste verdunde voorbereiding die een hoge signaal boven de achtergrond oplevert wordt gekozen. Om te controleren voor het niveau van achtergrondkleuring dient kernen worden bereid uit de geschikte deletie mutant stam en / of dubbele objectglaasjes worden gekleurd met pre-immuun serum. </li><li> Plaats een gepolijst 22 x 50 mm dekglaasje op de dia vermijden bubbels. Doe dit door het houden van de dekglaasje tussen duim en wijsvinger langs de lange zijde op de posities in de buurt van een korte zijde. Houd het dekglaasje op een 30 ° hoek ten opzichte van glijden, de korte zijde het verst van de vingers omlaag tot deze op de slede net binnen de rand van de &quot;plas&quot; het dichtst bij de matte gebied van de schuif. Dan langzaam lager de dekglaasje in een vloeiende beweging tot de vingers die de dia contact met de bank, en dan los. Probeer niet om de positie van de dekglaasje aan te passen zodra het landt. OPMERKING: Als chromosoom spreads werden opgesteld opaangebracht dekglaasjes (in plaats van rechtstreeks op het oppervlak van slides), wordt dit monster dekglaasje blijft bevestigd aan de slede gehele kleuring en wasstappen. Een extra dekglaasje wordt bovenaan het monster dekglaasje gelijkmatig de antilichaamoplossing verdelen geplaatst tijdens kleuring en vervolgens weggegooid. </li><li> Plaats de glaasjes in een gesloten vochtige kamer en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Houd de matte rand overdracht van de dia&#39;s om een ​​glasplaatje vlekken rek en onder te dompelen in een kleuring pot met TBS. </li><li> Voorzichtig dip de schuif omhoog en omlaag om het dekglaasje verwijderen. Probeer te veel kracht te gebruiken om dit te doen. Was de dia&#39;s 2x 10 min door onderdompeling in TBS. Verwijder dia&#39;s van rack en afvoer overtollige vloeistof door het aanraken van rand tot papieren handdoek. Laat niet oppervlak droog. </li><li> Werken onder gedempt licht, onmiddellijk aan toevoegen 80 ul TBS / BSA met een 1/1000-voudige verdunning van fluorochroom geconjugeerd secundair antilichaam (of 40 pi met een 22 x 22 mm dekglaasje). Advertentied dekglaasje als hiervoor en incuberen bij 4 ° C gedurende 2 uur in de vochtige kamer in het donker. </li><li> Verwijder dekglaasjes zoals eerder, afvoer slides, en laat het oppervlak drogen gedurende 1-2 uur in het donker. Lean slides op keukenpapier als voorheen. LET OP: Als het verspreiden werd uitgevoerd op een dekglaasje gemonteerd, los het dekglaasje van de glijbaan voor het drogen. Coverslips worden dan gedroogd zoals beschreven voor objectglaasjes in de vorige stap. </li><li> Werken onder gedempt licht, voeg ongeveer 30 ul van montage medium met DAPI (drie 10 ul druppels) en vervolgens voorzichtig zakken een dekglaasje. Als de spreads op dekglaasjes, plaatst de druppels montage medium op een schoon dia en laat het dekglaasje, chromosoom naar beneden, op de glijbaan. </li><li> Nog steeds onder gedempt licht, wacht 2 min voor dekglaasje om zich te vestigen en te verzegelen randen van dekglaasje met duidelijke nagellak. Plaats de dia&#39;s in een platte glijbaan doos. OPMERKING: Voor STED microscopie, monteren met ProLong Gold. Gebruik 30 pi ProLong Goldzonder DAPI en laat &#39;s nachts te genezen. Afdichten met nagellak is overbodig. </li><li> Bekijk slides door groothoek epifluorescentiemicroscopie met een 40 of 100x objectief met een filter geschikt instellen voor DAPI te concentreren. Eventueel slaan de schuif in het donker bij 4 ° C gedurende enkele weken. Niet invriezen. </li></ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Het verschijnen van verspreide kernen hangt cruciaal af van de balans tussen fixatie en lysis/detergensbehandeling. Zoals hierboven besproken, vereist de bewaring van verschillende cellulaire structuren het gebruik van verschillende PFA-concentraties. Voor de meeste eiwitten is 3% PFA optimaal. Echter, bewaring van spindles vereist het gebruik van 4% PFA. Zelfs met een enkele set reagentia, kan het tijdstip van lysis ten opzichte van fixatie ook de kwaliteit van de verspreide kernen beïnvloeden. Voor de meest consiste...

De gist Saccharomyces cerevisiae biedt vele voordelen voor studies van moleculaire mechanismen van biologische processen, waaronder de studie van eiwitten die chromosoom functie regelen. Alhoewel er bekende voordelen van gist genetische, moleculaire en biochemische studies, is cytologisch onderzoek van de verdeling van eiwitten in de celkern gecompliceerd door zijn kleine omvang. De typische gist kern heeft een diameter van minder dan één micron, die slechts ongeveer 5 maal de resolutielimiet van zichtbaar licht. Aldus is de hoeveelheid informatie over de verdeling van nucleaire eiwitten die kunnen worden verkregen uit conventionele immunokleuring of door fluorescerend eiwit markeringen, zoals groen fluorescent eiwit (GFP), beperkt. Een nuttige benadering voor het karakteriseren van de subnucleaire verdeling van eiwitten chromosoom oppervlak verspreidt. Deze benadering omvat het verwijderen van de celwand, verstoren cellen en nucleaire membranen, enllowing de oplosbare inhoud van de kern om zich te vestigen op het oppervlak van een microscoopglaasje. De onoplosbare componenten omvatten nucleaire matrix en chromosomen. Naast het feit dat verwijdering van oplosbare nucleaire inhoud, die de mogelijkheid om chromatine gebonden eiwitten te detecteren verbetert, het chromosoom verspreiden methode resulteert in aanzienlijke decompressie van chromosomen zodat verspreiding nuclei diameter van ongeveer 3-5 urn (bij diploïde meiotische kernen) en 2-3 urn voor diploïde mitotische kernen. Gedecomprimeerd maakt detectie van nucleaire substructuur die relatief moeilijk of onmogelijk te lossen in intacte kernen. Een duidelijke tekortkoming op chromosoom verspreiding is de mogelijkheid dat de verspreiding procedure geheel of gedeeltelijk kan verstoren de structuur van belang. Van bijzonder belang is dat een bepaald chromosoom gebonden eiwit als gevolg van het verspreidorgaan procedure verloren gaan. Deze potentiële complicatie should in gedachten worden gehouden bij het interpreteren van data. Een voorbeeld van een eiwit dat gevoelig is voor de verspreiding procedure beta-tubuline. Onder sommige omstandigheden, de spil, die hoofdzakelijk bestaat uit tubuline wordt behouden tijdens het verspreiden 3. Visualisatie van de spil vaak nuttig om kernen plaats podium. Echter, visualiseren tubuline vereist behandeling met een hoge concentratie fixeermiddel; spillen verloren onder de hieronder beschreven standaardomstandigheden. Dit voorbeeld illustreert dat, wanneer de analyse van de verdeling van een eerder gekarakteriseerde proteïne, is het belangrijk om de concentratie fixeermiddel te bepalen hoe gevoelig het eiwit met deze wijziging te variëren. Ondanks de bezorgdheid over de gevolgen van het verspreidorgaan voorwaarden chromosoomstructuur is het nut en de kracht van het verspreidorgaan werkwijze aangetoond in vele contexten en heeft brede toepasbaarheid bij karakterisering van mitotische en meiotische cellen bijzonder 4-7. Two uitrijmethoden zijn uitgebreid gebruikt. De eerste van deze methoden ontwikkeld Dresser en Giroux 8, vermijdt het gebruik van detergens en kan verspreiden preparaten die lijken relatief goed geconserveerd chromosoom morfologie na kleuring voor DNA-specifieke kleurstof DAPI verkregen. Deze methode is relatief moeilijk te perfectioneren en de kwaliteit van het smeersel kernen varieert sterk, wanneer een gebied van een objectglaasje wordt in vergelijking met andere gebieden. Dit probleem kan kwantitatieve benaderingen die gepaard beeldvorming van veel niet-geselecteerde kernen van de ene dia naar data-acquisitie vertekening te voorkomen compliceren. De tweede chromosoom verspreiden methode, ontwikkeld door Loidl en Klein 1, gaat balanceren fixatie door paraformaldehyde, met lysis en chromatine decompressie gepromoot door een reinigingsmiddel. Wanneer goed uitgevoerd, deze methode geeft zeer reproduceerbare resultaten met minder regio tot regio verschillen ten opzichte van de Dresser en Giroux methode. Deze presentatie richt zich op een Modified van de methode van Klein Loidl en vanwege zijn betrouwbaarheid en eenvoud. Chromosoom verspreiden is niet ingewikkeld of tijdrovend; tot 100 objectglaasjes kunnen worden voorbereid immunokleuring in één dag. Bovendien kan de verspreiding preparaten in de diepvries worden bewaard jaren voorafgaand aan immunokleuring en daarmee labs een repository van bevroren chromosoom spreads die kunnen worden gebruikt bij nieuwe biologische vragen rijzen of nieuwe kleurstoffen beschikbaar komen ontwikkelen. De chromosoom dingswerkwijze wordt meestal gebruikt in combinatie met immunokleuring en groothoek fluorescentiemicroscopie, maar het is ook mogelijk om objectglaasjes voor superresolutie lichtmicroscopische werkwijzen zoals gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie bereiden.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Bereid een oplossing van 20 mg/mL in 50 mM Tris pH 7,5 aangevuld met 2% glucose. Bereid vers voor elke experiment en bewaar bij 4&deg;C totdat het klaar is voor gebruik.</td></tr><tr><td>Lipsol&nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&nbsp;</td><td>niet langer commercieel verkrijgbaar</td><td>Bereid een 1% (v/v) oplossing in water. Bewaar op ijs.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Bereid een 1% (v/v) oplossing in water. Bewaar op ijs.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Glijmiddel</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standaard dekglas</td><td>Fisher</td><td>12-544-E of 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Hoge resolutie dekglazen</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 oplossing</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Bereid een 0,2% (v/v) oplossing in water.&nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Bereid een 1% (w/v) oplossing in TBS. Bewaar bij 4&deg;C tot een maand.</td></tr><tr><td>Primaire antistof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antilichaam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montagemedium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof diabox</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Bewaar dia's met gedroogde verspreidingen in sleuven bij -20&deg;C. Gebruik ook als natte kamer.</td></tr><tr><td>Karton diabox</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Gebruik om gemakkelijk gekleurde/verzegelde dia's te vervoeren of bewaar bij 4&deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin pot</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Gebruik als wasbak voor dia's.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface het verspreiden en immunokleuring van gist chromosomen

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

De kleine omvang van kernen van de kiemende gist Saccharomyces cerevisiae beperkt het nut van lichtmicroscopie voor de analyse van de subnucleaire verdeling van chromatine-gebonden eiwitten. Oppervlakteverspreiding van gistkernen resulteert in uitbreiding van chromatine zonder verlies van gebonden eiwitten. Een methode voor oppervlakteverspreiding balanceert de fixatie van DNA-gebonden eiwitten met detergentbehandeling. De gedemonstreerde methode is licht gewijzigd ten opzichte van die beschreven door Josef Loidl en Franz Klein1,2. De methode is gebruikt om de lokalisatie van veel chromatine-gebonden eiwitten in verschillende stadia van de mitotische celcyclus te karakteriseren, maar is vooral nuttig voor de studie van meiotische chromosoomstructuren zoals meiotische recombinosomen en het synaptonemale complex. We beschrijven ook een aanpassing die geen gebruik vereist van Lipsol, een eigenaardig detergent, dat in de oorspronkelijke procedure werd gevraagd, maar niet langer commercieel verkrijgbaar is. Een immunokleuringsprotocol dat compatibel is met de chromosoomverspreidingsmethode wordt ook beschreven.

Het uiterlijk van de spread kernen kritisch afhankelijk van de balans tussen chromosoom fixatie en de-verdichting. Zelfs wanneer de reagentia goed in evenwicht kan variatie in de mate van de-chromosoom verdichting plaatsvinden in verschillende gebieden van hetzelfde glas en / of tussen verschillende dia. Daarom moet de kwaliteit van de spreads in een bepaalde regio van een dia worden beoordeeld voordat beelden worden geïnterpreteerd. De effecten van &quot;een vleugel&quot; en &quot;underspre...

Er wordt een methode gepresenteerd voor het oppervlaktespreiden van chromosomen uit knoppende gist. Deze methode is afgeleid van een methode die eerder werd beschreven door Loidl en Klein. Bovendien demonstreren we een procedure voor immunokleuring van gespreide chromosomen.

Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van chromosoomgebonden eiwitten middels fluorescentiemicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst de celwand te verwijderen door middel van een behandeling met enzymen. Ik ben olis.De tweede stap is het lyseren van de cel tot kernmembranen door middel van osmotische shock, gewoonlijk met behulp van een detergent. Dit gebeurt in aanwezigheid van een lage concentratie fixatief om de proteïnestructuur te behouden. Na de lysering van de cel wordt de concentratie fixatief verhoogd om de proteïnestructuren verder te stabiliseren.De gelyseerde cellen worden vervolgens op een microscoopglas aangebracht, waarbij de kernen op het oppervlak van het glas mogen bezinken. De laatste stap is het immunokleuren van de monsters. De hier gedemonstreerde indirecte immunokleuringsmethode maakt gebruik van een primair antilichaam dat bindt aan het eiwit van belang en een secundair fluorescent gelabeld antilichaam dat bindt aan het primaire antilichaam.Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de distributie van chromosoomgebonden eiwitten te onderzoeken. Deze representatieve afbeeldingen tonen een uitgespreide mitotische nucleus, immunogekleurd voor de recombinatie-eiwitten DMC1 en RAD51. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de andere veelgebruikte methode, geïntroduceerd door Mike Dresser en Craig Deru, is dat het grootste deel van het oppervlak van het objectglas optimaal uitgespreide nuclei bevat, waardoor het eenvoudig is om afbeeldingen van grote aantallen uitgespreide nuclei van één objectglas te verkrijgen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij de studie naar subnucleaire structuren, zoals: colocaliseren twee eiwitten, of is de vorming van een specifieke nucleaire substructuur afhankelijk van de functie van een bepaald gen van belang? Wij benadrukken dat deze methode oorspronkelijk is ontwikkeld door Franz Klein en Yosef Lole. We hopen dat deze video anderen zal helpen om onze versie van de techniek onder de knie te krijgen.Splats worden bereid van gistcellen die zijn gekweekt onder de gewenste condities. Gebruik ongeveer 2 × 10⁸ cellen per monster. Breng de celsuspensie over in centrifugebuisjes van 15 milliliter.Centrifugeer de buisjes in een klinische centrifuge op stand vijf gedurende drie minuten om de cellen te pelletteren. Giet het medium af, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen cellen van de pellet verloren gaan. Resuspendeer de cellen voorzichtig in 1 mL ZK-buffer en voeg vervolgens 40 µL van 1 M dihi toe.Incubeer drie minuten bij kamertemperatuur onder voorzichtig mengen. Pelleteer de cellen zoals voorheen. Suspendeer elk pellet in één milliliter ZK-buffer.Voeg vijf µL toe van een vers bereide, grondig gemengde oplossing van zy liase 100 T. Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij 30 °C om de celwand te verwijderen en sferoplasten te produceren. Analyseer 10 µL van de celsuspensie onder een microscoop om vast te stellen of de sferoplastvorming voltooid is.Vóór de verwijdering van de celwand lijken gistcellen enigszins langwerpig; sferoplasten moeten er opgezwollen en rond uitzien. Na toevoeging van water zouden sferoplasten voorzichtig moeten worden geresuspendeerd; resuspendeer en was het celpellet in 2,5 milliliters koude MES-orbitaalbuffer. Na het centrifugeren worden de cellen opnieuw voorzichtig geresuspendeerd in 300 tot 400 microliters koude MES-orbitaalbuffer; de cellen kunnen in dit stadium gedurende enkele uren op ijs worden bewaard.Voor deze procedure is een gist-tetra-dissectiemicroscoop nodig, uitgerust met een 10 x objectief met een lange werkafstand, geplaatst in de zuurkast; de microdissectienaald moet zijn verwijderd. Het glazen oppervlak waarop de chromosomen worden uitgespreid, moet ook vooraf worden voorbereid: pipetteer met een P 20 pipet 20 µL van de celsuspensie op het oppervlak van een schoon objectglas; voeg met een P 200 pipet 40 µL toe van een vers bereide oplossing van 3% paraformaldehyde en 3,4% sucrose en meng de oplossing voorzichtig door het objectglas met de hand te draaien totdat de schlei-lijnen verdwijnen. Plaats het objectglas onder de microscoop en bevestig dat de cellen in focus zijn.Voeg met een P 200 pipet 80 µL 1% Lip Sal toe en draai het monster zoals voorheen rond om de oplossingen zo volledig mogelijk te mengen, en start een timer. Als Lip Sal niet beschikbaar is, kan hetzelfde volume 1% MP 40 of gedestilleerd water worden gebruikt. Houd in plaats daarvan de cellen nauwlettend in de gaten en draai het objectglas elke 15 seconden voorzichtig rond.Dit videoclip laat zien wat waargenomen moet worden wanneer ongeveer 80 tot 90% van de cellen is gelyseerd. Stop de timer en verwijder onmiddellijk het preparaat uit de microscoop. De lyse moet plaatsvinden tussen 30 en 90 seconden.Nadat de timer is gestart, voegt u 80 µL van de paraformaldehyde-sucrose-oplossing toe en draait u het objectglas voorzichtig om te mengen. Plaats het objectglas op een schoon, vlak oppervlak. Gebruik de zijkant van een schone wegwerppastuerpipet, waarbij u deze onder de meniscus van de druppel maar boven het oppervlak van het objectglas houdt, om de vloeistof over het gehele ongematteerde oppervlak van het objectglas te verspreiden.Hark niet over het oppervlak van het preparaatglas met de pipet. Gebruik voor elk preparaatglas een nieuwe pipet om contaminatie van de monsters te voorkomen. Laat de preparaten een nacht drogen in de zuurkast; onoplosbare nucleaire componenten, waaronder de chromosomen, zullen neerslaan op het oppervlak van het glas en zich eraan binden zodra de preparaten droog zijn.Optimale resultaten worden behaald door de immunokleuring op dezelfde dag uit te voeren. Dompel de objectglazen 30 seconden in 0,2% Photo flow. Om de gedroogde sucroseoplossing te verwijderen, worden de objectglazen schuin geplaatst met de rand op een papieren handdoek om resterende photo flow te verwijderen.Dompel de objectglazen vijf minuten in XTBS om ze te wassen. Verwijder overtollig vloeistof door de objectglazen tegen een rand te laten leunen, maar laat ze niet uitdrogen. Leg vervolgens de objectglazen met de matte zijde naar boven en pipetteer 300 microliters T-B-S-B-S-A op elk objectglas over het niet-matte gedeelte van het glas.Incubeer de objectglazen in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Laat de objectglazen na 15 minuten uitlekken door een korte zijde van elk objectglas op een papieren handdoek te plaatsen en het objectglas tegen een geschikte steun, zoals een reageerbuisrek, te laten rusten. Laat het oppervlak niet direct opdrogen.Breng 80 µL T-B-S-B-S-A buffer aan die de juiste verdunning van het primaire antilichaam voor ruw konijnenserum bevat. Dit is doorgaans een verdunning tussen 1:50 en 1:500. Plaats een gepolijst dekglas van 22 bij 50 mm op het objectglas, waarbij luchtbellen worden vermeden.Doe dit door het dekglas tussen de duim en wijsvinger vast te houden langs de lange zijde, nabij een van de korte zijden. Houd het dekglas in een hoek van 30 graden ten opzichte van het objectglas. Laat de korte zijde die het verst van de vingers verwijderd is zakken totdat deze op het objectglas rust, net binnen de rand van de druppel die het dichtst bij het matte gedeelte van het objectglas ligt.Laat het dekglas langzaam in een vloeiende beweging zakken tot de vingers het preparaatglas raken en laat dan los. Probeer de positie van het dekglas niet meer aan te passen zodra het is neergekomen. Plaats de preparaten in een afgesloten vochtige kamer en incubeer deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius; houd de volgende dag de preparaten vast bij de matte rand en dompel elk preparaat onder in een kleurpot met TBS.Beweeg de ondergedompelde objectglazen voorzichtig op en neer om het dekglas te verwijderen. Probeer hierbij niet te veel kracht te gebruiken. Was de objectglazen door ze twee keer gedurende 10 minuten per keer onder te dompelen in TBS.Vervang de buffer na de eerste wasbeurt. Neem de glaasjes uit het rek en laat het overtollige vocht weglopen door de randen op keukenpapier te tikken. Laat het oppervlak niet direct opdrogen.Voeg aan elk objectglas 80 µL T-B-S-B-S-A toe met een verdunning van 1:1000 van het fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichaam. Plaats het dekglas zoals voorheen en incubeer in de vochtige kamer bij 4 °C gedurende twee uur in het donker. Verwijder na twee uur de dekglazen, was zoals voorheen en laat de objectglazen uitlekken.Laat ze uitlekken op keukenpapier. Laat het oppervlak één tot twee uur aan de lucht drogen in het donker, waarbij wordt gewerkt onder gedimd licht bij ongeveer 30 µL montage medium dat dbi bevat. Laat vervolgens voorzichtig een dekglas zakken.Wacht nog twee minuten onder gedimd licht zodat het dekglas kan zakken en verzegel vervolgens de randen van het dekglas met transparante nagellak. Plaats de preparaten in een plat preparatenboxje. De preparaten kunnen donker worden bewaard bij 4 °C tot ze klaar zijn voor observatie.Niet invriezen. De slides die in deze stap worden getoond, zijn twee voorbeelden van optimaal uitgespreide MYOTIC nuclei met een dubbele immunokleuring voor de twee eukaryote strand-exchange eiwitten RAD 51 en DMC one, en een tegenkleuring voor DNA met DPI. Voor diploïde cellen hebben optimaal uitgespreide mitotische kernen diameters van ongeveer 5 µm. In een onvoldoende uitgespreide kern zijn minder foci van RAD 51 en DMC one zichtbaar en kunnen niet alle structuren in één enkel brandvlak worden bekeken, omdat het monster onvoldoende vlak is. In overmatig uitgespreide kernen [gebeurt het tegenovergestelde].Er blijven minder foci van RAD 51 en DMC1 over als gevolg van onvoldoende fixatie en/of overmatig detergent. Er werden ook behandelingsexperimenten uitgevoerd waarbij Lip Sal, dat niet langer commercieel verkrijgbaar is, werd vervangen door MP 40; hierbij werden bevredigende resultaten behaald, zoals blijkt uit de spread-kleuring van mitotische kernen voor RAD 51 en Zip1, een component van de centrale regio van het synaptonemale complex. Het vervangen van Lip Sal door gedestilleerd water leverde eveneens bevredigende resultaten op.In beide gevallen bleef de chromosoomcondensatie die optreedt wanneer cellen overgaan van leptine NEA naar PAA grotendeels behouden. Deze spreidingsmethode is geschikt voor gebruik met superresolutie-microscopiemethoden. In deze afbeelding van het Synap Neal Complex behield de Paki INE-kern zip één en rood één.Componenten van het synaptonemale complex, weergegeven door stimulated emission depletion-microscopie. Let op dat het hier gebruikte zip1-antilichaam, in het groen weergegeven, bindt nabij de laterale elementen, zoals blijkt uit het parallelle lineaire kleuringspatroon. De laterale elementen bevinden zich ongeveer 100 nanometer uit elkaar en kunnen niet worden onderscheiden met conventionele microscopie.Zodra de techniek van het uitplaten en uitstrooien onder de knie is, kan dit proces in twee tot vier uur worden voltooid, afhankelijk van het aantal monsters; met oefening kunnen tot 100 objectglazen via deze methode worden geprepareerd. Het is raadzaam om één of meer dubbele objectglazen per monster voor te bereiden. De duplicaten kunnen na de stap van het overnacht drogen worden bewaard voor toekomstig gebruik bij -20 °C.De preparaten blijven gewoonlijk jarenlang bewaard wanneer ze op deze manier worden opgeslagen.

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau...

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.

Gist Colony integratiemethode

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We bieden een reproduceerbare basismethode voor de langetermijnmicroscopie van de seksuele levenscyclus van splijtingsgist. Met kleine aanpassingen zoals beschreven, stelt het gepresenteerde protocol onderzoekers in staat zich te concentreren op verschillende stappen van het reproductieproces.

Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Het doel van dit protocol is het visualiseren van Candida albicans celvorm en lokalisatie in het maagdarmkanaal van zoogdieren.

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer chromosoomspreiding en immunokleuring van gistcellen voor visualisatie van chromosoomgebonden eiwitten. Deze methode maakt fluorescentiemicroscopie van meiotische kernen en eiwitlokalisatie mogelijk.

Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

Meer video's verkennen