Een 3D Human longweefsel Model voor functionele studies op

Het algemene doel van deze procedure is het construeren van een in vitro longweefselmodel voor studies naar M tuberculosis-infectie. Dit wordt bereikt door eerst een fibroblast-collageenmatrix aan te brengen op het filter van een celluulteeltplaat-insert. In de tweede stap worden geïnfecteerde immuuncellen en longepitheelcellen op de fibroblast-collageenlaag geplaatst.

Het resulterende 3D-weefselmodel wordt vervolgens aan lucht blootgesteld om de mucussecretie en stratificatie van het epitheel te faciliteren. In de laatste stap wordt het weefsel geoogst en gemonteerd. Ten slotte wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de vorming van vroege granulomen geïnduceerd door M tuberculosis te analyseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vitro monolaagculturen van cellen, is dat de cellen in dit systeem zich in een 3D-micromilieu bevinden, waardoor bij infectie met virulente microbacteria granulomen kunnen worden gevormd die lijken op menselijke TB. Om in collageen ingebedde fibroblasten te prepareren, begint men met het behandelen van longfibroblastcellen met tripsine gedurende 10 minuten bij 37 °C. Wanneer de cellen zijn losgelaten, wordt de reactie gestopt met acht ml compleet DMEM, waarna de cellen worden gecentrifugeerd. Resuspendeer de pellets op 230.000 cellen per ml in vers DMEM en plaats de cellen op ijs. Voeg vervolgens één insert per well toe aan een zeswellsplaat.

Vul de wellplaat en verdeel één milliliter van een vers bereid acellulaire laagmengsel in elk insert, waarbij u ervoor zorgt dat het mengsel het volledige insert bedekt zonder luchtbellen. Plaats de plaat vervolgens gedurende 30 minuten in een incubator op 37 °C. Meng aan het einde van de incubatie twee milliliter collageen met 615 µL premix in een steriele conische buis op ijs om de pH van het collageen per insert te neutraliseren.

Voeg vervolgens 58 µL complete DMEM en 327 µL longfibroblasten per insert toe aan het collagenmengsel. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om de cellen gelijkmatig over het mengsel te verdelen. Voeg nu snel drie mL van de cellulaire laag langs de wand van elke insert toe op elke acellulaire collageenlaag.

Zorg dat er geen luchtbellen ontstaan en plaats de plaat gedurende nog twee uur terug in de celkweekincubator. Voeg na de polymerisatie van het collageen twee milliliter compleet DMEM toe aan de bodem van elke well en plaats de plaat opnieuw 24 uur in de incubator. Gebruik de volgende dag een schone pincet om de inserts één voor één voorzichtig op te tillen en aspireer het kweekmedium van de bodem van elke well.

Voeg vervolgens twee milliliter compleet DMM toe aan de bodem van elke put, en twee milliliter compleet DMM aan elke insert. Vervang beide volumes medium elke tweede dag gedurende vijf tot zeven dagen. Om de geïnfecteerde macrofagen voor te bereiden, begint u met het incuberen van een macrofaagcultuur gedurende vier uur met virulente M tuberculosis bij een multiplicity of infection van 10.

Was aan het einde van de incubatie de cellen drie keer met PBS om de extracellulaire bacteriën te verwijderen en behandel de macrofagen gedurende 10 minuten bij 37 °C met 2 mM DTA. Wanneer de cellen zijn losgekomen, resuspendeer deze in antibioticavrije complete DMM. Aspireer vervolgens al het medium uit de fibroblast-collageenmatrixplaat en voeg 1,5 mL verse antibioticavrije complete DMM toe aan de buitenkamers.

Meng vervolgens fluorescentielabelde monocyten met de geïnfecteerde macrofagen in een verhouding van vijf op één in 50 µL antibioticumvrij compleet DMEM per insert. Voeg daarna 50 µL van het monocyt-macrofaagmengsel toe aan de binnenzijde van elk insert en plaats de plaat terug in de incubator. Voeg na één uur langzaam twee milliliter kweekmedium langs de wanden van de inserts toe om te voorkomen dat de cellen loslaten, en incubeer de kweken nog eens 24 uur.

Om de culturen te enten met longepitheelcellen, voegt u 4 miljoen epitheelcellen per milliliter toe in 50 µL compleet dmm bovenop de collageenmatrices van immuuncel-fibroblasten. Incubeer de cellen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door één uur bij 37 °C. Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter antibioticavrij, compleet DMM toe aan de inserts zoals zojuist gedemonstreerd, en cultureer de cellen nog drie dagen.

Vijf dagen na het uitzaaien van de geïnfecteerde macrofagen wordt al het cultuurmedium uit de plaat geaspireerd en worden 1,8 milliliters antibioticumvrij, compleet DMM aan de buitenkamers toegevoegd. Vervolgens worden de 3D-weefselmodellen in de incubator gedurende twee dagen aan lucht blootgesteld, zonder op dag zeven medium aan het insert toe te voegen na het uitzaaien.

Verwijder het medium volledig uit de plaat en meng de weefselmodellen met 4%paraldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Scheid vervolgens met een scalpel de membranen van de well-inserts. Gebruik daarna een schoon scalpel om voorzichtig de zijkanten van de weefselmodellen te verwijderen en snijd elk weefsel in vier ongeveer gelijk grote vierkante stukken.

Breng de fragmenten over op superfrost glasplaatjes en laat ze vijf minuten drogen. Monteer vervolgens de weefsels met behulp van een fluorescent montagemedium dat anti-fade en DPI bevat, en dek ze af met dekglasjes. Laat de plaatjes op kamertemperatuur in het donker liggen tot ze droog zijn, en verzegel daarna de randen van het dekglasje met nagellak.

Wanneer de lak is gedroogd, worden de coupes ondergedompeld in 70% ethanol voor transport uit de BSL-3 faciliteit. Om de weefsels te visualiseren, worden er 3D-beelden gemaakt van vijf tot 10 verschillende velden die het gehele stuk weefsel beslaan met een resolutie van 512 bij 512 en een z-stap van minimaal 20 micron dikte met een scheiding van 1 tot 1,5 micron tussen de stacks op een fluorescente confocale microscoop voor 3D-kwantificatie van de celclusters. Open de software voor 3D-beeldbewerking en laad het betreffende beeld.

Pas vervolgens, met behulp van de tool voor beeldaanpassing, elk kanaal aan voor beeld, contrast, helderheid en mengopaciteit om de volumereconstructie te optimaliseren en de ruisinterferentie te minimaliseren. Selecteer daarna het rode monocytkanaal om het weefseloppervlak te visualiseren en stel de juiste drempelwaarden in met behulp van de filters om de selectie van de rode monocyten te beperken of om de achtergrond naar behoefte uit te sluiten. Exporteer ten slotte de gegevens naar het geschikte spreadsheetprogramma voor verdere downstream-analyse.

Op dag zeven, na het uitzaaien van met M tuberculosis geïnfecteerde cellen, onthult confocale microscopie een clustering van rode monocyten op de plaats van infectie, zoals blijkt uit de aanwezigheid van de groene bacteriën die de laesies van menselijke tb nabootsen, bekend als 3D-granulomen. Visualisatie biedt de flexibiliteit om verschillende kenmerken te bestuderen, te onderzoeken en te kwantificeren. Een 3D-beeld, bijvoorbeeld, waarbij in deze beelden een cluster monocyten op de plaats van em tuberculosis wordt weergegeven.

De ruimtelijke schikking van groene bacteriën en rode monocytclusters kan worden waargenomen vanuit apicaal, rotationeel en lateraal perspectief. Zoals verwacht werden deze clusters niet waargenomen in de niet-geïnfecteerde weefsels. Kwantificering van de grootte en het aantal monocyten, celclusters en M tuberculosis-geïnfecteerde weefsels onthulde dat de grootte van de celclusters is toegenomen, terwijl het aantal individuele monocyten is afgenomen in vergelijking met de niet-geïnfecteerde weefselmodellen.

Potentiële gebruikers van dit longweefselmodel zijn onder meer onderzoek naar de rol van verschillende immuuncellen en weefselimmuniteit bij tb, het bestuderen van mycobacterie-fenotypes en het testen van kandidaat-geneesmiddelen die mycobacteriën binnen het granuloom doden.