Name: miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Leer een vereenvoudigde workflow voor miRNA-expressieanalyse in gearchiveerde prostaatkankerweefsels met behulp van kwantitatieve real-time PCR en in situ hybridisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Roger Erickson voor zijn steun en hulp bij de voorbereiding van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health (Grant Number RO1CA177984; RO1CA138642), VA programma project over prostaatkanker (BX001604).

Formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) of vers ingevroren prostaatkanker werden verkregen van de SFVAMC. Monsters waren van patiënten met prostaatkanker die een radicale prostatectomie bij SFVAMC onderging. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle patiënten en de studie werd goedgekeurd door de UCSF Commissie Human Research. Als alternatief werden prostaatkanker weefsels microarrays verkregen van commerciële bronnen en gebruikt voor miRNA analyses door ISH. Clinicopathologische en follow-up informatie geanalyseerd prostaatkankerpatiënten werd verzameld. 1. weefselmonsters <ol><li> Knip prostaatkanker weefselmonsters in 10 urn secties met behulp van een microtoom en vlek met H &amp; E volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Beoordeel gekleurde coupes voor de identificatie van prostaatkanker foci en aangrenzend normaal klierepitheel. Opmerking: Een raad gecertificeerd patholoog zou de H &amp; E gekleurde dia&#39;s en ma herzienrk voor tumor en normale gebieden. Gebruik de gemarkeerde dia&#39;s als gidsen in de volgende secties voor miRNA analyses van tumor vs normale gebieden. </li></ol> 2. miRNA Expression Analyses door kwantitatieve real-time PCR Opmerking: Deze workflow omvat de volgende stappen: lasermicrodissectie, isolatie van totaal RNA (inclusief miRNA en mRNA), het testen van de volwassen miRNAs met behulp van de TaqMan MicroRNA expressie assays zoals beschreven in de volgende paragrafen. <ol><li> RNA-extractie <ol><li> Isolatie van miRNA van prostaatkanker FFPE Tissues <ol><li> Lasermicrodissectie (LCM) Opmerking: Voer de stappen 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in een chemische dampkap. <ol><li> Bereid weefsel dia&#39;s (10 micrometer secties) voor LCM. Deparrafinize weefselcoupes door onderdompeling in xyleen (2 x), gedurende 10 minuten elk, dan hydrateren de weefsels door het incuberen van de objectglaasjes gedurende 5 minuten elk in gegradeerde ethanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), gevolgd door gedestilleerd water(5 min). </li><li> Volgende rehydratie, beits secties met hematoxyline gedurende 30 seconden, gevolgd door water. </li><li> Plaats weefsels in gegradeerde ethanol (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min elk) en xyleen (5 min). </li><li> Droge dia&#39;s in een zuurkast en plaats dan in het LCM instrument microdissectie. </li><li> Voeren microdissections met de LCM-systeem in overeenstemming met de instructies van de fabrikant 24. Gebruik patholoog gemarkeerd dia als leidraad voor de identificatie van prostaatkanker foci en aangrenzend normaal weefsel. Met de laserstraal op een 10-20 micrometer diameter pulsen met een vermogen van 70-90 mW. </li><li> Capture gebieden van belang met infrarood laserpulsen op LCM caps. Combineer cellen 2-5 caps voor miRNA extractie per monster. Om de integriteit van geëxtraheerde RNA waarborgen onmiddellijk verwerken gevangen cellen miRNA extractie. </li><li> Alternatief lyseren cellen in het miRNA extractiebuffer (volgens het protocol van de fabrikant) en store lysaten bij -80 ° C. </li></ol></li><li> miRNA extractie en analyses van LCM gemicrodissecteerde Tissues <ol><li> Extract totaal RNA uit FFPE gemicrodissecteerde weefsels met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: De opbrengst van RNA van laser capture miscrodissection is meestal laag. Daarom wordt RNA uitgewassen in lage volumes (20-30 pi) en worden gebruikt voor expressie profilering gebruik Taqman microRNA expressie assays volgens de instructies van de fabrikant (ook beschreven in paragraaf 2.2). Optimalisatie van invoer RNA real time PCR detectie van mature miRNAs suggereert dat 5 pl van het geëlueerde RNA optimaal is voor elke miRNA-specifieke reverse transcriptie reactie. Als endogene controle wordt RNU48 / RNU24 gebruikt. Voor controlereacties, wordt 2 pl van het geëlueerde RNA toegepast voor de reverse transcriptie reactie. </li></ol></li></ol></li><li> Isolatie van miRNA van prostaatkanker Frozen Tissues <ol><li> HomogeNize bevroren weggesneden prostaatweefsel gemalen weefsel in vloeibare stikstof met een vijzel en stamper. Overdracht gehomogeniseerd weefsel een microcentrifugebuis met een gekoelde spatel. Handhaaf de vijzel / stamper en spatel bij dezelfde temperatuur door dompelen in vloeibare stikstof gehomogeniseerd, zodat weefsel kan gemakkelijk worden overgedragen. </li><li> Naar commerciële guanidine isothiocyanaat-fenol reagens (1 ml / 0,1 g weefsel) aan de gehomogeniseerde weefsel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Opmerking: Gehomogeniseerde weefsels in de commerciële guanidine isothiocyanaat-fenol reagens kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele maanden. </li><li> Chloroform Aan het homogenaat (0,2 ml chloroform / ml) toe en schud krachtig gedurende 30 seconden. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten, gevolgd door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Breng de bovenste waterige fase een nieuwe steriele RNase-free 1,5 ml buis. </li><li> Voeg een gelijk volume isopropylalcohol. Meng en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur, gevolgd door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C tot de RNA pellet. </li><li> Zuig het supernatant en was de RNA pellet met 1 ml 70% ethanol. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Zuig het supernatant zorgvuldig. Droge RNA pellets bij kamertemperatuur 5-10 min. Ontbinden RNA in 50-100 ul nuclease-vrij water. </li><li> Voer kwantificering van RNA met behulp van een spectrofotometer en NanoDrop bepalen RNA integriteit met bioanalyzer. Pas RNA concentraties 10 ng / ul. Gebruik 10-50 ng RNA voor miRNA- specifieke cDNA reactie gevolgd door real-time PCR-analyses (paragraaf 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> Kwantitatieve real-time PCR voor miRNA Expression Analyses Opmerking: Assay rijpe miRNAs behulp van een tweestaps RT-PCR protocol zoals hieronder beschreven. <ol><li> Reverse transcriptie (RT) <ol><li> Reverse transcriptie van cDNA uit RNA met een miRNA reverse transcriptie kit volgens instructies van de fabrikant.Gebruik 10-50 ng totaal RNA met miRNA specifieke primer uit de MicroRNA Testen en RT kit. Gebruik RNU48 / RNU24 / RNU6B als controles. CDNA Verdun 1: 5 tot 1:10 (afhankelijk van de abundantie van de geanalyseerde miRNA) en gebruik in real-time PCR-detectie zoals in de volgende stap. </li></ol></li><li> Real-time PCR voor de detectie van Mature miRNA <ol><li> PCR amplificeren uit cDNA monsters met de MicroRNA assays met een Fast Universal master mix volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Normaliseren monsters RNU48 / RNU24 / RNU6B controle. Met de vergelijkende methode Ct (cyclus drempelwaarde) van de relatieve veranderingen in genexpressie te berekenen op Fast Real Time PCR System. Analyseer elk monster in drievoud. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. miRNA Expressie Analyses door in situ hybridisatie (ISH) <ol><li> Pre-behandeling van weefsels <ol><li> Snijd 5 micrometer secties van FFPE prostaatkanker weefsel blokken met behulp van een microtoom. </li><li&gt; Fix weefselcoupes door het incuberen van de objectglaasjes bij 56 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: Dia&#39;s kunnen worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende enkele weken miRNA analyses. </li><li> Deparrafinize de weefsels door het weken de glaasjes met xyleen (2 x), gedurende 15 minuten elk. </li><li> Hydrateren het weefsel met incuberen van de objectglaasjes gedurende 5 minuten elk in gegradeerde ethanol (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), gevolgd door gedestilleerd water (5 min). </li><li> Bevestig de glaasjes met 4% paraformaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 20 min. </li><li> Was de glaasjes met PBS (2x) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten elk. </li><li> Behandel de objectglaasjes met 10 ug / ml proteïnase K bij 37 * C gedurende 10 min in voorverwarmde proteïnase K-buffer (5 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl). </li><li> Na Proteinase K-behandeling, spoel de objectglaasjes met 0,2% glycine in PBS gedurende 30 sec. </li><li> Was de glaasjes in PBS (1x) bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Bevestig de glaasjes met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 min. </li><li> Spoelen met glijbanenPBS gedurende 5 min. </li></ol></li><li> Hybridisatie <ol><li> Pre-hybridiseren de objectglaasjes met pre-hybridisatieoplossing gedurende 3-4 uur bij 55 ° C in een bevochtigde kamer. Gebruik weefsel lab doekjes gedrenkt in 50% formamide / 50% 5x SSC te houden van de kamer bevochtigd. </li><li> Met 5 &#39;digoxigenine gemerkte probes in een concentratie van 20-50 nM in hybridisatiebuffer. Verdunnen miRNA-specifieke probe (20-50 nm) en kleine nucleaire RNA U6 controle sonde (20 nM), warmte bij 90 ° C gedurende 4 minuten, plaats het op het ijs en voeg aan koude hybridisatiebuffer ijs (2-4 ng / ul ). </li><li> Verwijder pre-hybridisatieoplossing, voeg hybridisatieoplossing (+ probe hybridisatie buffer, 100 pl per slide), incubeer 12-16 uur bij probe specifiek hybridisatietemperatuur (hybridisatietemperatuur = probe Tm-21 ° C). Voer hybridisaties in een bevochtigde kamer (50% formamide / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Wassen Steps <ol><li> Was de glaasjes met 2 x SSC gedurende 10 minuten bij 45 ° C. </li><li> Wash tglijdt hij met 1,5x SSC gedurende 10 minuten bij 45 ° C. </li><li> Was de dia&#39;s met 0,2 x SSC (2x) bij 37 ° C gedurende 20 minuten elk. </li><li> Incubeer dia met 1x blokkerende oplossing gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur geroerd </li></ol></li><li> Opsporing <ol><li> Incubeer de glaasjes met 1: 100 PBS verdund AP-geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam voor 1-4 uur of overnacht bij 4 ºC. </li><li> Was de glaasjes met PBS (3 x) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk. </li><li> Was de dia (2x) met alkalisch fosfatase buffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten elk. </li><li> Incubeer de glaasjes in BM Purple AP substraat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1-20 uur. </li><li> De dia&#39;s spoelen met PBS met 0,1% Tween-20 en was (2x) in water. </li><li> Monteer de slides een waterig fixeermiddelen en onderzocht onder een microscoop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+prostate+cancer%3A+new+prospects+for+old+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li>
<li>Sequeiros, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+for+prostate+cancer+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Biomed Res Int. 2013, 283635(2013).</li>
<li>Cary, K. C., Cooperberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+in+prostate+cancer+surveillance+and+screening%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Urol%22%5BJournal%5D)">Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future.</a> Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).</li>
<li>Sartori, D. A., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+in+prostate+cancer%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Biomarkers in prostate cancer: what's new.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li>
<li>Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+microRNA+host+genes+and+transcription+units%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.</a> Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).</li>
<li>Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+III+transcribes+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase III transcribes human microRNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).</li>
<li>Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microRNAs+are+processed+from+capped%2C+polyadenylated+transcripts+that+can+also+function+as+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs.</a> RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+genes+are+transcribed+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II.</a> EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).</li>
<li>Bartel, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+prostate+cancer%3A+from+biomarkers+to+molecularly-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer+Prostatic+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics.</a> Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).</li>
<li>Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastamir%3A+the+field+of+metastasis-regulatory+microRNA+is+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading.</a> Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).</li>
<li>Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microRNAs+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Diet, microRNAs and prostate cancer.</a> Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).</li>
<li>Saini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Role+of+mir-203+in+Prostate+Cancer+Progression+and+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis.</a> Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).</li>
<li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+signatures+from+the+small+non-coding+RNA+transcriptome+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer.</a> Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).</li>
<li>Porkka, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in prostate cancer.</a> Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).</li>
<li>Schaefer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+microRNA+profiling+in+prostate+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma.</a> Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).</li>
<li>Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+microRNAs+in+prostate+cancer+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncog%22%5BJournal%5D)">Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities.</a> Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).</li>
<li>Xi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+microRNA+expression+of+RNA+extracted+from+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples.</a> RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).</li>
<li>Lucas, S. M., Heath, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+in+development+of+differentially+expressed+and+prognostic+prostate+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer%22%5BJournal%5D)">Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers.</a> Prostate Cancer. , 640968(2012).</li>
<li>Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Novel+Bicyclo%5B2.2.1%5D+Ribonucleosides%3A+2%27-Amino-+and+2%27-Thio-LNA+Monomeric+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides.</a> J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).</li>
<li>Suh, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-145+is+regulated+by+DNA+methylation+and+p53+gene+mutation+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer.</a> Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).</li>
<li>Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+in+prostate+cancer+research%3A+establishment+and+validation+of+a+powerful+tool+for+the+assessment+of+tumour-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions.</a> BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).</li>
<li>Nelson, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179(2005).</li>
<li>Hanna, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+microRNAs+in+tissue+microarrays+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization.</a> Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële openbaarmakingen.

In dit artikel beschrijven we een vereenvoudigde workflow voor miRNA expressie profilering in gearchiveerd FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische weefsels. Bij prostaatkanker, een aantal studies suggereren een belangrijke rol van microRNAs bij prostaatkanker initiatie, progressie en metastase. Echter, vaak tegenstrijdige resultaten verkregen op een specifieke miRNA 22 sinds de miRNA extractie en analyse methoden verschillen sterk. Gezien de opkomende onderzocht van de mogelijke toepassing van miRNAs a...

Kanker van de prostaat is een algemeen diagnose mannelijke maligniteit dat is een van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfte bij mannen. In de VS zijn naar schatting 220.800 nieuwe gevallen en 27.540 sterfgevallen zal worden gerapporteerd in 2015 1. Prostaatkanker is een heterogene ziekte met zeer variabele ziekte natuurlijk- tumoren kunnen indolente of zeer agressief zijn. Een cruciale uitdaging bij prostaatkanker klinische behandeling wordt gesteld door de ontoereikendheid van de momenteel gebruikte methoden / biomerkers voor de ziekte van screening, diagnose, prognose en behandeling 2. Huidige screeningswerkwijzen omvatten prostaatspecifiek antigeen (PSA) test en een digitaal rectaal onderzoek (DRE) gevolgd door prostaatbiopsieën 3. Prostaatspecifiek antigeen (PSA) de meest gebruikte prostaatkanker biomarker die aanzienlijk revolutie klinische behandeling en verbeterde overlevingskansen 4. Vanwege inherente beperkingen van PSA waaronder lack specificiteit, PSA-screening heeft geleid tot meer diagnose en op behandeling van de ziekte. Gelet hierop, zijn intensieve inspanningen gericht op het zoeken naar alternatieve prostaatkanker biomarkers, met name die welke de agressiviteit van de ziekte kunnen voorspellen en betere beslissingen te nemen behandeling 4,5. In de afgelopen jaren, microRNAs (miRNAs) zijn ontstaan ​​als veelbelovende alternatieve prostaatkanker biomarkers. MicroRNAs (miRNAs) vormen een evolutionair geconserveerde klasse van kleine niet-coderende RNA&#39;s die genexpressie onderdrukken post-transcriptie via sequentie-specifieke interacties met de 3&#39;-onvertaalde gebieden (UTR) van verwante mRNA targets. Geschat wordt dat&gt; 60% van mRNA&#39;s zijn geconserveerd doelwit van miRNAs 6. miRNA genen in intergene gebieden of binnen introns en exons eiwit / niet-eiwit coderende genen 7. Deze genen worden preferentieel getranscribeerd door RNA polymerase II in primary miRNAs (pri-miRNAs, diverse kilobasen lang) die vorm haarspeld vormige stam lus secundaire structuren. Deze pri-miRNAs worden verwerkt tot voorloper miRNAs (pre-miRNAs, 60-75 nucleotiden lang) die worden geëxporteerd naar het cytoplasma en verder verwerkt tot mature miRNAs (18-25 nucleotiden lang) 8-10. miRNAs regelen belangrijke cellulaire processen waaronder proliferatie, ontwikkeling, differentiatie en apoptose 11. Studies suggereren een wijdverspreide ontregeling van miRNA expressie profielen in verschillende menselijke maligniteiten waaronder prostaatkanker 12-15. miRNA expressie profielen zijn gemeld op grote schaal worden dysregulated in primaire en uitgezaaide prostaatkanker. Veranderde miRNA expressie in verband gebracht met prostaatkanker progressie, agressiviteit en herhaling gewezen op de prognostische mogelijkheden van miRNAs 12,14,16-19. Een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal blijkt dat miRNAs spelen een belangrijke mechanistische rol bij prostaatkanker initiatie, ontwikkeling, vooruitgangion en metastase. Overall, miRNAs zijn in opkomst als veelbelovende alternatieve biomarkers voor prostaatkanker diagnose en prognose die onderscheid kunnen maken tussen normale en kanker weefsels en hulp in gelaagdheid van prostaattumoren 12. Ook miRNAs zijn belangrijke doelen voor de ontwikkeling van effectieve therapieën tegen prostaatkanker 20. Vanwege hun kleine omvang en de weerstand tegen endogene RNase activiteit miRNAs stabiel biomarkers die gemakkelijk kan worden gedetecteerd in formaline gefixeerde weefsels 21 en prostaatbiopsieën 22. Bovendien hebben de expressie profielen van miRNAs vergeleken in bevroren en in formaline gefixeerde weefsels en zijn gevonden om sterk te zijn gecorreleerd 21. Echter, miRNA expressie profilering bij prostaatkanker klinische weefsels vaak uitdagende vanwege tumor heterogeniteit, steekproeffouten, stromale vervuiling etc. De ontwikkeling van miRNAs zo effectief biomarkers voor prostaatkanker zwaar relies hun nauwkeurige detectie in klinische weefsels. Hier beschrijven we een vereenvoudigde workflow gebruikt in ons lab voor miRNA expressie profilering in gearchiveerde FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische monsters. We gebruiken een combinatie van kwantitatieve real-time PCR en in situ hybridisatie voor miRNA analyses van klinische monsters, met de voormalige waarbij meer kwantitatieve informatie en de laatste voor het visualiseren van de differentiële expressie van miRNA potentiële biomarkers in een reeks van weefsels. Binnen deze workflow optimaliseren we de bestaande methodieken voor miRNA extractie uit FFPE en bevroren prostaat weefsels, expressie geanalyseerd door Taqman-probe gebaseerde miRNA RT-PCR en miRNA in situ hybridisatie techniek met behulp vergrendeld nucleïnezuur (LNA) gebaseerde sondes 23. LNA-probes bieden verhoogde gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met DNA- of RNA probes en maakt robuuste detectie van alle miRNA sequenties, ongeacht hun GC-gehalte en tevens discriminatie toestaantie van miRNA families. De geoptimaliseerde miRNA ISH protocol kan worden toegepast op prostaatkanker weefselobjectglaasjes of prostaatkanker weefsel microarrays (TMA), waarbij de laatste met het vermogen om miRNA biomarkers versnellen.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix voor LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternatief kan het Arcutus Xt-systeem van Life Technologies worden gebruikt.&nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR Systeem&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transcriptie kit&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>DIG gelabelde LNA sonde voor U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP substraat</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-hybridisatie oplossing&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatie oplossing&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Blokkingsoplossing&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP-geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Waterige montage media&nbsp;</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (guanidine isothiocyanate-fenol reagens)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxiline</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosine&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna expressie analyses bij prostaatkanker klinische tissues

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Een cruciale uitdaging bij prostaatkanker (PCA) klinische behandeling wordt gesteld door de ontoereikendheid van de momenteel gebruikte biomarkers voor de ziekte van screening, diagnose, prognose en behandeling. De laatste jaren microRNA (miRNAs) zijn gebleken veelbelovende alternatieve biomarkers voor prostaatkanker diagnose en prognose. De ontwikkeling van miRNAs zo effectief biomarkers voor prostaatkanker sterk afhankelijk van de nauwkeurige detectie in klinische weefsels. miRNA analyses in prostaatkanker klinische monsters is vaak een uitdaging vanwege tumor heterogeniteit, steekproeffouten, stromale vervuiling etc. Het doel van dit artikel is om een vereenvoudigde workflow beschrijven miRNA analyses in gearchiveerde FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische monsters met een combinatie van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH). Binnen deze workflow optimaliseren we de bestaande methodieken voor miRNA extractie uit FFPE en bevroren prostaat tissues en expressie geanalyseerd door Taqman-probe gebaseerde miRNA RT-PCR. Verder beschrijven we een geoptimaliseerde werkwijze voor ISH analyse formiRNA detectie in prostaatweefsel met behulp vergrendeld nucleïnezuur (LNA) - probes. De geoptimaliseerde miRNA ISH protocol kan worden toegepast op prostaatkanker weefselobjectglaasjes of prostaatkanker weefsel microarrays (TMA).

Expressieprofiel van miR-203 in LCM primaire prostaatkanker klinische monsters met RT-PCR-analyses (figuur 1) RT-PCR analyse van relatieve miR-203 expressie in LCM primaire prostaatkanker weefsels en de bijbehorende aangrenzende normale gebieden werd uitgevoerd zoals beschreven in Saini et al. 15 RNU48 werd gebruikt als controle. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de relatieve miR-203 expressie bij prostaatkanker tumor weefsel ten opzichte van de ...

Hier beschrijven we een vereenvoudigd protocol voor microRNA (miRNA) expressieanalyses in gearchiveerde, formaline-gefixeerde, paraffine-ingeslagen (FFPE) of vers bevroren prostaatkanker (PCa) klinisch weefsel met behulp van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH).

miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Het algemene doel van deze video is om een vereenvoudigde workflow te beschrijven voor micro RNA-analyses in gearchiveerde klinische prostaatkankermonsters met behulp van een combinatie van kwantitatieve real-time PCR en NC twee hybridisatie met de implementatie van probes op basis van locked nucleic acid. Dit wordt bereikt door eerst weefsel te isoleren uit FFPE-coupes van prostaatkanker met behulp van laser capture microdissectie, gevolgd door een micro RNA-extractie. Vervolgens wordt twee-staps R-T-P-C-R gebruikt om het micro RNA in het weefsel te kwantificeren en om het micro RNA te lokaliseren in C twee hybridisatie-analyse, die wordt uitgevoerd met digoxygen-gelabelde LNA-probes en AP-geconjugeerde antigen-antilichamen gedetecteerd door BM purple.De gepresenteerde resultaten tonen de expressie van een micro-RNA in klinische weefsels van prostaatkanker. Onlangs zijn micro-RNA's naar voren gekomen als veelbelovende alternatieve ziektebiomarkers voor prostaatkanker. De analyse van micro-RNA-expressie in klinische prostaatkankerspecimens is echter vaak uitdagend vanwege verstorende factoren zoals de heterogeniteit van prostaattumoren en factoren zoals stromale contaminatie.We zijn de afgelopen 10 jaar werkzaam geweest op het gebied van microRNA en niet-coderend RNA. We hebben de condities voor microRNA-expressie in verschillende stadia van gevorderde prostaatkanker geoptimaliseerd. Wij zijn van mening dat microRNA-expressie kan worden gebruikt als diagnostische en prognostische biomarker, omdat het correleert met de klinische uitkomst van prostaatkanker.Wij geloven daarnaast dat microRNA kan worden ingezet voor de behandeling van prostaatkanker met behulp van nanodeeltjestechnologie. Nauwkeurige expressieprofilering bij prostaatcarcinomen wordt vaak belemmerd door de heterogeniteit van de laesies. Dit wordt gedeeltelijk opgelost door gebruik te maken van laser capture microdissectie of LCM om pure benigne of maligne epitheelcellen te verzamelen en de vermenging met stroomacellules te verminderen.LCM van gearchiveerde FFP-weefsels, gevolgd door microRNA-expressieprofilering, is gebleken sensitief, betrouwbaar en kosteneffectief als aanvullende techniek; optimalisatie in C twee hybridisatie biedt inzicht in waar de microRNA's tot expressie komen zodra de weefsels zijn verzameld en in coupes van 10 micron zijn gesneden. Verwijder de paraffine in een zuurkast, week de coupes twee keer gedurende 10 minuten in xylenen en rehydrateer de weefsels vervolgens door ze te verplaatsen naar een reeks opeenvolgende waterige alcoholbaden. Breng daarna gedurende 30 seconden een hematoxyline-kleuring aan en spoel de coupes af met water.Verplaats de nu gerehydrateerde weefsels door een volgende graduele alcoholserie, beginnend bij 70%. Laat de coupes vervolgens vijf minuten baden in xylenen en laat ze aan de lucht drogen. Breng de droge objectglazen naar het instrument voor laser-capture microdissectie. Gebruik door de patholoog gemarkeerde objectglazen om de brandpunten van prostaatkanker en de benigne/normale gebieden te identificeren.Volg de richtlijnen van de fabrikant voor het uitvoeren van laser capture microdissectie. Stel de straalbreedte in op 10 tot 20 microns en pulseer deze met 70 tot 90 milliwatts. Gebruik infrarode pulsen om de gebieden van interesse op laser capture microdissectie-doppen te vangen.Voeg voor elk monster de inhoud van de dop toe aan een opvangbuis en verwerk de cellen onmiddellijk voor micro RNA-extractie. Extraheer het totale RNA met een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant. Elueer het RNA in 20 tot 30 µL nucleasevrij water en werk snel verder.Gebruik vervolgens een reverse transcriptase-reactiekit om cDNA's te maken met micro-RNA-specifieke primers. Zet elke reactie op met 10 tot 100 nanogram totaal RNA. Verdun het cDNA na opvang met een factor 5 tot 10 voor een concentratie van ongeveer 1 tot 20 nanogram.Stel nu de PCR-reacties op in triplo vanuit het CD NA met behulp van micro RNA-assays met een fast universal master mix voor de controle. Gebruik RNU 48 als template om de relatieve verandering in genexpressie te berekenen. Gebruik de comparatieve CT-methode om de vijf micron dikke weefselcoupes voor te behandelen.Fixeer de coupes bij 56 °C gedurende een uur. Ontparaffineer de coupes vervolgens met twee xyleenbaden van 15 minuten bij kamertemperatuur. Rehydrateer de weefsels daarna via een reeks oplossingen van ethanol met een aflopende concentratie. Laat de weefsels vervolgens vijf minuten weken in water.Fixeer vervolgens de weefsels met 4% PFA in PBS bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Was het fixatief weg met twee wasbeurten van vijf minuten in PBS. Meng nu proteinase K in een concentratie van 10 µg/ml in voorverwarmde proteinase K-buffer en incubeer de weefsels hierin bij 37 °C gedurende 10 minuten.Spoel de objectglazen na de behandeling gedurende 30 seconden met 0,2% glycine in PBS en was de objectglazen vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur. Week ze vervolgens opnieuw 15 minuten in 4% PFA. Was het fixatief vervolgens weer weg met twee PBS-baden van vijf minuten.De weefsels zijn nu klaar voor hybridisatie. Trek eerst met een path pen een hydrofobe cirkel rond het weefsel, zodat de oplossing in de volgende stappen op de weefselcoupe blijft. Incubeer de weefsels gedurende drie tot vier uur bij 55 °C in pre-hybridisatiebuffer.Voer dit uit in een kamer die is bevochtigd met handdoeken, gedrenkt in een oplossing van 50% formamide en 50% 5X SSC. Bereid nu de diggen- en gelabelde micro RNA-specifieke probe en de controleprobe voor. Streef naar een verdunning van 20 tot 50 nM, maar verdun de probes eerst met slechts 25 µL hybridisatiebuffer minder dan nodig is voor de uiteindelijke verdunning. Verwarm de probes vervolgens gedurende ongeveer vier minuten tot 90 °C.Plaats de probes vervolgens op ijs. Verdun de probes tot slot verder met ijskoude hybridisatiebuffer tot hun uiteindelijke concentraties van 20 tot 50 nanomolar. Breng nu 100 tot 400 microliters van de probe-oplossing aan op elk objectglas.Incubeer ze vervolgens gedurende 12 tot 16 uur bij de juiste hybridisatietemperatuur. Voer de volgende dag een wasbeurt met SSC-oplossing uit in verschillende stappen na de wasbeurten. Incubeer de objectglaasjes gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur in blokkeringsoplossing na de blokkering.Week de weefsels in een 1:100 verdunning van AP-geconjugeerd antigenine in PBS. Doe dit gedurende één tot vier uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 °C. Verwijder vervolgens het overtollige antilichaam door drie keer te wassen met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt.Volg dit op met twee wasbeurten van vijf minuten in een pee-buffer bij kamertemperatuur. Incubeer de coupes vervolgens in BM purple, AP-substraat, afgeschermd van licht bij kamertemperatuur gedurende één tot 20 uur. Verwijder de volgende dag de BM purple door te spoelen met 0,1% tussen 20 in PBS.Was ze vervolgens twee keer met water en monteer ze met een waterige monteermiddel volgens het beschreven protocol voor microRNA-extractie en RT-PCR. microRNA 203 werd onderzocht in prostaatkankerweefsel en aangrenzend normaal weefsel. De relatieve expressie varieerde in een aanzienlijk deel van de weefsels.RNU 48 werd als controle gebruikt. Prostaatkankerveefsels werden ofwel onder de microscoop gemicrodissecteerd of onderworpen aan LCM, waarna de relatieve microRNA-383-expressie werd geanalyseerd. De expressie in tumorweefsels werd vergeleken met bijbehorende normale controles.Door middel van LCM geprepareerd weefsel detecteerde de expressie van micro-RNA betrouwbaarder. In C werd tweemaal hybridisatie naar microRNA 2 0 3 uitgevoerd in normaal en botmetastatisch prostaatkankerweefsel. U zes.RNA-detectie werd gebruikt als controle op basis van de kleurintensiteit. De expressie van microRNA 2 0 3 werd in cellen van elk weefsel gescoord van één tot vier. De expressie bleek hiermee statistisch lager te zijn in het botmetastatische weefsel.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de expressie van microRNA in klinische monsters van prostaatkanker gedurende de volledige workflow kan worden beoordeeld. Het is van het grootste belang om een RNA-vrije omgeving te handhaven. Daarnaast kan het werken met paraformaldehyde en zoutoplossingen extreem gevaarlijk zijn; er moeten daarom altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure, zoals het werken in een zuurkast en het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen.Na deze procedure voeren we een statistische analyse uit om vast te stellen of micro-expressiepatronen gecorreleerd zijn met de klinisch-pathologische variabelen van de ziekte, wat ons helpt om kernvragen te beantwoorden, zoals of de expressie van een specifiek micro-RNA een geassocieerd prognostisch of diagnostisch potentieel heeft. Ons geoptimaliseerde microRNA-in-situ hybridisatieprotocol kan worden toegepast op coupes van prostaatkankerveefsel of prostaatkanker-tissue microarrays. Dit protocol kan, na optimalisatie, ook worden toegepast op andere weefseltypes.

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Kwantitatieve Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is een snelle en gevoelige methode om de expressie niveaus van verschillende microRNA (miRNA) moleculen te onderzoeken in tumor monsters. Met deze methode uitdrukking van honderden verschillende miRNA-moleculen kunnen worden versterkt, gekwantificeerd en geanalyseerd uit dezelfde cDNA sjabloon.

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.

Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Het doel van dit protocol is om laser-capture micro-dissectie te gebruiken als een effectieve methode om pure populaties van celtypen te isoleren uit heterogene prostaatweefsels voor downstream RNA-analyse.

Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse

Immunohistochemmie is een krachtige laboratoriumtechniek voor het evalueren van eiwitlokalisatie en -expressie in weefsels. Huidige semi-automatische methoden voor kwantificering introduceren subjectiviteit en leiden vaak tot onherhaalbare resultaten. Hier beschrijven we methoden voor multiplexte immunohistochemmie en objectieve kwantificering van eiwitexpressie en co-lokalisatie met behulp van multispectrale beeldvorming.

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Hier presenteren we een protocol om miRNA-expressie in monsters van borstkankerpatiënten te detecteren met behulp van miRNA in situ hybridisatie.

Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; hybridisatie

Deze gewijzigde extractie protocol verbetert RNA en DNA opbrengst van meer doelgerichte regio's van belang in histopathologische weefsel blokken.

Bereiding van formaline gefixeerde paraffine-ingebed weefsel Cores voor zowel RNA en DNA-extractie

Nucleïnezuur afbraak in archivering weefsel, tumor heterogeniteit, en een gebrek aan vers bevroren weefsel monsters kan negatieve invloed hebben op kanker diagnostische diensten in pathologie laboratoria wereldwijd. Dit manuscript wordt beschreven voor het optimaliseren van een panel van biomarkers met behulp van een multiplex magnetische kraal assay te classificeren van kanker van de borst.

Optimalisatie van een Multiplex RNA gebaseerde expressie-Assay met behulp van borst kanker archiefmateriaal

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

Therapie resistentie ontwikkelt zich vaak bij patiënten met gevorderde prostaatkanker, en in sommige gevallen vordert kanker naar een dodelijk subtype genaamd neuro-endocriene prostaatkanker. Beoordeling van de kleine niet-codering RNA-gemedieerde moleculaire veranderingen die deze overgang vergemakkelijken zou leiden tot een betere stratificatie van de ziekte en identificatie van causale mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van neuro-endocriene prostaatkanker.

Sequentiëren van klein niet-coderende RNA van Formalin-vaste weefsels en van serum afgeleide Exosomen van castratie bestendige prostaatkanker patiënten

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer een vereenvoudigde workflow voor miRNA-expressieanalyse in gearchiveerde prostaatkankerweefsels met behulp van kwantitatieve real-time PCR en in situ hybridisatie.

miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues

Meer video's verkennen