Name: De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Leer een chirurgische techniek voor het toedienen van ototoxische middelen via het ronde venster van de muiscochlea. Deze methode behoudt de cochleaire microarchitectuur en maakt gerichte studies naar cochleaire celdegeneratie en regeneratie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) met Grant nummer: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). Dit werk profiteerde ook van de South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van het onderzoek, gegevensverzameling en/of analyse. De auteurs willen Lonnie E. Brown Jr. bedanken voor zijn artistieke en grafische bijdragen.

Alle aspecten van het onderzoek op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de geschikte Institutional Animal Care en gebruik Comite. Alle gewervelde dieren experimentele hier beschreven procedures werden goedgekeurd op grond van de richtlijnen van de Medische Universiteit van South Carolina (MUSC) Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Model Selection <ol><li> Behouden het diermodel in een laag geluidsniveau terrarium met routine conciërges per institutionele protocollen tot aan gebruik. In dierlijke onderzoeksfaciliteiten (ARF&#39;s), te behouden stabiliteit trillingen, lawaai demping, dagelijkse verlichting, prep ruimte, afwerkingen, afdichting en waterdicht maken, en ventilatie dat NIH normen voldoen. Opmerking: National Institutes of Health (NIH) richtlijnen voor ARF&#39;s en het onderhoud van een laag geluidsniveau terrarium kan worden beoordeeld op: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ </li><li> Voor alle experimenten met de rechter oor als experimentele oor. Het linker oor dient als een intra-dierlijke controle en niet chirurgisch veranderd. </li><li> Inspecteer het model van pre-operatief op tekenen van midden of buitenste oorontsteking. Mogelijke tekenen kunnen weglekken van vloeistof of pus uit het oor, ontstoken weefsel oorschelp en / of lethargie van het dier. Dit is ongebruikelijk, maar als opgemerkt, voorkomen verdere chirurgie en geschikte wijze te behandelen dier. </li></ol> 2. preoperatieve Procedures <ol><li> Verdoven het dier 30 minuten voorafgaand aan de operatie en elke PO procedures via intraperitoneale (IP) injectie van ketamine (100 mg / kg IP) en xylazine (20 mg / kg IP). Supplement narcose noodzakelijk, zoals beoordeeld door een positieve toe-pinch reflex, met een lagere dosis ketamine (25 mg / kg IP) en xylazine (5 mg / kg IP). Bepaal de dosering in overeenstemming met institutioneel toegestaan ​​protocollen voor muizen met de leeftijd de nodige aanpassingen in de dosis. </li><li> Controleer voor volledige sedation van het model. Controleer of er een fase 3 vlak van anesthesie voor het geheel van de beschreven protocol gekenmerkt door een regelmatige ademhaling, een gebrek aan oprichtreflex reflex (bij muizen), en het ontbreken van pedaal en oogleden (teen-snuifje) reflexen. Handhaving van de dieren op dit niveau van de anesthesie. Dit is essentieel voor de minimalisering van pijn en intraoperatieve beweging, bloeden, en lekkage van interstitiële vloeistoffen tijdens de operatie. </li><li> Onderhouden lichaamstemperatuur van het dier bij 37,5 ° C met een gesloten-lus verwarming pad. </li><li> Dien analgesie via subcutane injectie van buprenorfine. Lever buprenorfine (0,1 mg / kg SQ eens 30 min vóór de operatie) als analgesie elke chirurgische ongemak. Base dosering en geschikte alternatieven voor het geselecteerde model op institutioneel goedgekeurd protocol. Antibiotica gebruik is niet nodig als een goede aseptische techniek is geoefend. De dieren krijgen postoperatieve analgesie als er tekenen van pijn en verdriet. </li><li> Voeren physiologic testen preoperatief. Het uitvoeren auditieve hersenstam respons (ABR) testen en / of vervalst product opto-akoestische emissietestprocedure (DPOAE) zowel preoperatief en net voor opofferen van het dier dient als een objectieve meting van het effect van de gekozen ototoxische middel aan gehoor van de muis. </li></ol> 3. Chirurgische Voorbereiding en Positionering <ol><li> Steriliseren alle instrumenten preoperatief per institutionele normen. Bereiden chirurgische instrumenten en veld in een consistente, steriel, en georganiseerde manier om onnodige inspanning en beweging tijdens de procedure te voorkomen. Typische instrumenten nodig omvat scherpe ontleden schaar, verschillende paren metalen tang met juwelier tips, een otologische pick, een otologische curette, en een bipolaire elektrocauterisatie eenheid (figuur 1). </li><li> Bereiden en steriliseren papier wieken uit labwipes vooraf door het snijden van een kleine driehoekige stukje van de wipe (~ 0,7 x 1,25 cm x 1.75 in) en draaien stevig tussen duim en wijsvinger van één hand (~ 1,25 in). Oprichting van een strak verdraaid, uiterst dunne lont is van cruciaal belang voor het succes van de procedure. Bereid een totaal van 15-20 wieken voor de operatie (figuur 2). </li><li> Gebruik een tandartsboor aan het bot van het trommelvlies bulla snel door op gecontroleerde wijze. Toepassing van een riemaandrijving dental handboormachine met 1 of 2 mm taps toelopende tip voorkeur. Een operatieve microscoop moet het protocol voltooid. (zie Stap 4.7) </li><li> Pre-putten 0,2 ml van een waterige oplossing die het geselecteerde ototoxische middel in een 1 ml tuberculine spuit met een 28 G, 1/2 &quot;naald. Typisch 1 druppel (~ 10 pi) van het middel voldoende om volledig te vullen de muis RWN. Een metalen, stompe punt naald vergemakkelijkt de levering van de agent, terwijl het voorkomen van schade aan onderliggende structuren door een scherpe schuine tip. Verdrijven enige lucht in de spuit als belletjes per ongeluk kan vullen de RWN en / of een goedetoepassing van het middel aan het ronde venster zelf. </li><li> Verwijder bont van de post-auriculaire huid met behulp van elektrische verzorging tondeuse. Verwijder bont in een zone die zich uitstrekt van de Auriculo-Cephalic vouw rostraal aan de schoudergordel caudaal. Breiden haar verwijdering uit de dorsale, sagittale middellijn aan de onderkaak hoek zijwaarts. Goede vacht verwijderen is van cruciaal belang voor het behoud van een schone en heldere chirurgische veld. Borstel zachtjes knipsels van de beoogde chirurgische plaats. </li><li> Steriliseren huid van voorbereide oppervlakte per institutionele protocollen. Breng betadine (povidon / jodium) afgewisseld met ethanol topisch op een cirkelvormige wijze gedurende 2 min. Andere middelen kunnen worden vervangen per institutionele richtlijnen. </li><li> Leg het dier op een vlakke ondergrond tot constant lichaamshouding tijdens de procedure te handhaven. Gebruik een klein verwarmingselement onder het lichaam geplaatst op het platform lichaamstemperatuur gedurende de procedure om de lichaamstemperatuur van het dier bij 36-38 ° C te handhaven. Niet overheat het dier omdat dit kan leiden tot milde tot ernstige beschadiging van de huid en / of vroege euthanasie. <ol><li> Zet de kop van het dier via een beet blok / head houder apparaten. Maken gebruik van een 0,5 cm bij 2 cm bijtblok vervaardigd uit messing met 2-4 gaten mm diameter geboord door het op 5 mm intervallen langs de lange as. Bek van het dier geopend dit toestel en plaats de bovenste centrale snijtanden in een van de gaten afhankelijk van de grootte van het dier. Draai voorzichtig een kleine klem over het dorsale gedeelte van de snuit van het dier om het te houden op zijn plaats (figuur 3). </li><li> Controleer of de bijtblok / kophouder stijf verbonden is met het midden van een U-vormige scharnierende arm (Figuur 3). Bevestig een 1 cm brede stang de linkerarm van de &quot;U&quot; en gebruik rod als linker hoofdsteun (rechts ligt altijd werkzaam zijde). </li><li> Eenmaal stevig in het hoofd houder, draai de muis om een ​​linker laterale decubitus positie. Plaats het lichaam carefully op het vlakke contactvlak te garanderen dat het gehele procedure stabiel en nodeloze torsiebelasting op de halswervels. </li></ol></li><li> Positioneren een operationele microscoop staat 4x, 10x en 20x vergroting over de chirurgische veld. Controleer of de microscoop zijn positie in een hands-free wijze kan handhaven is ideaal voor tweehandige operatieprotocol hieronder besproken. </li><li> Plaats een bipolaire-enabled cauterisatie unit met fijne getipt juwelier kant stuk in een positie die is direct beschikbaar voor de hulp bij brandwonden van kleine schepen en dissectie van weefsel. Dit kan ook noodzakelijk zou zwaarder bloeden worden ondervonden. </li></ol> 4. Chirurgische Approach <ol><li> Onder microscopische vergroting, scherpe schaar of een scalpel een 1-1,5 cm postauricular incisie, ongeveer 6-8 mm caudaal van de auriculocephalic vouw te maken. In de volwassen muis, een incisie in de dorsale middellijnzijdelings tot nabij de hoek van de onderkaak voldoende. Zorgvuldig te vermijden snijden diep naar onderliggende vasculaire structuren te behouden. </li><li> Voer zorgvuldige stompe dissectie door de onderhuidse vetlaag die variabele dikte kunnen worden. Vet kan veilig worden verwijderd indien nodig om betere blootstelling. Wees voorzichtig bij het ontleden in een ventrale-mediale richting als de externe halsader doorkruist dit gebied en schade aan deze structuur kunnen grote hoeveelheden bloed verlies en overstroming van de chirurgische veld veroorzaken. Controle buitensporige bloeden met absorbeerbare gelatine sponzen en / of katoen pellets. Gebruik bipolaire cauterisatie voor zwaardere bloeden. </li><li> Zodra de vetlaag goed verdeeld, bloot cervicale musculatuur. Let op belangrijke structuren met inbegrip van de grote spier lichaam van de cleidomastoideus centraal binnen de blootgestelde chirurgische veld, de externe halsader ventraal en oorspeekselklierweefsel rostraal bovenop de hoek van de onderkaak. Een belangrijke mijlpaal is een kleine zenuw branch (van hersenzenuw XI) die rond het achterste / dorsale rand van de cleidomastoideus om rostraal uitbreiding naar de oorschelp (figuur 4). </li><li> Zachtjes trekken de cleidomastoideus spier lichaam in een posterior / dorsale richting (figuren 4, 5). Zachtjes verdelen de transparante fascia omhult de spier lichaam. Op soortgelijke wijze, zachtjes trekken de parotis en uitwendige halsader in de tegengestelde (anterior / ventraal) (Afbeelding 5). </li><li> Met goede terugtrekken van de cleidomastoideus spier lichaam, de glimmende koepel van het trommelvlies bulla periosteum in beeld (figuur 6) komt. Aan het caudale aspect van de bulla, het inbrengen van een diepere cervicale spier, de sternomastoideus, in zicht (figuur 6) komt. Het behoud van de gezichtszenuw, die zichtbaar is op de rug- en rostrale aspect van de bulla koepel wordt. Plaats een self-behoud oprolmechanisme (steriele titanium shaft-- ingebed in disposable siliconeplakken) voorafgaand aan het boren. </li><li> Met twee handen techniek, voorzichtig verdelen de bulla periost met een bipolaire diathermie aan het onderliggende bot bloot te leggen. Met behulp van een tang of een otologische curette, voorzichtig verheffen en duw het periost in een perifere richting om de bulla koepel op grote schaal bloot. Opmerking: Step 4,6 kritisch chirurgische gezien de middenruimte oor maximaliseren. Gebruik maken van zorgvuldige en zachte zacht weefsel handling te bloeden en / of lekken van interstitiële vloeistof te voorkomen in de bulla holte na het boren. </li><li> Bij een correct belichte bulla koepel, boor een 2 mm piloot gat door de bulla bot met een tandheelkundige chirurgische boor tussen de caudale rand van de koepel en de ondoorzichtige lijn (die het trommelvlies) die zich uitstrekt over de rostrale aspect van de bulla (Figuur 7). Zorg te boren alleen door bot onderliggende structuren, zoals de stapediale slagader te behouden. Boor een tweede piloot gat in de buurt om de VN-dakbedekking van de bulla bot te vergemakkelijken (&lt;strong&gt; Figuur 7). </li><li> Met behulp van een paar van de juwelier tip tang, Haal het beschermkapje van de bulla bot in een dorsale en caudale richting (figuur 8). Verwijder het bot in een fragmentarische wijze onder hoge vergroting. Niet doorboren de stapediale slagader, die direct ligt onder de bulla cap, zoals bloeden uit deze slagader kan de procedure in gevaar brengen. Minimaliseren van de hoeveelheid bot verwijderd om overmatig fluïdum toegang tot het middenoor voorkomen terwijl nog steeds een uitstekende visualisatie en toegang tot de ronde venster niche (figuur 8). </li></ol> 5. Rond Venster Toepassing van Ototoxische Agent <ol><li> Maak subtiele rotatie aanpassingen aan het hoofd van de houder van de RWN vierkant in beeld te brengen. De RWN bevindt zich meestal aan de dorsale en caudale aspect van de middelste ruimte oor en verschijnt als een kop-achtige inspringen van de otic capsule bot. In de meeste gevallen, de stapediale slagader loopt 1-2 mm ventraal / rostraal dit. De RWN kan soms tuc wordenperifeer ked onder een acute gehoekt van de bulla koepel. In dergelijke gevallen, zorgvuldige positionering van het hoofd van het dier staat voorop. <ol><li> Met behulp van het papier wieken preoperatief voorbereid, verwijder alle zichtbare vloeistof in het middenoor en RWN tot het droog bot wordt gevisualiseerd. Opmerking: Dit is de meest cruciale stap in het gehele protocol, zoals het ~ 10 ul (1 druppel) van ototoxische wordt toegepast op het RWN kan gemakkelijk worden verdund door deze vloeistof. </li></ol></li><li> Onder maximale vergroting, met een fijne kaliber naald op een 1 ml tuberculine spuit een druppel (~ 10 ul) van ototoxic rechtstreeks van toepassing op de RWN, volledig vullen. Zorg ervoor dat niet verstoren de stapediale slagader en nauw te observeren voor de vervanging van een kleine lichtreflectie aan de basis van een droge niche met een saai en wazige vloeistof meniscus als een indicator dat de niche goed is vullen. <ol><li> Laat het middel om te rusten in de RWN ongeveer 10 minuten belichtingstijd. Hierna volledig wick uit de agent en te vervangen door een nieuwe toepassing van hetzelfde middel. Bepaal herhalingen van toepassing volgens middel specificaties. De totale belichtingstijd bij deze werkwijze varieert gewoonlijk tussen 30 tot 60 minuten. </li><li> Aan het einde van de procedure, helemaal weg lont de agent een laatste keer en verse middel van toepassing op de RWN. Laat de bulla afgetopte en een tang om het zachte weefsel te sluiten over de chirurgische plaats. </li></ol></li><li> Afdichting chirurgische plaats op het niveau van de huid met een 4-0, niet absorbeerbare monofilament hechtmateriaal. Plaats het dier in een kooi herstel / station. Monitor klinische toestand van het dier regelmatig na de operatie. Handhaven van het dier in de juiste omgeving voorwaarden, met inbegrip van huisvesting met zachte bedden en suppletie met zacht voedsel, om stress te minimaliseren. Bepaal toekomstige procedures en post-operatieve voorwaarden volgens de institutionele IACUC protocollen. </li><li> Gebruik institutionele IACUC protocollen instrument steriliserens voor gebruik in het volgende dier. Zorg voor goede koeling tijd tussen gebruiken instrument. </li></ol> 6. Postoperatieve Procedures en Cochlear Tissue Oogsten <ol><li> Zoals beschreven in stap 2,5, uitvoeren fysiologische testen gehoor postoperatief op gewenste plaatsen en voorafgaand aan offeren. Voeren Postoperatieve procedures volgens experimentele doeleinden. Offer het dier op elke gewenste postoperatieve dag. </li><li> Bij volledige narcose via IP-injectie, zoals vereist per institutionele IACUC protocollen opofferen van het dier. Met behulp van een scherpe schaar, onthoofden dier net caudaal van het achterhoofd. Scherp open de neurocranium met een schaar langs de dorsale en ventrale middellijn en verspreiding op grote schaal. Voorzichtig schep hersenweefsel aan de temporale botten bloot. Opmerking: Een aantal van de procedures voor het onderzoek van de post veranderingen blootstelling in het slakkenhuis kan vertakken vanaf dit punt en zal in de discussie sectie worden vermeld. Bepaal de onderzoeksmethode meest relevant de experimentele doelen. Als elektronenmicroscopie is gepland na het slakkenhuis worden doorgesneden, gebruiken hartkatheterisatie een pre-fix het weefsel. Dit valt buiten het bestek van deze discussie en is behandeld in de diepte elders. 13 </li><li> Snijd de temporele beenderen uit de schedelbasis met de schaar en onmiddellijk in fixeeroplossing. Dompel botten in 4% paraformaldehyde gedurende 1,5 uur bij KT. Monitor fixatietijd, een langere duur van het resultaat van histologische analyse op latere stappen kunnen beperken. Ontkalken ontleed botten voor een variabele periode via onderdompeling in 1 mM Ethyleendeniaminetetraacetaat (EDTA). </li></ol>

<ol><li>Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+lesions+of+the+vestibular+labyrinth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Selective lesions of the vestibular labyrinth.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 97, 577-584 (1988).</li>
<li>Dodson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+and+survival+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+guinea+pig+after+intracochlear+perfusion+with+aminoglycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides.</a> Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).</li>
<li>Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-related+vestibular+and+cochlear+effects+of+transtympanic+gentamicin%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+otology%22%5BJournal%5D)">Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin.</a> The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).</li>
<li>Lee, K. S., Kimura, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ototoxic+drug+administration+to+the+endolymphatic+sac%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).</li>
<li>Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain+application+to+the+round+window+of+the+gerbil+cochlea%3A+a+model+of+auditory+neuropathy+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+%3A+JARO%22%5BJournal%5D)">Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).</li>
<li>Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+furosemide+applied+chronically+to+the+round+window%3A+a+model+of+metabolic+presbyacusis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).</li>
<li>Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocochlear+potential+and+endolymphatic+K%2B+changes+induced+by+gap+junction+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oto-laryngologica%22%5BJournal%5D)">Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers.</a> Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).</li>
<li>Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+intracochlear+drug+delivery+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A method for intracochlear drug delivery in the mouse.</a> Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).</li>
<li>Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+administration+of+gentamicin%3A+a+new+method+for+the+study+of+ototoxicity+of+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells.</a> Hearing research. 125, 109-119 (1998).</li>
<li>Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+gentamicin+application%3A+an+inner+ear+hair+cell+damage+protocol+for+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse.</a> Hearing research. 162, 65-74 (2004).</li>
<li>Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Bungarotoxin+application+to+the+round+window%3A+an+in+vivo+deafferentation+model+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear.</a> Hearing research. 265, 70-76 (2010).</li>
<li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+furosemide+treatment+and+age+on+cell+division+in+the+adult+gerbil+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+%3A+JARO%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).</li>
<li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain+induces+apoptotic+cell+death+in+type+I+spiral+ganglion+neurons%2C+but+not+type+II+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+%3A+JARO%22%5BJournal%5D)">Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).</li>
<li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+the+cochlea+of+an+auditory-neuropathy+animal+model%3A+effects+of+timing+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+%3A+JARO%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).</li>
<li>Stevens, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heptanol+application+to+the+mouse+round+window%3A+a+model+for+studying+cochlear+lateral+wall+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology--head+and+neck+surgery+%3A+official+journal+of+American+Academy+of+Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration.</a> Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).</li>
<li>Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+hearing+in+80+inbred+strains+of+mice+by+ABR+threshold+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses.</a> Hearing research. 130, 94-107 (1999).</li>
<li>Hequembourg, S., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+ligament+pathology%3A+a+major+aspect+of+age-related+cochlear+degeneration+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+%3A+JARO%22%5BJournal%5D)">Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).</li>
<li>Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical-to-basal+gradients+in+age-related+cochlear+degeneration+and+their+relationship+to+%27primary%27+loss+of+cochlear+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons.</a> The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).</li>
<li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-related+genes+change+their+expression+with+age+and+hearing+loss+in+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+an+international+journal+on+programmed+cell+death%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).</li>
<li>Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+to+select+genes+from+RMA+normalized+microarray+data+using+functional+hearing+tests+in+aging+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice.</a> Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+hearing+loss%3A+GABA%2C+nicotinic+acetylcholine+and+NMDA+receptor+expression+changes+in+spiral+ganglion+neurons+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse.</a> Neuroscience. 259, 184-193 (2014).</li>
<li>Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+membrane+intracochlear+drug+delivery+enhanced+by+induced+advection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).</li>
<li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+for+antioxidants+pathways+in+the+mouse+cochlea%3A+relations+to+age-related+hearing+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits.</a> PloS one. 9, e90279(2014).</li>
<li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+up-regulation+and+glial+cell+proliferation+following+degeneration+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+adult+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+%3A+JARO%22%5BJournal%5D)">Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).</li>
</ol>

Geen concurrerende financiële belangen. De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol en representatieve resultaten hierboven beschreven werden verkregen in een KBA / CAJ muismodel inclusief beide geslachten. Dit inteeltstam is goed opgezet als een &quot;goed gehoor&quot; standaard en &#39;normale veroudering&#39; model in het horen van het onderzoek. 16-23 Omschrijving van het gebruik van dit protocol in andere zoogdieren modellen valt buiten het bestek van deze tekst. De lezer dient er echter op dat de RWN applicatietechniek biedt verscheidene voordelen voor het bestuderen van zoogdieren binnenoor. Hiervan zijn de meest opvallende is dat het voorkomt direct verstoring van de delicate anatomische structuur en biochemische gradiënten die binnen de wanden van de otic capsule. Procedures zoals cochleostomie en implantatie van infuuspompen hebben de neiging om direct schenden binnenoor structuren leiden tot permanente verschuivingen drempel; een feit dat rekening moet worden gehouden bij het analyseren van de resultaten. Verstoring van cochleaire zijwand structuren door invasieve methods kan ook het gebruik van ototoxische middelen zoals furosemide of heptanol, waarvan de specifieke zone effect beperkt is op die locatie. 15,24 Alternatieve niet-invasieve benaderingen zoals trans-tympanische injectie en parenterale injectie werden geplaagd door onbetrouwbare resultaten en beperken / of systemische toxiciteit voor het diermodel. Deze applicatiemethode is gebleken dat beide tekortkomingen te vermijden, om een ​​niveau van consistentie benaderen die van de meer invasieve werkwijzen hierboven besproken. Andere voordelen van deze techniek omvatten is de brede toepasbaarheid op een aantal diermodellen en haalbaarheid te nemen in een bestaande labinfrastructuur. Bij dit laatste wordt geen speciale reagentia of chemicaliën afgezien vereist van de gekozen ototoxische middelen, anesthetica en analgetica. Ototoxische middelen worden typisch gebruikt bij een vaste concentratie en gemengd in een voldoende grote hoeveelheid van oplossing (5 ml) voor lange tijd duren overwegening elke toepassing gebruikt ongeveer 10 gl (bij muizen). Dus na de eerste bevoorrading en instrumenten, onderzoekers betrekkelijk vrij van tijdrovende oplossingspreparaat of frequente vervanging van materialen. Deze techniek heeft ook verlagingen operatieduur, die aanzienlijk kunnen zijn in vergelijking met procedures waarbij implantatie van perilymphatic infusiepompen of cochleostomies. Bij het bereiken van een niveau van technische bekwaamheid, onze gemiddelde doorlooptijd van de initiële incisie te sluiten was typisch 20 minuten tot 1,5 uur, afhankelijk van de duur van de blootstelling gewenst voor het ototoxische middel. Drie of vier operaties kan gemakkelijk in een enkele dag worden ingevuld, waardoor verhoogde efficiëntie en verhoogde kans op het verkrijgen van goede resultaten. Zoals hierboven beschreven, kan deze techniek ook gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van diermodellen zoals muizen, ratten, cavia&#39;s en woestijnratten. Beperkingen van deze methode zijn gericht op dematig steile leercurve nodig om het te beheersen en verminderde verwachte resultaten tot technische vaardigheid is bereikt. Zoals in meer detail zal worden besproken, zullen kleine fouten tijdens de chirurgische ingreep of onvoldoende visualisatie van het operatieveld bijna altijd tot een slechte uitkomst. Subtiele bevindingen dat een beginner kan falen te herkennen, zoals een sub-millimeter dikke luchtbel blokkeren van de toegang van de agent om de ronde venster membraan of interstitiële vloeistof verdunnen van de agent, neem de tijd om te waarderen en de psychomotorische vaardigheden die nodig zijn om ze te corrigeren ontwikkelen. Echter, met herhaalde uitvoering van de procedure deze hindernissen overwonnen gemakkelijk en vormen een minder enorme technische uitdaging voor onderzoekers dan sommige van de bovengenoemde invasieve methoden. Tenslotte wordt deze techniek gekoppeld aan de relatieve beperking dat cochleaire schade alleen kunnen worden geïnduceerd op één tijdstip tijdens de chirurgische blootstelling. Dit kan worden overwonnen om een ​​zekere mateDoor het vullen van de RWN met absorbeerbare gelatine spons met het agens zoals beschreven door Heydt et al. 10 De absorbeerbare gelatinespons zal resorberen tijd, maar kan zorgen voor een langere blootstellingsperiode dan bereikt door toepassing van een waterige oplossing alleen is. Om een ​​onderzoeker om de volledige voordelen van deze techniek te realiseren en valkuilen voorkomen, is het essentieel om de twee essentiële onderdelen van deze techniek herkennen: 1) de aanhoudende visualisatie van het middenoor ruimte RWN handhaven; en 2) het vermogen om de chirurgische gebied vrij van interstitiële vloeistof en / of bloed te houden. Bij het bereiken van de eerste van deze, kan het belang van een goede kop-houder niet genoeg worden benadrukt. Veilige fixatie van het hoofd van het dier zorgt voor een stabiele weergave onder de microscoop; waarvan het belang wordt snel duidelijk als subtiele instrumentatie drastisch verandert de positionering van structuren onder vergroting. Een goede hEAD houder die kan roteren rond het dier rostrale-caudale as vergemakkelijkt ook de belangrijke dynamische veranderingen in de lijn van de site van de onderzoeker. Vaak kan enkele millimeters rotatie om deze as het verschil tussen visualisering van de RWN en visualisatie van alleen de otic capsule bot betekenen. Het vermogen om te veranderen voortdurend uitzicht is ook het grootste belang om ervoor te zorgen interstitiële vloeistof goed is verwijderd uit de diepten van de niche en ook dat de ototoxic stof volledig is verwijderd tussen applicaties zoals besproken in deel 5. In onze ervaring, bloed, condensatie, of interstitiële vloeistof dat komt in de middenruimte oren heeft de mogelijkheid te verstoren gehele experiment. Dit is niet verwonderlijk, omdat de kleine hoeveelheid ototoxische middel aangebracht op de ronde venster (~ 10 pi) kan gemakkelijk worden verdund door in contact met zelfs kleine hoeveelheden vreemde vloeistof. Om deze reden is nauwgezette chirurgische dissectie en fragmentaire niet-bedekkende van het trommelvlies bulla en zorgvuldige corrosie Mion van het stapediale slagader neer op een succesvolle experimentele resultaten. Als de bovenstaande kritische stappen worden waargenomen en verwachte resultaten zijn nog steeds niet bereikt, moet het oplossen van problemen beginnen. In onze ervaring, is het vaak nuttig om het proces variaties van twee procedurele elementen uit te voeren. De eerste is de frequentie waarmee het ototoxische middel wordt bijgevuld in de ronde venster te wijzigen. Afhankelijk van het middel dat wordt gebruikt, de totale belichtingstijd ligt tussen 30 minuten en 1 uur, met volledige wicking en daaropvolgende vervanging van het middel per 10 min. Als bloot voor kortere looptijden, waardoor de totale blootstelling kan toestaan ​​dat de agent meer tijd om te verspreiden over het ronde venster membraan. Extra belichting en suppletie kan ook helpen om ongewenste verdunning van het ototoxische middel vermijden door bloed, condensatie, of interstitiële zoals hierboven besproken. Voorzichtigheid moet worden gehandhaafd bij het gebruik van deze benadering is echter, omdat het de neiging om de kans op onbedoeld vergrotenly verwonden de stapediale slagader en / of invoering interstitiële vloeistof aan de RWN. Deze techniek is belangrijk in wat het biedt te onderzoeken van cochleaire fysiologie en pathofysiologie. Deze minimaal invasieve techniek maakt gedetailleerde studie van gevoelige biochemische processen en is gelijk is in het bevorderen het onderzoek ter beoordeling van cochleaire regeneratief potentieel. 12,24 Deze chirurgische benadering en belichting wordt ook weergegeven in een verscheidenheid van andere technieken uitloper en succesvolle resultaten met deze methode zijn gemeld in studies van cochleaire implantatie stamcellen. 14 Veel blijft onbekend over het slakkenhuis, maar deze techniek, samen met de bredere instrumentarium beschikbaar voor onderzoekers, zal helpen bij het ​​verkleinen van deze kennis kloof.

Onderzoekers hebben een breed scala van diermodellen gebruikt om de normale functie van het gehoorsysteem en de pathofysiologie van gehoorverlies bestuderen. Deze modellen zijn ook zeer nuttig voor het uitvoeren van interventiestudies tegen verschillende pathologische processen en dienen als basis voor translationeel toepassingen bij menselijke proefpersonen. Voor de meeste onderzoek waarbij het slakkenhuis en de bijbehorende auditieve netwerken moet een zekere mate van beschadiging of verstoring worden ingevoerd in het systeem. Vaak wordt de schade opzettelijk gericht op een specifieke laesie te creëren, zodat onderzoekers het effect van deze laesie normale functie, evenals de cochleaire herstelmogelijkheid bestuderen. Bij het selecteren van een bepaald diermodel en / of techniek (en) voor het inbrengen schade dient een aantal factoren worden beschouwd om de best mogelijke resultaten te bereiken. Verschillende diermodellen kunnen verschillend reageren op ingrepen, terwijl de directe en indirecte effecten van een techniek kan zijnvolledig schadelijk voor het gewenste resultaat. In de meeste gevallen zou het ideale binnenoor schade protocol systemische toxiciteit vermijden, snel en betrouwbaar tot schade, maakt een nauwkeurige en consistente laesie en zijn survivable voor verder onderzoek functioneel cellulaire en moleculaire veranderingen toelaten. Idealiter zouden deze werkwijzen ook behoud van de delicate microarchitectuur elektrochemische gradiënten van de cochlea om zoveel mogelijk. Tot op heden hebben de onderzoekers er in geslaagd de oprichting van een aantal technieken om binnenoor letsel veroorzaken. De meeste inhouden blootstellen van het slakkenhuis een ototoxisch middel, hetzij systemisch of via chirurgische benadering. Technieken omvatten parenterale injectie, intraperitoneale injectie, trans-tympanische injectie, endolymfatische zak injectie en cochleostomie met perilymfatische perfusie. Deze technieken zijn gebruikt om een verscheidenheid van ototoxische middelen zoals furosemide, gentamicine, ouabain, en heptanol introduceren. 1-5Hoewel succesvol in het creëren van specifieke cochleaire laesies, de bovenstaande technieken ook hebben erkend beperkingen. Systemische injecties kunnen zeer toxisch voor het dier en kan worden geassocieerd met onbedoelde cochleaire beledigingen en inconsistente resultaten. De laatste tekortkoming is ook geassocieerd met trans-trommelvlies injecties. Technieken zoals cochleostomie en perilymfatische perfusie, maar kan induceren snelle en zeer betrouwbare laesies, direct invasief binnenoor structuur en functie. Veel chirurgische benaderingen zijn ook geassocieerd met een hoge technische moeilijkheidsgraad en vereisen waardoor vreemde voorwerpen in het dier, bijvoorbeeld een micropomp ei. 2-4,6-8 één techniek vrij van gebreken en onderzoekers moet kiezen methoden aandachtig naar hun experimentele behoeften. Hier beschrijven we in detail de ronde venster niche (RWN) applicatie techniek voor topische aflevering van ototoxische agenten in volwassen muizen. Fieerst beschreven door Husmann et al in 1998 tijdens de studie effect gentamicine op sensorische haarcellen degeneratie bij een vogel model, werd deze techniek gevonden dat in staat is aanmerkelijk betrouwbaarder laesies dan systemisch gentamicine toepassing, terwijl het vermijden geassocieerde toxiciteit. 9 Sindsdien is een aantal andere onderzoekers, waaronder ons laboratorium, hebben deze techniek een groot succes gebruikt. In 2004, Heydt et al. aangepast aan een muismodel beschreven en een verbeterd vermogen om verwondingsgrootte te controleren door het vullen van de RWN met absorbeerbare gelatine spons gedrenkt in variërende concentraties gentamicine. 10 PALMGREN et al., in 2010, onderzocht de ototoxische effecten van beta-bungarotoxine, een krachtige element in het gif van de Taiwanese gestreepte kist, door toepassing van een waterige vorm ervan de RWN van volwassen ratten. 11 Daarnaast zijn een aantal eerdere studies in ons laboratorium de ronde venster benadering van de ototoxische effecten van furosemide studie gebruiktee, ouabain en heptanol. 5,6,12-15 De resultaten van deze studies hebben het belang van cochleaire vloeistof en ionen homeostase op normaal gehoor aangetoond, ontdekte cel proliferatieve capaciteit in de spiraal ganglion en cochleaire zijwand en bevorderd ons begrip van leeftijdsgebonden gehoorverlies. De volgende aanpak omvat operatief toegang tot het middenoor via een postauricular incisie en gedeeltelijke unroofing van de benige trommelvlies bulla. Dit maakt goede belichting van de RWN en membraan waaraan een geselecteerde ototoxisch rechtstreeks kan worden toegepast. Het vloeibare middel dan zwembaden in de komvormige holte van de RWN (of langzaam afvoeren van een verzadigde absorbeerbare gelatine spons vervoerder verpakt in de RWN) en verspreidt door het ronde venster membraan in de perilymfatische ruimte van het cochleair vestibule. Geen directe cochleostomie wordt in deze benadering. De voordelen van deze techniek zijn onder behoud van binnenoor microarchitectuur, vermijdingvan systemische toxiciteit, rekening van een intra-dierlijke controle ear, snel begin van werking, selectieve degeneratie in bepaalde cochleaire celtypen (bijv. type I spiraal ganglion neuronen met ouabain belichting en cochleaire type II fibrocytes geïnduceerd door de behandeling van heptanol), en reproduceerbare / betrouwbare resultaten. Deze techniek kan worden toegepast met enkele aanpassingen tussen andere soorten knaagdieren, zoals ratten, cavia&#39;s en gerbils. Nadelen zijn een steile technische leercurve en de relatieve beperking van ototoxic belediging die is beperkt tot een enkel punt in de tijd.

<table><tbody><tr><td>1-Heptanol 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2805&nbsp;</td><td><a>PubChem Substance ID 24895536</a></td></tr><tr><td>Ketaset Injectable&nbsp;</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-803-6637&nbsp;</td><td>Concentraat 100mg/ml</td></tr><tr><td>(Ketamine HCl)</td><td>10 ml</td><td>Schedule CIII gecontrolleerde stof</td><td></td></tr><tr><td>Anased Injectable</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NADA# 139-236</td><td>Concentraat 20mg/ml</td></tr><tr><td>Buprenex Injectable&nbsp;</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-850-2280&nbsp;</td><td>Concentraat 0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>(Buprenorfine HCl)</td><td>5 ampullen per doos</td><td>Schedule CIII gecontrolleerde stof</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Skin Prep Solution</td><td>Medline</td><td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDS093941;ecomsessionid=1UZWKxhkYkuy9vK2NXBaBA__">MDS093941&nbsp;</a></td><td>1 Kwart schroefdop fles</td></tr><tr><td>0,9% steriele zoutoplossing</td><td>Variabel</td><td></td><td>Voor het mengen van oplossingen en injecties</td></tr><tr><td>Operatiemicroscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>32192</td><td></td></tr><tr><td>Gecontroleerde akoestische omgeving geluidscabine</td><td>Industrial Acoustics Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische hoofdhouder</td><td>Op maat gemaakt &ndash;&nbsp;</td><td>Zie figuur 3</td><td></td></tr><tr><td>Medische Universiteit van South Carolina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zacht weefsel retractor (draadspeciaal, titanium) 1,75 inch</td><td>World Precision Instruments</td><td>555801L</td><td>Maximale spreiding 20 mm</td></tr><tr><td>Ingebedden in wegwerpbaar plastiline om dynamisch aan de hoofdhouder te bevestigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90N tandriem aangedreven handboor&nbsp;</td><td>Emesco</td><td>Vintage Item</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelhandgreep maat 6</td><td>Bard-Parker</td><td>MEDC-011990</td><td></td></tr><tr><td>#15c roestvrijstalen chirurgische scalpelmes&nbsp;</td><td>Bard-Parker</td><td>SKU: 097-7215</td><td>50 mesjes/doos</td></tr><tr><td>Via ACE Chirurgische Benodigdheden Code</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juwelierstang met rechte punt&nbsp;</td><td>Bernell</td><td>MIL17304</td><td></td></tr><tr><td>Iris schaar gebogen</td><td>Medline</td><td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04026;ecomsessionid=ozXzkfIx-tj0MIi8FkGQ0A__">DYND04026&nbsp;</a></td><td></td></tr><tr><td>Iris schaar recht</td><td>Medline</td><td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04025;ecomsessionid=+43JREOby+Mfz6IIgoSg5A__">DYND04025&nbsp;</a></td><td></td></tr><tr><td>Stevens Tenotomie schaar recht</td><td>Medline</td><td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDG3222111">MDG3222111&nbsp;</a></td><td></td></tr><tr><td>Rosen Oor naald rechte schacht, licht gebogen punt</td><td>MytaMed</td><td>Artikelnr. 6.56.00</td><td>Figuur 1 toont opgeschoven punten met hoek. Dit werd later vervangen door de Rosen punten</td></tr><tr><td>Rosen Oor naald rechte schacht, sterk gebogen punt</td><td>MytaMed</td><td>Artikelnr. 6.56.01</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Delicate Task Wipers&nbsp;</td><td>Kimtech Science</td><td>CODE 34155&nbsp;</td><td>Wit, maat 4,4x8,4 inch. Gesneden tot driehoeken en gerold tot fijne puntjes.</td></tr><tr><td>House Oor Curette, 6&rdquo; schacht, lichte hoek</td><td>Medline</td><td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPMDG0396486">MDG0396486&nbsp;</a></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (oplosbare gelatine spons) Maat 100</td><td>Medline</td><td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPIIS34201">IIS34201&nbsp;</a></td><td>Vervangingen kunnen worden gemaakt</td></tr><tr><td>Katoenen pellets #3 4 mm</td><td>Richmond</td><td>Fabriekscode 100108</td><td></td></tr><tr><td>Elektrochirurgisch apparaat 100 E M/M</td><td>Elmed</td><td>Lijstnummer 52-5770</td><td>Bipolar en Monopolar mogelijk</td></tr><tr><td>1cc U-100 Insuline spuit 28G, 0,5&rdquo; lengte naald</td><td>BD</td><td>Productnummer: 329410</td><td>Optioneel voor het toedienen van ototoxisch middel</td></tr><tr><td>23G, stompe punt, 1&rdquo; lengte naald</td><td>Kendall</td><td>Productcode 8881202397</td><td>Voor gecontroleerde toediening van ototoxisch middel met minder risico op schade aan de slagader van de hamer</td></tr><tr><td>Chirurgisch masker</td><td>U-line</td><td>S-10478</td><td></td></tr><tr><td>Examenkwaliteit Nitril chirurgische handschoenen</td><td>U-line</td><td><a href="http://www.uline.com/Product/Detail/S-12549/Nitrile-Gloves/Nitrile-Exam-Gloves-Powder-Free">S-12549</a></td><td></td></tr><tr><td>Precisie haartjes</td><td>Wahl</td><td></td><td>Meerdere modellen kunnen worden vervangen</td></tr><tr><td>5-0 Nylon zwart monofilament naad op PC-1&nbsp; 13 mm 3/8 cirkelnaald</td><td>Ethilon</td><td>1855G</td><td>Vervangingen kunnen worden gemaakt.&nbsp;</td></tr><tr><td>Onmiddellijk afsluitende sterilisatie zak</td><td>Fisher</td><td>01-812054</td><td></td></tr><tr><td>Droge sterilisator</td><td>ROBOZ</td><td>Germinator TM 500</td><td></td></tr></tbody></table>

de muis round-window aanpak voor ototoxische agent levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van cochlear celdegeneratie

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Onderzoekers hebben een breed scala aan diermodellen en onderzoekstechnieken gebruikt om het auditieve systeem van zoogdieren te bestuderen. Veel van het fundamentele onderzoek dat betrekking heeft op de cochlea en de bijbehorende neurale paden, omvat de blootstelling van model-cochleae aan een verscheidenheid aan ototoxische middelen. Dit stelt onderzoekers in staat om de effecten van gerichte schade aan cochleaire structuren te bestuderen en in sommige gevallen de zelfherstelling of regeneratie van die structuren. Er bestaan verschillende technieken voor het toedienen van ototoxische middelen aan de cochlea. Bij het selecteren van een specifieke techniek moeten onderzoekers een aantal factoren overwegen, waaronder de inductie van onbedoelde systemische toxiciteit, de hoeveelheid cochleaire schade die door de chirurgische procedure zelf wordt veroorzaakt, het type gewenste lesie, overlevingskans van het dier en de reproduceerbaarheid/betrouwbaarheid van de resultaten. Momenteel gevestigde technieken omvatten parenterale injectie, intra-peritoneale injectie, trans-tympanische injectie, injectie in de endolymfatische zak en cochleostomie met perilymfatische perfusie. Elke methode is succesvol gebruikt en is goed beschreven in de literatuur; toch heeft elke methode verschillende tekortkomingen. Hier presenteren we een techniek voor de topische toediening van ototoxische middelen rechtstreeks op de niche van het ronde venster. Deze techniek is niet-invasief voor de binnenoorstructuren, produceert een snelle aanvang van betrouwbaar gerichte laesies, vermijdt systemische toxiciteit en biedt de mogelijkheid van een intra-animale controle (het contralaterale oor). Resultaten die voortvloeien uit deze aanpak hebben bijgedragen aan een dieper begrip van auditieve pathofysiologie, cochleaire celdegeneratie en regeneratieve capaciteit als reactie op een acute verwonding. Toekomstig onderzoek kan deze methode gebruiken om interventionele studies uit te voeren die betrekking hebben op gentherapie en stamceltransplantatie om gehoorverlies te bestrijden.

In een recente studie van Stevens et al gebruik te maken van de bovenstaande protocol, werden volwassen CBA / CAJ muizen van beide geslachten blootgesteld via ronde venster diffusie heptanol. 15 heptanol is een gap junction un-koppeling bekend te produceren gerichte, herstelbare schade aan cellen van de cochleaire laterale wand. Het doel van het onderzoek was om een ​​betrouwbaar model voor gerichte cochleaire schade veroorzaken, waardoor onderzoek postoperatief herstel van beschadigde onderdelen. Pre-operatieve en post-operatieve gehoordrempels diende als een functioneel eindpunt. Microscopie en immunohistochemische kleuring technieken gebruikt om morfologische veranderingen te bestuderen. Significante toename in ABR drempelwaarden werden waargenomen bij heptanol-behandelde muizen (figuur 9). Controle dieren die schijnvertoning chirurgie, met de levering van zout in plaats van heptanol, geen significante verschuivingen drempel te tonen op elk getest frequentie. Immunokleuren tegen een naar binnen rectificerenkaliumkanaal (Kir) 4,1 diende als een indirecte methode voor het visualiseren van schade / herstel van cochleaire structuren. Dit toonde zeer reproduceerbare verschillen tussen de behandelingsgroepen en controle oren. Overall kleuringsintensiteit werd duidelijk verminderd binnen de stria vascularis (StV) en onder fibrocyten van de spiraal ligament (SLF) 1-3 dagen na blootstelling heptanol, duidt grote hoeveelheden gerichte schade aan deze gebieden. Er was een bepaalde afname Kir 4,1 kleuring intensiteit in het gebied van type II en type IV SLFs (figuur 10) en StV (figuur 11). Bewijs van verstoorde nucleaire integriteit en chromosomale condens / blebs typische cellulaire apoptose werd gezien op nucleaire counterstains deze cochleair gebieden (figuur 10). Gevacuoleerd zones van Kir 4,1 kleuring duidelijk opgelost in 7 dagen en waren afwezig volledig op 14 dagen. Toen Kir 4,1 kleuringsintensiteit werd gekwantificeerd op het gebied van STV behandelde oren toonde een initial trog gevolgd door een belangrijke verschuiving (p &lt;0,05) weer naar lichtsterkteregeling 7 dagen na heptanol blootstelling (Figuur 12). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig1.jpg" /> Figuur 1. Instrument opgericht. Afbeelding van pre-operatieve set-up van de instrumentatie. Alle apparatuur moet gemakkelijk toegankelijk binnen de steriele chirurgische veld. Typische instrumentatie omvat 2 scherpe dissectie schaar, 2-3 rechte en / of pincet gebogen tip juwelier&#39;s met oor curettes, gebogen as otologische picks (later vervangen met Rosen haalt - niet getoond) en een elektro-cauterisatie unit met een tang fijne gebogen tip juwelier hoofddeksel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt = &quot;Figuur 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53.131 / 53131fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. chirurgische benodigdheden. Bijkomende leveringen voor het handhaven van de RWN milieu. Gesteriliseerd labwipe uitsparingen voor papier lont vorming (links), lonten strak gevormde papier gemaakt van gesteriliseerd lab doekjes (midden), en 4 mm katoen pellets (rechts) worden gebruikt om te vegen overtollig vocht en bloed overstromingen in de ronde venster niche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig3.jpg" /> Figuur 3. Animal hoofd houder. Afbeelding van het hoofd houder en beet blok. De gaten in het blok passen en zet de bovenste centrale snijtanden. Een klem wordt voorzichtig aangespannen over de dorsale snuit tot het dier vast te zetten. Gebruik van een kop houder is van cruciaal belang voor een succesvolle chirurgische outcome. Idealiter zou deze kunnen draaien om de rostrale-caudale as van het dier om chirurgische uitzicht op de bulla tijdens de procedure te optimaliseren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig4.jpg" /> Figuur 4. Cleidomastoideus m.. Schematische grafiek die de basis anatomie van het knaagdier cervicale musculatuur en de associatie met de externe halsader. De cleidomastoideus spier is het gemakkelijk geïdentificeerd spieren tijdens de chirurgische benadering. Vrijgave van de omhullende fascia gevolgd door posterior / dorsale terugtrekken van de spier lichaam zal leiden chirurgische dissectie naar het trommelvlies bulla (zwarte cirkel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om al te bekijken</a>Arger versie van deze figuur. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig5.jpg" /> Figuur 5. Chirurgische belichtingsgebied. Beeldt de blootstelling na dissectie door de huid en het onderhuidse vet lagen. Structurele monumenten van de nota zijn een tak van hersenzenuw XI bovenop de cleidomastoideus spier (A), de externe halsader (B), en blootgesteld oorspeekselklierweefsel (C). De hersenzenuw XI tak wordt vaak geassocieerd met een klein schip en moeten worden verdeeld voorafgaand aan de procedure. Rechts naar links op de afbeelding komt overeen met rostrale-caudale as van het dier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig6.jpg" /> Figuur 6. Het ontmaskeren van de bulla. Blootstelling van het trommelvlies bulla na het terugtrekken van de cleidomastoideus en de omliggende structuren. Opmerkelijke bezienswaardigheden zijn de cleidomastoideus spier lichaam (A) gereflecteerd naar achteren / dorsaal, de gezichtszenuw (B), en de glimmende koepel van het trommelvlies bulla periost (C). Merk ook het inbrengen van de sternomastoideus spier links caudale aspect van het trommelvlies bulla (asterisk). De aanwezigheid van de gezichtszenuw van de rug- en rostrale aspect van de bulla een kritieke mijlpaal voor werkelijke identificatie van de bulla. Rechts naar links op de afbeelding komt overeen met rostrale-caudale as van het dier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig7.jpg" /> Figuur 7. ontmaskeren ronde venster niche ik. Image beeltenis van de tympanic bulla volledig blootgesteld na dissectie van de bovenliggende periost. De pilot gat is het best geplaatst op het halverwege tussen de caudale rand van de bulla koepel en een subtiele ondoorzichtige lijn gevisualiseerd binnen de rostral aspect de bulla (die het trommelvlies). Een tweede, grenzend piloot gat kan makkelijker un-dak van de bulla bot te vergemakkelijken. Voorkoming van diepe boringen moeten worden genomen om te voorkomen dat de onderliggende stapediale slagader verwonden. De donkere, metalen voorwerp aan de onderkant van het beeld is de titanium zacht weefselhaak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig8.jpg" /> Figuur 8. Het ontmaskeren ronde venster niche II. Afgetopte trommelvlies bulla met de blootstelling van de ronde venster niche (pijl) en stapediale slagader (rode structuur1-2 mm lateraal van de niche) zoals gezien onder 20x vergroting. De nis bepaalt vaak in staat verscholen onder de scherpe hoek tussen het bulla koepel met het otische kapsel de caudale kant van de koepel. Het is noodzakelijk dat volledige visualisatie van de niche worden bereikt vóór toepassing van het ototoxische middel of wicking. Overmatige botverwijdering tijdens ontzegeld, moet ook worden vermeden als interstitiële vocht / bloed de neiging om de holte te overspoelen wanneer grote gaten zijn gemaakt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig9.jpg" /> Figuur 9. Representatieve resultaten -. Heptanol geïnduceerd gehoorverlies en herstel Mean auditieve hersenstam respons (ABR) drempels (dB SPL) uitgezet als een functie van toon pipfrequentie. Metingen worden gegroepeerd op basis van pre-exposure (zwart-Control) en post-operatieve dag (POD) 1, 7 en 14 (rood). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Cijfer werd opnieuw uitgezet van Stevens et al. 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 10" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig10.jpg" /> Figuur 10. Representatieve resultaten - Gerichte cochleaire schade na blootstelling heptanol deel I. Veranderingen in Kalium Inner Rectifier (Kir) Kanaal 4.1 kleuring binnen de stria vascularis (StV) oren behandeld met heptanol en controle oren. (A) Normale Kir 4,1 kleuring kenmerkend control oren met sterke strial cel affiniteit Kir 4,1 (groen). (B) Behandeling oor op Pod1. Grote vacuolized zones van decrversoepeld Kir 4,1 affiniteit worden gezien binnen STV (Pijlpunten), samen met een totale daling van StV Kir 4,1 kleuringsintensiteit. Kernen tegengekleurd met propidiumjodide (rood) (B). Schaal bar = 15 micrometer. Cijfer werd opnieuw uitgezet van Stevens et al, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 11" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig11.jpg" /> Figuur 11. Representatieve resultaten - Gerichte cochleaire schade na blootstelling heptanol deel II Wijzigingen in de spiraal ligament (SL) van heptanol behandelde oor in vergelijking tot oor te controleren.. (A) Normale Kir 4,1 kleuring (groen) binnen de SL typisch control oor met normaal uitziende type II spiraalvormige ligament fibrocytes (II). (B) heptanol treated oor met duidelijke daling Kir 4,1 kleuring intensiteit in het gebied van type II spiraalvormige ligament fibrocytes, nucleaire verstoring en chromosomale condens / blebs overeenstemming met apoptose (pijlen). Kernen tegengekleurd met propidiumjodide (rood). Schaal bar = 15 micrometer. Cijfer werd opnieuw uitgezet van Stevens et al, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 12" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig12.jpg" /> Figuur 12. Representatieve resultaten -. Herstel van cochleaire kleurintensiteit na blootstelling heptanol Gemiddelde relatieve luminantie van Kir 4,1 kleuring uitgezet als een functie van dagen na blootstelling. Relatieve luminantie wordt berekend Kir 4,1 reflecterende intensiteit onder confocale microscopie in heptanol treated oren genomen als percentage van dezelfde controle oren. Note POD14-28 gegevens worden samengevoegd als een enkel punt op de curve. Solid cirkels vertegenwoordigen gemiddelde waarden terwijl fout balken geven standaardafwijking van het gemiddelde. Een significant herstel van de relatieve luminantie werd aangetoond tussen POD 7 en latere data (Student&#39;s t-test p &lt;0.05, sterretje). Cijfer werd opnieuw uitgezet van Stevens et al., 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Er bestaan verschillende methoden voor het introduceren van ototoxische middelen in de slakken van diermodellen. Hier wordt een chirurgisch protocol gepresenteerd voor het toedienen van ototoxische middelen in de ronde venster nis. De procedure is betrouwbaar, creëert gerichte intra-cochleaire laesies en voorkomt mechanische schade aan de microarchitectuur. Onderzoek naar zelfherstel/regeneratie van de cochlea is mogelijk.

De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Het algemene doel van deze procedure is om een model voor letsel aan het binnenoor te creëren door ototoxische middelen strategisch direct in de nis van het ronde venster van de cochlea van de muis toe te dienen. Dit wordt bereikt door eerst de subcutane vetlaag te dissekeren en de spiermassa voorzichtig weg te trekken om het periosteum van de bulla tympanica bloot te leggen. De tweede stap is het openen van de bulla door geleidelijk botfragmenten te verwijderen totdat de nis van het ronde venster is blootgelegd.Vervolgens wordt de zichtbare vloeistof in het middenoor en de nis van het ronde venster volledig gedroogd om een optimale visualisatie van de nis van het ronde venster mogelijk te maken. De laatste stap is het vullen van de nis van het ronde venster met het geselecteerde ototoxische middel zonder de STA-pedikelarterie te beschadigen, gevolgd door de juiste herhalingen volgens de specificaties van het middel. Ten slotte worden functionele procedures, waaronder de auditieve hersenstamrespons en morfologische evaluatie, gebruikt om de selectieve preservering of degeneratie van de cochleaire microarchitectuur aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek, onze huidige maatstaf, is dat deze procedure een uitstekende blootstelling van de round window niche mogelijk maakt, waardoor een selectieve auto-toxische veroudering direct kan worden toegepast. De voordelen van deze techniek omvatten het behoud van de microarchitectuur van het binnenoor, het vermijden van systemische toxiciteit, een snelle werking, selectieve degeneratie van bepaalde cochleaire celtypen en reproduceerbare resultaten. Deze techniek kan met enkele aanpassingen worden toegepast bij andere knaagdiersoorten, waaronder ratten, cavia's en gerbils.Nu zal ik de procedure in mijn laboratorium demonstreren. Alle aspecten van het dieronderzoek zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van dedes betreffende institutionele commissie voor dierenwelzijn en -gebruik. Alle hier beschreven experimentele procedures met wervels zijn goedgekeurd onder de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Medical University of South Carolina.Nadat het dier volgens goedgekeurde procedures is geanestheseerd, dient er een preoperatieve analgetica in een dosis van 0,1 mg/kg te worden toegediend. Hier is buprenorfine gebruikt. Controleer of het dier een chirurgisch vlak van anesthesie heeft bereikt.Er mag geen reactie zijn op een knijpreflex in de teen, en de schrijfreflex moet afwezig zijn bij muizen, zoals hier te zien is. Trek 0,2 milliliters van een waterige oplossing met het geselecteerde ototoxische middel op in een tuberculinespuit van één milliliter, voorzien van een stompe 28 gauge naald van een halve inch; verwijder alle lucht uit de spuit, aangezien luchtbellen een correcte toediening van het middel kunnen verhinderen. Gebruik een elektrische trimmer om de vacht in het gebied te verwijderen, van de acefalische plooi tot aan de schoudergordel.Breid de ontharing uit van de dorsale sagittale middellijn naar de mandibulaire hoek in laterale richting. Gebruik een wegwerpscheermes om een schoon geschoren voorbereiding te waarborgen. Steriliseer de huid van het voorbereide gebied volgens de institutionele protocollen.Hier wordt Betadine afgewisseld met ethanol topisch in een cirkelvormige beweging gedurende twee minuten aangebracht. Plaats een klein warmtekussen onder het lichaam om de lichaamstemperatuur van het dier te handhaven. Bevestig de kop van het dier via een kophouder bij 36 tot 38 graden Celsius.Zet voorzichtig een kleine klem vast over de rugzijde van de snuit van het dier om deze op zijn plaats te houden. Bevestig dat de hoofdklem stevig is verbonden met het midden van een U-vormige scharnierarm. Bevestig een één centimeter brede staaf aan de linkerarm van de U om als linkerhoofdsteun te dienen, zodat de rechterzijde toegankelijk is.Zodra de muis stevig in de hoofdhouder is vastgezet, wordt deze gedraaid naar een linker zijligging. Plaats het lichaam voorzichtig op het vlakke operatieoppervlak om te garanderen dat het gedurende de procedure stabiel blijft en om overmatige torsiespanning op de cervicale wervels te voorkomen. Plaats een operatiemicroscoop die in staat is tot een vergroting van 10 x en 20 x boven het operatieveld.Bevestig dat de microscoop zijn positie handsfree kan behouden, zodat beide handen voor de chirurgie gebruikt kunnen worden terwijl er onder microscopische vergroting wordt gewerkt. Gebruik een schaar of een scalpelblad om een postauriculaire incisie van 1 tot 1,5 centimeter te maken, ongeveer zes tot acht millimeter caudaal ten opzichte van de auriculaire cephalische plooi. Vermijd diepe incisies om de onderliggende vasculaire structuren te sparen.Voer een botte dissectie uit door de subcutane vetlaag. Indien de dissectie in ventrale naar mediale richting plaatsvindt, dient men er zorg voor te dragen de vena jugularis externa te vermijden. Indien er een bloeding optreedt, gebruik dan absorbeerbare gelatine, sponsjes of wattenpellets om de bloedstroom te stelpen.Zodra de vetlaag correct is verdeeld, wordt de cervicale musculatuur blootgelegd. Een belangrijk referentiepunt is een kleine zenuwtak van hersenzenuw 11 die rond de posterieure rand van de C CTO mastoïd loopt. Om de toegang tot de pinna uit te breiden, dient een zelfhoudende retractor te worden gebruikt om de CTO mastoïditis-spiermassa voorzichtig in posterieure richting terug te trekken.Scheid voorzichtig de transparante fascia die het spierlichaam omhult. Retracteer daarnaast voorzichtig de parotisspier en de vena jugularis externa in de tegenovergestelde richting. Bij een goede retractie van het spierlichaam van de M. CTO Masto is de glanzende koepel van het periosteum van de tympanische bulla zichtbaar aan de mediale zijde van de bulla, de aanhechtingsplaats van een diepere halsspier.De sternocleidomastoideus komt in beeld. Plaats een zelfhoudende retractor om de mastoïdregio open te houden met behulp van een tweehandige techniek en gebruik voorzichtig bipolaire diathermie om het periosteum van de bulla te scheiden en het onderliggende bot bloot te leggen. Gebruik vervolgens een pincet of een otologische curette om het periosteum voorzichtig op te tillen en in perifere richting te duwen om de koepel van de bulla volledig bloot te leggen.Gebruik nu een riemaangedreven tandheelkundige boor met een taps toelopende tip van één of twee millimeter om voorzichtig een geleidingsgat van twee millimeter door het bot van de bulla te boren. Boor tussen de caudale rand van de koepel en de zichtbare ondoorzichtige lijn die over het rostrale aspect van de bulla loopt. Boor vervolgens voorzichtig een tweede geleidingsgat in de nabijheid. Om het openmaken van het bot van de bulla te vergemakkelijken, wordt het bot van de bulla met een chirurgische pincet in dorsale en caudale richting verwijderd.Zorg ervoor dat de EDL-slagader, die zich direct onder de bullock-cap bevindt, niet wordt doorboord. Minimaliseer de hoeveelheid verwijderde botmassa om overmatige vloeistofinstroom in het middenoor te voorkomen vóór het aanbrengen van het middel. Gebruik een papieren lont om alle zichtbare vloeistof in het middenoor en de nis van het ronde venster te verwijderen totdat het droge bot zichtbaar is.Deze stap is cruciaal voor het succes van het protocol. Breng, terwijl u het gebied onder maximale vergroting bekijkt, met een fijnmazige naald op een tuberculinespuit van één milliliter één druppel ototoxisch middel direct aan in de nis van het ronde venster, zodat deze volledig wordt gevuld. Laat het middel 10 minuten in de nis van het ronde venster rusten.Houd in de beginfase nauwlettend in de gaten of een kleine lichtreflectie aan de basis van de droge nis wordt vervangen door een doffe en wazige vloeistofmeniscus. Dit geeft aan dat de nis correct wordt gevuld. Wanneer er precies 10 minuten zijn verstreken, dient het middel volledig te worden weggewiekt en te worden vervangen door een nieuwe applicatie van hetzelfde middel.Het aantal applicaties hangt af van het gebruikte middel. De blootstellingstijd ligt gewoonlijk tussen de 30 en 60 minuten. Laat na de laatste applicatie de bull onafgedekt en gebruik een pincet om het zachte weefsel over de chirurgische plaats te sluiten.Gebruik 4-0 niet-resorbeerbare monofilament hechtmateriaal om de huid over de chirurgische plaats te sluiten. Laat het dier herstellen van de anesthesie in een schone thuiskooi, die moet zijn voorzien van nestmateriaal en zacht voedsel. Controleer de dieren dagelijks tot aan de opoffering en het oogsten van het cochleaire weefsel van volwassen C-B-A-C-A-J.Muizen van beide geslachten werden blootgesteld aan het ototoxische middel heptanol. De diffusie via het ronde venster. Significante stijgingen in de BR-drempels werden waargenomen bij heptanol-behandelde muizen van postoperatieve dag 1 tot dag 14, in vergelijking met controledieren die een sham-operatie ondergingen waarbij zoutoplossing werd toegediend in plaats van heptanol.Ethanol vertoonde geen significante drempelverschuivingen bij enige van de geteste frequenties. Immunokleuring tegen een naar binnen rectifierend kaliumkanaal, weergegeven in het groen, diende als indirecte methode om de beschadiging en het herstel van cochleaire structuren te visualiseren. De kleurintensiteit was merkelijk afgenomen binnen theria vais.Op de eerste postoperatieve dag was bij de nucleaire tegenkleuring, weergegeven in rood, ook bewijs te zien van verstoorde nucleaire integriteit en chromosomale condensatie, wat typerend is voor cellulaire apoptose. Wanneer de kleurintensiteit van de kaliumkanalen in de gebieden van de stratis-behandelde oren werd gekwantificeerd, werd een initiële daling waargenomen, gevolgd door een significante verschuiving terug naar de controlintensiteit zeven dagen na hept-blootstelling, waarna het herstel zich voortzette. Zodra men hierin bekwaam is, kan deze procedure binnen 30 tot 60 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd.Het is belangrijk om te onthouden dat aanvullende blootstelling of het bijvullen kan helpen om ongewenste verdunning van het autotoxische middel door bloedcondensatie of interstitiële vloeistof te voorkomen. Deze aanpak dient echter met voorzichtigheid te worden gehanteerd, aangezien het de kans vergroot op het onbedoeld beschadigen van de cochleaire arterie of het introduceren van interstitiële vloeistof in de nis van het ronde venster. Deze minimaal invasieve techniek maakt gedetailleerde studie van delicate biochemische processen mogelijk en is essentieel geweest voor het verder brengen van ons onderzoek naar het begrijpen van het regeneratieve potentieel van de cochlea in vivo.

the-mouse-round-window-approach-for-ototoxic-agent-delivery-rapid

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Kozin, E. D., et.al. Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates virus-mediated gene transfer into the mouse dorsal cochlear nucleus (DCN) to enable light-induced auditory stimulation. A viral vector encoding opsin, a light-sensitive ion channel, is injected into the DCN following a craniotomy and cerebellar aspiration for direct access. The expressed opsins allow neurons to be...

Virus-Mediated Gene Transfer Into the Mouse Dorsal Cochlear Nucleus for Light-Induced Auditory Stimulation

Source: Akil, O., et al., Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure of delivering a therapeutic gene into the inner ear of a mouse pup with genetically induced hearing loss. Using an adeno-associated viral (AAV) vector, the gene is injected through the round window membrane, allowing viral particles to enter hair cells, restore glutamate transporter production, and...

Viral Vector-Based Gene Therapy for Hearing Restoration in a Mouse Model

De beschreven postauriculaire chirurgische benadering maakt een snelle en directe toediening mogelijk in de scala tympani van de muizencochlea, terwijl bloedverlies en sterfte bij dieren wordt geminimaliseerd. Deze methode kan worden gebruikt voor cochleaire therapie met behulp van moleculaire, farmacologische en virale toediening aan postnatale muizen via het ronde venmembraan.

Chirurgische methode voor viraal gemedieerde Gene Levering aan de Mouse Inner Ear door het ronde venster membraan

Het doel van dit protocol is om een chirurgische benadering te schetsen om directe toegang te bieden tot de dorsale cochleare nucleus in een muismodel.

Directe visualisatie van het Muizen Dorsale Cochlear Nucleus voor optogenetische Stimulatie van de Auditieve Pathway

Twee microchirurgiebenaderingen voor lokale medicijntoediening aan het binnenoor worden hier beschreven en vergeleken in termen van impact op gehoorparameters, cochleaire cytoarchitectuur en expressie van inflammatoire markers.

Een vergelijkende studie van Drug Delivery Methoden Gericht op de Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Het doel van dit protocol is om de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten aan te tonen. De techniek kan gebruikt worden als een in vitro screening tool bij het horen onderzoek.

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

Presenteren we een techniek gelokaliseerde beheer van drugs via de trans-tympanic route in het slakkenhuis. Drug bezorging via deze route zou niet interfereren met de anti-kanker werkzaamheid van het chemotherapeutische geneesmiddelen zoals cisplatine.

Trans-Tympanic Drug Delivery voor de behandeling van ototoxiciteit

Hier beschrijven we canalostomy procedure waarmee lokale drug levering tot de inner oren van volwassen en neonatale muizen door het semicircular kanaal met minimale schade aan gehoorbescherming en vestibulaire functie. Deze methode kan worden gebruikt om te enten virale vectoren, farmaceutische producten en kleine moleculen in het binnenoor muis.

Canalostomy als een chirurgische benadering van lokale Drug Delivery tot de Inner oren van volwassen en neonatale muizen

Dierlijke modellen van cochleaire implantaten kunnen vooraf kennis van de technologische grondslagen voor de behandeling van permanente perceptief gehoorverlies met elektrische stimulatie. Deze studie geeft een chirurgische protocol voor acute oorverdovend en cochleaire implantatie van een elektrodenserie in muizen, alsmede de beoordeling van de functionele met auditieve brainstem response.

Cochleair implantaatchirurgie en elektrisch opgeroepen auditieve Brainstem Response opnamen in C57BL/6 muizen

Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.

Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

Hier presenteren we een protocol voor een muismodel van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies (NIHL). Om NIHL te induceren, ontwikkelden we een nieuw en eenvoudig apparaat met golfkarton, een rattenvangkooi en een luidspreker. Auditieve hersenstamrespons en immunofluorescentie beeldvorming werden gebruikt om respectievelijk de gehoorfunctie en de buitenste haarcelbeschadiging te beoordelen.

Gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen

Leer een chirurgische techniek voor het toedienen van ototoxische middelen via het ronde venster van de muiscochlea. Deze methode behoudt de cochleaire microarchitectuur en maakt gerichte studies naar cochleaire celdegeneratie en regeneratie mogelijk.

De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie (Video) | JoVE Journal

De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie

Meer video's verkennen