De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie

Het algemene doel van deze procedure is om een model voor letsel aan het binnenoor te creëren door ototoxische middelen strategisch direct in de nis van het ronde venster van de cochlea van de muis toe te dienen. Dit wordt bereikt door eerst de subcutane vetlaag te dissekeren en de spiermassa voorzichtig weg te trekken om het periosteum van de bulla tympanica bloot te leggen. De tweede stap is het openen van de bulla door geleidelijk botfragmenten te verwijderen totdat de nis van het ronde venster is blootgelegd.

Vervolgens wordt de zichtbare vloeistof in het middenoor en de nis van het ronde venster volledig gedroogd om een optimale visualisatie van de nis van het ronde venster mogelijk te maken. De laatste stap is het vullen van de nis van het ronde venster met het geselecteerde ototoxische middel zonder de STA-pedikelarterie te beschadigen, gevolgd door de juiste herhalingen volgens de specificaties van het middel. Ten slotte worden functionele procedures, waaronder de auditieve hersenstamrespons en morfologische evaluatie, gebruikt om de selectieve preservering of degeneratie van de cochleaire microarchitectuur aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek, onze huidige maatstaf, is dat deze procedure een uitstekende blootstelling van de round window niche mogelijk maakt, waardoor een selectieve auto-toxische veroudering direct kan worden toegepast. De voordelen van deze techniek omvatten het behoud van de microarchitectuur van het binnenoor, het vermijden van systemische toxiciteit, een snelle werking, selectieve degeneratie van bepaalde cochleaire celtypen en reproduceerbare resultaten. Deze techniek kan met enkele aanpassingen worden toegepast bij andere knaagdiersoorten, waaronder ratten, cavia's en gerbils.

Nu zal ik de procedure in mijn laboratorium demonstreren. Alle aspecten van het dieronderzoek zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van dedes betreffende institutionele commissie voor dierenwelzijn en -gebruik. Alle hier beschreven experimentele procedures met wervels zijn goedgekeurd onder de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Medical University of South Carolina.

Nadat het dier volgens goedgekeurde procedures is geanestheseerd, dient er een preoperatieve analgetica in een dosis van 0,1 mg/kg te worden toegediend. Hier is buprenorfine gebruikt. Controleer of het dier een chirurgisch vlak van anesthesie heeft bereikt.

Er mag geen reactie zijn op een knijpreflex in de teen, en de schrijfreflex moet afwezig zijn bij muizen, zoals hier te zien is. Trek 0,2 milliliters van een waterige oplossing met het geselecteerde ototoxische middel op in een tuberculinespuit van één milliliter, voorzien van een stompe 28 gauge naald van een halve inch; verwijder alle lucht uit de spuit, aangezien luchtbellen een correcte toediening van het middel kunnen verhinderen. Gebruik een elektrische trimmer om de vacht in het gebied te verwijderen, van de acefalische plooi tot aan de schoudergordel.

Breid de ontharing uit van de dorsale sagittale middellijn naar de mandibulaire hoek in laterale richting. Gebruik een wegwerpscheermes om een schoon geschoren voorbereiding te waarborgen. Steriliseer de huid van het voorbereide gebied volgens de institutionele protocollen.

Hier wordt Betadine afgewisseld met ethanol topisch in een cirkelvormige beweging gedurende twee minuten aangebracht. Plaats een klein warmtekussen onder het lichaam om de lichaamstemperatuur van het dier te handhaven. Bevestig de kop van het dier via een kophouder bij 36 tot 38 graden Celsius.

Zet voorzichtig een kleine klem vast over de rugzijde van de snuit van het dier om deze op zijn plaats te houden. Bevestig dat de hoofdklem stevig is verbonden met het midden van een U-vormige scharnierarm. Bevestig een één centimeter brede staaf aan de linkerarm van de U om als linkerhoofdsteun te dienen, zodat de rechterzijde toegankelijk is.

Zodra de muis stevig in de hoofdhouder is vastgezet, wordt deze gedraaid naar een linker zijligging. Plaats het lichaam voorzichtig op het vlakke operatieoppervlak om te garanderen dat het gedurende de procedure stabiel blijft en om overmatige torsiespanning op de cervicale wervels te voorkomen. Plaats een operatiemicroscoop die in staat is tot een vergroting van 10 x en 20 x boven het operatieveld.

Bevestig dat de microscoop zijn positie handsfree kan behouden, zodat beide handen voor de chirurgie gebruikt kunnen worden terwijl er onder microscopische vergroting wordt gewerkt. Gebruik een schaar of een scalpelblad om een postauriculaire incisie van 1 tot 1,5 centimeter te maken, ongeveer zes tot acht millimeter caudaal ten opzichte van de auriculaire cephalische plooi. Vermijd diepe incisies om de onderliggende vasculaire structuren te sparen.

Voer een botte dissectie uit door de subcutane vetlaag. Indien de dissectie in ventrale naar mediale richting plaatsvindt, dient men er zorg voor te dragen de vena jugularis externa te vermijden. Indien er een bloeding optreedt, gebruik dan absorbeerbare gelatine, sponsjes of wattenpellets om de bloedstroom te stelpen.

Zodra de vetlaag correct is verdeeld, wordt de cervicale musculatuur blootgelegd. Een belangrijk referentiepunt is een kleine zenuwtak van hersenzenuw 11 die rond de posterieure rand van de C CTO mastoïd loopt. Om de toegang tot de pinna uit te breiden, dient een zelfhoudende retractor te worden gebruikt om de CTO mastoïditis-spiermassa voorzichtig in posterieure richting terug te trekken.

Scheid voorzichtig de transparante fascia die het spierlichaam omhult. Retracteer daarnaast voorzichtig de parotisspier en de vena jugularis externa in de tegenovergestelde richting. Bij een goede retractie van het spierlichaam van de M. CTO Masto is de glanzende koepel van het periosteum van de tympanische bulla zichtbaar aan de mediale zijde van de bulla, de aanhechtingsplaats van een diepere halsspier.

De sternocleidomastoideus komt in beeld. Plaats een zelfhoudende retractor om de mastoïdregio open te houden met behulp van een tweehandige techniek en gebruik voorzichtig bipolaire diathermie om het periosteum van de bulla te scheiden en het onderliggende bot bloot te leggen. Gebruik vervolgens een pincet of een otologische curette om het periosteum voorzichtig op te tillen en in perifere richting te duwen om de koepel van de bulla volledig bloot te leggen.

Gebruik nu een riemaangedreven tandheelkundige boor met een taps toelopende tip van één of twee millimeter om voorzichtig een geleidingsgat van twee millimeter door het bot van de bulla te boren. Boor tussen de caudale rand van de koepel en de zichtbare ondoorzichtige lijn die over het rostrale aspect van de bulla loopt. Boor vervolgens voorzichtig een tweede geleidingsgat in de nabijheid. Om het openmaken van het bot van de bulla te vergemakkelijken, wordt het bot van de bulla met een chirurgische pincet in dorsale en caudale richting verwijderd.

Zorg ervoor dat de EDL-slagader, die zich direct onder de bullock-cap bevindt, niet wordt doorboord. Minimaliseer de hoeveelheid verwijderde botmassa om overmatige vloeistofinstroom in het middenoor te voorkomen vóór het aanbrengen van het middel. Gebruik een papieren lont om alle zichtbare vloeistof in het middenoor en de nis van het ronde venster te verwijderen totdat het droge bot zichtbaar is.

Deze stap is cruciaal voor het succes van het protocol. Breng, terwijl u het gebied onder maximale vergroting bekijkt, met een fijnmazige naald op een tuberculinespuit van één milliliter één druppel ototoxisch middel direct aan in de nis van het ronde venster, zodat deze volledig wordt gevuld. Laat het middel 10 minuten in de nis van het ronde venster rusten.

Houd in de beginfase nauwlettend in de gaten of een kleine lichtreflectie aan de basis van de droge nis wordt vervangen door een doffe en wazige vloeistofmeniscus. Dit geeft aan dat de nis correct wordt gevuld. Wanneer er precies 10 minuten zijn verstreken, dient het middel volledig te worden weggewiekt en te worden vervangen door een nieuwe applicatie van hetzelfde middel.

Het aantal applicaties hangt af van het gebruikte middel. De blootstellingstijd ligt gewoonlijk tussen de 30 en 60 minuten. Laat na de laatste applicatie de bull onafgedekt en gebruik een pincet om het zachte weefsel over de chirurgische plaats te sluiten.

Gebruik 4-0 niet-resorbeerbare monofilament hechtmateriaal om de huid over de chirurgische plaats te sluiten. Laat het dier herstellen van de anesthesie in een schone thuiskooi, die moet zijn voorzien van nestmateriaal en zacht voedsel. Controleer de dieren dagelijks tot aan de opoffering en het oogsten van het cochleaire weefsel van volwassen C-B-A-C-A-J.

Muizen van beide geslachten werden blootgesteld aan het ototoxische middel heptanol. De diffusie via het ronde venster. Significante stijgingen in de BR-drempels werden waargenomen bij heptanol-behandelde muizen van postoperatieve dag 1 tot dag 14, in vergelijking met controledieren die een sham-operatie ondergingen waarbij zoutoplossing werd toegediend in plaats van heptanol.

Ethanol vertoonde geen significante drempelverschuivingen bij enige van de geteste frequenties. Immunokleuring tegen een naar binnen rectifierend kaliumkanaal, weergegeven in het groen, diende als indirecte methode om de beschadiging en het herstel van cochleaire structuren te visualiseren. De kleurintensiteit was merkelijk afgenomen binnen theria vais.

Op de eerste postoperatieve dag was bij de nucleaire tegenkleuring, weergegeven in rood, ook bewijs te zien van verstoorde nucleaire integriteit en chromosomale condensatie, wat typerend is voor cellulaire apoptose. Wanneer de kleurintensiteit van de kaliumkanalen in de gebieden van de stratis-behandelde oren werd gekwantificeerd, werd een initiële daling waargenomen, gevolgd door een significante verschuiving terug naar de controlintensiteit zeven dagen na hept-blootstelling, waarna het herstel zich voortzette. Zodra men hierin bekwaam is, kan deze procedure binnen 30 tot 60 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd.

Het is belangrijk om te onthouden dat aanvullende blootstelling of het bijvullen kan helpen om ongewenste verdunning van het autotoxische middel door bloedcondensatie of interstitiële vloeistof te voorkomen. Deze aanpak dient echter met voorzichtigheid te worden gehanteerd, aangezien het de kans vergroot op het onbedoeld beschadigen van de cochleaire arterie of het introduceren van interstitiële vloeistof in de nis van het ronde venster. Deze minimaal invasieve techniek maakt gedetailleerde studie van delicate biochemische processen mogelijk en is essentieel geweest voor het verder brengen van ons onderzoek naar het begrijpen van het regeneratieve potentieel van de cochlea in vivo.