Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening
August 29th, 2015
Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.
Het algemene doel van deze procedure is om kinasen te identificeren die een substraat van belang fosforyliseren met behulp van methoden voor grootschalige screening. Dit wordt bereikt door eerst cellen te transfecteren met plasmiden die kinase FU tot glutathion als transferase of GST tot expressie brengen. De tweede stap is het uitvoeren van een GST-kinase pulldown.
Vervolgens worden de monsters in gels geladen, die vervolgens worden gelopen en gekleurd met kumasi briljant blauw kleurstof. De laatste stap is het drogen van de gels en het blootstellen aan autoradiografiefilm. Uiteindelijk is het door het ontwikkelen en interpreteren van de resulterende films mogelijk om kinase-substraatparen te identificeren, aangezien elke baan representatief is voor een afzonderlijke kinase-assay.
Bestaande methoden voor het identificeren van een kinase voor een bekend gefosforyleerd substraat omvatten het gebruik van bio-informaticabenaderingen om te zoeken naar een consensussite in het substraat, het detecteren van complexen tussen kinase en substraten met behulp van biochemische technieken en een trial-and-error-benadering, en het zoeken naar conte-consensussubstraten op basis van hun bekende biologische functie. Deze benaderingen zijn tijdrovend en leiden niet altijd tot succes. Onze aanpak maakt snelle identificatie van kinase-substraatparen mogelijk op basis van functionele resultaten.
Toen we voor het eerst het idee hadden voor deze methode, waren we bezorgd dat er in vitro onvoldoende specificiteit zou zijn. Het blijkt echter dat de substraatspecificiteit uitstekend is en we vinden vaak dat alleen kinasen van hetzelfde gezin in staat zijn om een bepaald substraat in de screening te fosforyliseren. Dit is vooral duidelijk wanneer we multiplexen met meerdere substraten in elke screening, wat aantoont dat de procedure Courtney, een technicus uit mijn laboratorium, zal zijn. Begin de procedure met de bereiding van reagentia, platen en cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Als platen met kinaseplasmiden zijn ingevroren, ontdooi ze dan op kamertemperatuur en centrifugeer gedurende drie minuten bij 1900 keer G om vocht aan de bodem van de putjes te verzamelen. Meng 8,6 milliliter gereduceerd serummedium met 312,7 microliter vetgedragen transfectiereagens en laat het mengsel vijf minuten in elke put staan. Van de 96-wel platen die de kinaseplasmiden bevatten, 10 microliter van het gereduceerd serummedium.
Gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor klein volume en voeg vervolgens 10 microliter van de gereduceerd serummedium transfectiereagensmix toe per putje, gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor klein volume en laat de plaat 20 tot 45 minuten staan. Resuspenseer vervolgens 2 93 T-cellen bij 0,75 miljoen cellen per milliliter in 80 milliliter volledig delcos-gemodificeerd medium of DMEM bij 100 microliter van de celsuspensie per putje. Gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor standaard volume, controleer de putjes onder een microscoop op uniforme celverdeling voordat u de plaat terugbrengt naar een incubator van 37 graden Celsius gedurende 24 uur.
Om het GST-kinase pulldown-experiment te beginnen. Maak een oplossing van vier millimolar per vanadate door 60 microliter 0,2 molair natriumvanadate te mengen met 540 microliter water in een tweede buis gemengd 2,7 microliter 30% peroxide en 1,4 milliliter fosfaatgebufferd zout of PBS. Voeg de twee oplossingen samen en laat het mengsel 15 minuten staan voor gebruik.
Gebruik een multikanaals pipette om twee microliter 0,25 molair calciumchloride in elke put te doseren, gevolgd door 2,5 microliter van de bewezen date-oplossing. Incubeer elke plaat gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en plaats vervolgens op ijs, houd de platen op ijs. Verwijder het medium uit elke put, gebruik onmiddellijk een vacuüm bij 50 microliter per putje van ijskoud lysisbuffer.
Gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van de standaardcassette, laat de plaat 30 minuten op ijs staan om te licentie. Nadat de platen gedurende drie minuten bij 1900 keer G op vier graden Celsius zijn gecentrifugeerd, schraap de cellen van elke put met een multikanaals pipette en breng alle inhoud over naar geschikt gelabelde vbo. 96-wel platen, draai de platen gedurende 10 minuten bij 1900 keer G op vier graden Celsius tijdens het draaien, vul glutathion-gecoate platen met 100 microliter per putje van ijskoud lysisbuffer.
Als spoeling, houd de platen op ijs. Na centrifugatie van de bodemplaten, draai de glutathionplaten om boven een spoelbak om de lysisbuffer uit te schudden en dep op een papieren handdoek. Breng de lysisbuffer van de V-bodemplaten over naar de glutathionplaten door de plaat te kantelen en een multikanaals pipette te gebruiken, wees voorzichtig om de pellet op de bodem niet te verstoren.
Dek vervolgens de platen af en laat ze minimaal twee uur op ijs staan. Om dicht bij het einde van de tweede bindingsstap te binden, bereid een radioactiviteitswerkstation voor en zorg ervoor dat de nodige veiligheidsmaatregelen voor radioactief werk zijn genomen. Stel de hybridisatieoven in op 30 graden Celsius.
Draai de glutathionplaten om boven een spoelbak om de lysisbuffer uit te schudden en dep op een papieren handdoek. Spoel de putjes drie keer met 100 microliter lysisbuffer zonder PMSF. Laat de putjes niet droog zitten.
Houd ze in de spoeling totdat u klaar bent om verder te gaan. Bereid vervolgens 55 milliliter een X-kinasebuffer of een x kb voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 50 microliter een x kb toe aan elke put van de plaat met behulp van een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor standaard volume.
Bereid vervolgens oplossing A voor door een oplossing te maken die het substraat van belang en myelinebasiseiwit of MVP bevat, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol een voor een. Draai de platen om boven een spoelbak om de ene XKB-spoeling te verwijderen, dep op een papieren handdoek en voeg onmiddellijk 30 microliter oplossing A toe.Gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor klein volume. Houd de platen op ijs.
Bereid vervolgens oplossing B voor in het radioactiviteitswerkgeb
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een hoogdoorvoer screeningsprotocol dat is ontworpen om kinasen te identificeren die specifieke substraten fosforyleren. De methode maakt gebruik van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen, wat een snelle analyse van kinase-activiteit mogelijk maakt.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celsignalering
- Eiwitfosforylering
- Hoogdoorvoer screening
Achtergrond
- Eiwitfosforylering is cruciaal voor cellulaire reacties op externe signalen.
- Het identificeren van kinase-substraatinteracties is belangrijk voor het begrijpen van signaalroutes.
- Hoogdoorvoer methoden kunnen de ontdekking van deze interacties versnellen.
- Deze studie richt zich op een systematische aanpak om te screenen op actieve kinasen.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor het identificeren van kinasen die specifieke substraten fosforyleren.
- Om hoogdoorvoer screening te gebruiken voor snelle analyse.
- Om het begrip van kinase-activiteit in cellulaire processen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Transfectie van cellen met plasmiden die kinasen expresseren gefuseerd met glutathion S-transferase (GST).
- Uitvoeren van GST kinase pulldown om kinase-substraatcomplexen te isoleren.
- Beladen van monsters in gels voor elektroforese.
- Vlekken van gels met Coomassie Brilliant Blue kleurstof en analyse via autoradiografie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van kinase-substraatparen door het ontwikkelde protocol.
- Demonstratie van de efficiëntie van hoogdoorvoer screening methoden.
- Visualisatie van kinase-activiteit door middel van gelelektroforese.
- Interpretatie van autoradiografiefilms om specifieke interacties te bepalen.
Conclusies
- Het protocol identificeert effectief kinasen die substraten van belang fosforyleren.
- Hoogdoorvoer screening is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van kinase-activiteit.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende substraten om kinasefuncties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High throughput identification of kinase-substrate pairs is critical for deconvoluting cellular signaling networks and advancing target validation in early drug discovery. This platform enables rapid, functional mapping of kinase activity, supporting mechanistic de-risking and prioritization of signaling pathways relevant to disease biology. The approach enhances predictive confidence at the discovery inflection point, informing portfolio decisions and downstream assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional interrogation of kinase-substrate relationships for pathway clarification.
- Supports biological de-risking by distinguishing specific kinase activities among large enzyme families.
- Facilitates rapid triage of candidate targets based on substrate specificity and signaling relevance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated kinase-substrate systems for downstream screening and compound profiling workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via autoradiography and gel-based readouts.
- Enables scalable, multiplexed screening of kinase libraries against diverse substrates.
- Supports robust assay standardization for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns kinase-substrate mapping with disease-relevant signaling pathways for translational continuity.
- Provides mechanistic evidence to inform preclinical model selection and biomarker strategies.
- Reduces risk of late-stage biological failure by confirming pathway engagement early.
Pipeline & Workflow Integration
This high throughput screening method integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging target validation with assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway mapping by directly linking kinases to their substrates.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible kinase-substrate pairs for compound screening platforms.
- Analytics: Provides quantitative autoradiography and gel-based outputs for comparative analysis of kinase activity.
- Translational Research: Connects in vitro kinase specificity to disease-relevant cellular contexts for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform adaptable to new substrates and kinase libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes kinase-substrate identification with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and reduces late-stage biological attrition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in kinase biology, protein purification, and radiolabel handling.
- Demands access to automated liquid handling, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions and controls for reproducibility.
- Adaptation to different substrates or kinase families may require protocol optimization.
- Background phosphorylation and in vitro specificity must be interpreted with in vivo validation strategies.
