Name: Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer hoe je kinase-substraatparen identificeert met high throughput screening. Deze methode gebruikt GST-pulldown en autoradiografie om fosforyleringsactiviteit snel te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NSERC subsidie 386634. Wij willen de leden van de Screaton Lab bedanken voor nuttig discussies.

1. Voorbereiding van de reagentia, platen, en cellen <ol><li> Voeg 500 ml lysis buffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glycerofosfaat, 5% glycerol. Bewaar bij 4 ° C. Onmiddellijk vóór gebruik, voeg 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), en 1 mM natriumvanadaat. Na deze stap wordt PMSF niet vereist in spoelbuffer. </li><li> Maak 20 ml van 10x kinase buffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glycerofosfaat (FW 216), 2 mM natriumvanadaat. Aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C. Onmiddellijk vóór gebruik, voeg 5 mM DTT. </li><li> Maak 20 ml van 10x M-ATP buffer: 300 uM adenosine trifosfaat (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mM MnCl 2. Aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Voeg 100 ml 2x natriumdodecylsulfaat (SDS) lysis buffer: 1,5 g Tris-base, 20 ml glycerol, 30 ml H2O Lossen en de pH op 6,8 met HCl. Voeg 40ml 10% SDS, het volume aanpassen tot 100 ml. Voeg 25 mg broomfenolblauw. </li><li> Spot 4 pl 25 ng / pl zoogdierlijke expressieplasmide dat codeert voor een GST-kinase 14 per putje in sets van 96 well platen en platen label dienovereenkomstig. Verbinding en bevriezen platen bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> 1-2 dagen voor transfectie, kweek HEK293T cellen in compleet Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica in een 37 ° C incubator aangevuld met CO 2 (laatste 5%). Passage met trypsine en niet toestaan ​​dat de voorraad tot&gt; 80% confluent worden tijdens expansie. Een minimum van 6 x 10 7 cellen voor het scherm (ongeveer 3 x 15 cm schalen van HEK293T cellen bij 80% confluentie). </li></ol> 2. Transfectie Opmerking: zie figuur 1 een stroomdiagram van complete protocol. <ol><li> Als platen met kinase plasmiden zijn bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur eennd centrifugeren bij 1900 xg gedurende 3 min om eventueel vocht te verzamelen op de bodem van putjes. </li><li> Meng 8,6 ml gereduceerd serum medium (bijv OPTI-MEM) met 312,7 pl lipide-gebaseerde transfectie reagens. Laat zitten voor 5 min. </li><li> Voeg 10 ul gereduceerd serum medium aan elk putje met behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een klein volume cassette. </li><li> Voeg 10 ul per putje van de gereduceerde serum medium / transfectiereagens mengsel uit stap 2.2 onder toepassing van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een klein volume cassette. Laat zitten voor 20 tot 45 min. </li><li> Resuspendeer 293T cellen op 7,5 x 10 5 cellen / ml in 80 ml ​​compleet DMEM. Voeg 100 ul celsuspensie (bijvoorbeeld 7,5 x 10 4 cellen) per putje met behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een standaardvolume cassette. </li><li> Controle putjes onder microscoop voor gelijkmatige celverdeling en terugkeren naar incubator gedurende 24 uur. </li></ol> 3. GST-kinase Pulldown <ol><li> Maak fresh: 4 mM pervanadaat oplossing door het mengen van 60 ui van 0,2 M natrium vanadaat met 540 ui H2O In een tweede buis mix 2,7 pl 30% peroxide en 1,4 ml PBS. Voeg de twee oplossingen bij elkaar en laat zitten voor 15 min voor gebruik. </li><li> Met behulp van een multichannel pipet (geen geautomatiseerde vloeistof dispenser gebruiken omdat dit zorgt voor te veel turbulentie in de put) afzien 2 pl 0,25 M CaCl2 in elk putje, gevolgd door 2,5 pi van het bereid in stap 3.1 pervanadaat. Incubeer elke plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten en plaats op ijs. </li><li> Bereid 35 ml lysisbuffer door het toevoegen van DTT, PMSF en natriumvanadaat zoals aangegeven in artikel 1 (Voorbereiding van de reagentia). </li><li> Houden platen op ijs, verwijder medium uit elk putje met een stofzuiger aspirator. Voeg onmiddellijk 50 ul / putje ijskoude lysisbuffer behulp van een automatische vloeistof dispenser uitgerust met een standaard cassette. Laat zitten 30 min op ijs Lyse (optioneel: kan hier indien nodig stoppen door verzegeling plate en bewaren bij -80 ° C. Om door te gaan, dooi platen op ijs). </li><li> Spin platen bij 1900 g gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Schrapen cellen van elk putje met behulp van een multichannel pipet en de overdracht van alle inhoud op de juiste wijze gemerkt V-bodem met 96 putjes. Spin platen bij 1900 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Tijdens rotatie, vul glutathion beklede platen (één voor elke 96-well plaat) met 100 ul / putje ijskoude lysisbuffer (zonder PMSF) als spoeling. Houd platen op ijs. </li><li> Verwijder V-bodemplaten van de centrifuge. Een voor een, keren de glutathion platen over een wastafel te schudden uit de lysisbuffer en vlek op een papieren handdoek. Transfer lysisbuffer van de V-bodemplaten met glutathion platen door het kantelen van de plaat en met een multichannel pipet voorzichtig om de pellet te verstoren onderaan. Afdekplaten en laat op ijs voor minimaal 2 uur te binden. </li><li> Dicht bij het einde van de 2 uur binden stap, bereiden een radioactiviteit werkstation, zodat tHij nodige voorzorgsmaatregelen zijn getroffen voor radioactief werk. Stel hybridisatie oven tot 30 ° C. </li><li> Bereid 200 ml lysisbuffer door toevoeging van DTT en natriumvanadaat zoals aangegeven in hoofdstuk 1. PMSF is niet vereist in dit stadium. </li><li> Keer de glutathion platen over een wastafel te schudden uit de lysisbuffer en dep op een papieren handdoek. Spoel putjes 3x met 100 ul lysisbuffer (zonder PMSF). Niet laten putten zitten droog - bewaar ze op spoelen tot klaar om verder te gaan. </li><li> Maak 55 ml van 1 x kinasebuffer (KB) door verdunning van de 10x voorraad en het toevoegen van DTT zoals aangegeven in hoofdstuk 1. Spoel platen eenmaal met 50 pl 1x KB behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een standaardvolume cassette. Vertrekken 1x KB in putten tot oplossing A is klaar: <ol><li> Bereid een oplossing door toevoeging van 500 tot 530 ug van het substraat plaats, 500 ug myeline basisch eiwit (MBP), 2,65 ml 10 x KB, 13,25 pl 1 M DTT en H 2 O tot 15,9 ml. </li></ol></li&gt; <li> Een voor een, keren de borden boven de gootsteen te spoelen 1x KB verwijderen vlek op keukenpapier en voeg onmiddellijk 30 ul van Solution A behulp van een geautomatiseerd vloeistof dispenser uitgerust met een klein volume cassette. Houd platen op ijs. </li><li> Bereid Oplossing B in de radioactiviteit werkgebied door het toevoegen van 2,5 ml 10x M-ATP, 500 uCi gamma 32P ATP en H 2 O tot 10 ml. <ol><li> Voeg 20 ul van Solution B per putje met behulp van een repeater pipet die helpt bij het mengen als gevolg van het uitwerpen van kracht. Dek af en incubeer bij 30 ° C hybridisatie oven 30 min. </li></ol></li><li> Na 30 min, overdrachtsplaten naar ijs. Voeg 50 ul van 2 x SDS lysis buffer aan elk putje met een multichannel pipet. Kan gaan op dit punt naar de volgende stap, of sluit de platen met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C tot handig. </li></ol> 4. Running, kleuring, en drogen Gels Let op: Alle werkzaamheden moeten in een gebied designa worden uitgevoerdted voor radioactiviteit. <ol><li> Schakel hybridisatie oven ingesteld op 85 ° C. Ontdooi platen bij kamertemperatuur. Eenmaal heeft oventemperatuur, overdracht platen oven en incubeer gedurende 10 minuten om monsters denatureren bereikt. </li><li> Load 26-goed pre-cast gels met 15 pi van elke reactie met behulp van een multichannel pipet om meerdere putten te vullen in een keer. Zorg moet worden genomen dat alle tips uitgelijnd met bijbehorende goed voor het toevoegen van samples. Draaien gel op 150 V. Laat niet de tracking kleurstof (blauwe lijn) run off van de bodem van de gel, omdat dit bevat de niet opgenomen ATP. </li><li> Demonteer de gels en snijd de niet opgenomen ATP (blauwe lijn) met een scalpel of een rechte rand als het de films zal overbelichten. Plaats de gels in geëtiketteerde containers en bedek met Coomassie vlek gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder de Coomassie vlek, kort spoel de gels met water en voeg destain oplossing. Destain de gelen tot de eiwitten zichtbaar. Een band voor MBP en een band voor het substraat moetzichtbaar voor elk monster. </li><li> Drogen de gels: <ol><li> Snijd een groot vel papier filter en plaats het op de droger. </li><li> Bevochtig een cellofaan blad in gedestilleerd water tot het glad en kreukvrij, en plaats deze op de top van het papier. </li><li> Leg de gels op de top van het cellofaan vel, het maken van een nota van de orde van gels. Bevochtig een tweede vel cellofaan en bovenop de gels. </li><li> Uitrollen alle luchtbellen (een plaat afdichting roller werkt goed voor dit) voor een mooie uniform oppervlak. Sluit de flap, zet het vacuüm en droog de gels 3 uur bij 80 ° C. </li></ol></li><li> Zodra gels zijn droog, stel ze niet bloot aan XAR film met behulp van een scherm om het signaal te versterken. Wikkel de cassette met Saran Wrap of een plastic zak en sluit met tape om buiten te houden vorst. Bewaar de cassette bij -80 ° C overnacht. </li></ol> 5. Het ontwikkelen van XAR Films <ol><li> De volgende dag, verwijder cassette uit diepvries en laat ontdooien bij kamertemperatuur. Ontwikkelen van de film ineen donkere kamer met een film processor volgens de instructies van de fabrikant. Let op: Controleer de films voor het bewijs van kinase-substraat paren. Een tweede langere blootstelling kan ook nuttig zijn om zwakkere fosforylering gebeurtenissen detecteren. </li></ol>

<ol><li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).</li>
<li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li>
<li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser%2FThr-based+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+rep%22%5BJournal%5D)">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li>
<li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalsh%2C+CT+%22Posttranslation+Modification+of+Proteins%3A+Expanding+Nature%27s+Inventory%22">Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory</a>. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li>
<li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li>
<li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomics%3A+methods+for+deciphering+the+kinome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li>
<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li>
<li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li>
<li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKIS%3A+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinform%22%5BJournal%5D)">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247(2013).</li>
<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li>
<li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li>
<li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways%3A+control+of+CRTC2%2FTORC2+by+the+AMPK+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li>
<li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li>
<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Aangezien de oorspronkelijke publicaties waarin de benadering 14,15, is de oorspronkelijke bibliotheek van 180 GST-kinases uitgebreid met 420 leden, en ~ 80% van het humane eiwit kinome. Met de uitgebreide bibliotheek, het protocol zoals beschreven duurt 4-5 dagen en dan 1-4 dagen om films te ontwikkelen (als noodzakelijk geacht), die door het gebruik van fosforimaging en digitale verhoging signaal kon worden ingekort. Er zijn een aantal belangrijke stappen waarbij zorg moet worden genomen (zie figuur...

Protein post-translationele modificaties (PTMs) zijn essentieel voor intracellulaire communicatie. Misschien is het beste bestudeerd van PTMs is fosforylering gekatalyseerd door proteïne kinases, die een groot aantal eiwit functies, waaronder hun biochemische activiteit, subcellulaire lokalisatie, conformatie, stabiliteit en reguleren. De identificatie van fosforyleringsplaatsen op doeleiwitten kan door tryptische fosfopeptidekartering of nu standaard proteomische technieken waarbij monsters verrijkt gefosforyleerde peptides 1,2. Terwijl driekwart van het tot expressie proteoom verwachting worden gefosforyleerd 3 en een geïdentificeerde 200.000 fosforyleringslocaties 5, met schattingen tot 1 miljoen 6, veel van deze geen toegewezen biologie, signaalweg of proteïne kinase. Terwijl de identificatie van gefosforyleerd sites is relatief eenvoudig, een relatief grotere uitdaging is omidentificeren van de verwante kinase (s) die deze plaatsen gericht een werkwijze we noemen mapping kinase: substraat paren. Verschillende benaderingen voor het identificeren van kinase: substraat paren zijn beschreven, beginnend met een kinase van belang zijn en op zoek naar de substraten of het starten met een substraat van belang en een poging om een modificerend kinase experimenteel 11/07 of computationeel 12 te vinden. Om kinases een bekende gefosforyleerd substraat identificeren, kan bioinformatica worden gebruikt om eiwitten die een korte geconserveerde sequentie van aminozuren aan weerszijden van de gefosforyleerde residu (de consensus plaatse), alsook het identificeren van kinasen die een bezinkbare complex met het substraat bevat te identificeren. Echter, deze methoden zijn tijdrovend en vaak niet met succes bekroond. We ontwikkelden een systematische functionele benadering om snel kinasen die een bepaald substraat 13 kan fosforyleren identificeren. Het scherm test produceert uitstekende specifieketeit, met een zeer duidelijke keuze voor potentiële verwante kinases. Gezien de centrale plaats van fosforylering biologische signalering, het scherm is nuttig voor ontdekking in nagenoeg alle cellen signaalroutes 14-16. Het scherm omvat het uitvoeren van een grootschalig kinase assay met een bibliotheek van menselijk eiwit kinasen. De kinasen zijn gelabeld met bacteriële glutathion S-transferase (GST) eiwit worden gezuiverd uit zoogdiercellen celextracten, hetgeen betekent dat de recombinante enzymen - anders dan die bereid uit bacteriën - gegenereerd in aanwezigheid van het stroomopwaartse eiwit kinasen vaak nodig voor het recombinante enzymen activiteit in vitro. Inderdaad, terwijl serine, threonine en tyrosine kinase-activiteit vereist voor downstream kinase activatie aanwezig in gist 10 zijn, de gist genoom codeert 122 proteïnekinasen, wat aangeeft dat het zoogdier kinome, meer dan 500 genen 17 is geworden aanzienlijk complexer om regulaTÉ de processen die uniek zijn voor hogere orde organismen. Bovendien kan het effect van verschillende stimuli voor celbiologie en menselijke ziekten (bijvoorbeeld kleine moleculen, groeifactoren, hormonen, enz.) Worden gebruikt om relevante 14,15 moduleren kinaseactiviteit in een geschikte omgeving.

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>Zie Protocol stap 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>Zie Protocol stap 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>Zie Protocol stap 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-getagd in huis</td></tr><tr><td>96 wel platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>Supplement met 100&nbsp;U/ml penicilline, 100&nbsp;&#956;g/ml streptomycine, 10% foetaal runderserum.</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm celcultuur schaaltjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Serumvrij medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipide-gebaseerd transfectiereagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automatische vloeistofdespender</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Kleine cassette-aansluiting</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standaard cassette-aansluiting</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>Zie Protocol stap 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl2</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meerkanaals pijpette (20-200 &#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Meerkanaals pijpette (1-10 &#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bodem 6-wel platen</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione gecoate 96-wel platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatie oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST getagd substraat</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myeline Basis Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pijpette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&nbsp;ml)</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>Zie Protocol stap 1.4</td></tr><tr><td>26-wel voorgevormde TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>Het vereiste gelpercentage is afhankelijk van het molecuulgewicht van het substraat van belang</td></tr><tr><td>Coomassie kleurstof</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% azijnzuur, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie ontkleurmiddel</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>10% azijnzuur, 20% methanol</td></tr><tr><td>Gelabelde gelcontainers</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>Gebruikte plastic deksels van lege tipboxen, net groot genoeg om één gel te bevatten</td></tr><tr><td>Whatman filterpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellofaan vellen (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Geldroger</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Dubbele emulsie autoradiografiefilm</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensiteitsscherm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van de kinase-substraat paren met behulp van high throughput screening

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We hebben een screeningsplatform dedicated humane eiwitkinasen gefosforyleerd identificeren substraten die kunnen worden gebruikt om nieuwe signaaltransductieroutes ophelderen ontwikkeld. Onze aanpak biedt het gebruik van een bibliotheek van gezuiverde GST-gelabeld humaan proteïne kinasen en een recombinant eiwit substraat plaats. We hebben gebruik gemaakt van deze technologie MAP / microtubule-affiniteit regulerende kinase 2 (MARK2) identificeren als de kinase voor glucose gereguleerde plaats op CREB Regulated Transciptie coactivator 2 (CRTC2), een eiwit dat nodig is voor betaceldeling, alsmede de Axl familie van tyrosinekinasen als regulatoren van cel metastase door fosforylering van de adapter eiwit ELMO. We beschrijven deze technologie en te bespreken hoe het kan helpen om een ​​uitgebreide kaart van hoe cellen reageren op prikkels uit de omgeving vast te stellen.

Representatieve resultaten van een scherm worden getoond in Figuur 2. 180 kinasen werden gescreend met behulp van een GST-gelabeld peptidesubstraat overeenkomende met aa 268-283 van CRTC2 evenals de klassieke kinase assay substraat myeline basisch eiwit (MBP). Slechts twee kinasen, MARK2 en de nauw verwante kinase gefosforyleerd MARK3 de CRTC2 peptide. MBP wordt opgenomen als een interne controle in alle assays, zoals het bevat veel fosforyleerbare residuen en loopt bij 18 kDa, naar de ...

Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Het algemene doel van deze procedure is om via high-throughput screeningmethoden kinasen te identificeren die een substraat van belang fosforyleren. Dit wordt bereikt door eerst cellen te transfecteren met plasmiden die kinasen fuseren aan glutathion-S-transferase of GST. De tweede stap is het uitvoeren van een GST-kinase pulldown.Vervolgens worden de monsters in gels geladen, die daarna worden uitgerend en gekleurd met Coomassie Brilliant Blue-kleurstof. De laatste stap is het drogen van de gels en het belichten ervan op autoradiografische film. Door de resulterende films te ontwikkelen en te interpreteren, kunnen kinase-substraatparen worden geïdentificeerd, aangezien elke baan representatief is voor een afzonderlijke kinase-assay.Bestaande methoden voor het identificeren van een kinase voor een bekend gefosforyleerd substraat omvatten het gebruik van bio-informatische benaderingen om te zoeken naar een consensusplaats in het substraat, het detecteren van complexen tussen kinase en substraten met behulp van biochemische technieken en een trial-and-errorbenadering, en het zoeken naar consensussubstraten op basis van hun bekende biologische functie. Deze benaderingen zijn tijdrovend en leiden niet altijd tot succes. Onze aanpak maakt een snelle identificatie van kinase-substraatparen mogelijk op basis van functionele resultaten.Toen we voor het eerst het idee voor deze methode hadden, waren we bezorgd dat er onvoldoende specificiteit in vitro zou zijn. Zo blijkt echter dat de substraatspecificiteit uitstekend is en we stellen vaak vast dat alleen kinasen uit dezelfde familie in staat zijn om een bepaald substraat in de screening te fosforyleren. Dit is bijzonder duidelijk wanneer we multiplexen met meerdere substraten in elke screening, wat aantoont dat de procedure effectief zal zijn. Courtney, een technicus uit mijn laboratorium, begint de procedure met de bereiding van reagentia, platen en cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Als platen met kinaseplasmiden zijn ingevroren, ontdooi deze dan bij kamertemperatuur en centrifugeer ze 3 minuten bij 1900 ×g om eventueel vocht onderin de wells te verzamelen. Meng 8,6 ml gereduceerd serummedium met 312,7 µl lipidisch transfectiereagens en laat het mengsel vijf minuten staan. Voeg van dit mengsel 10 µl toe aan elke well van de 96-wellsplaat die de kinaseplasmiden bevat.Gebruik een automatische vloeistofdispenser uitgerust met een cassette voor kleine volumes om 10 µL van het mengsel van transfectiereagens in serumarm medium per put toe te voegen en laat de plaat 20 tot 45 minuten staan. Resuspendeer vervolgens 293T-cellen op een concentratie van 0,75 miljoen cellen per mL in 80 mL compleet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en voeg 100 µL van de celsuspensie per put toe. Gebruik hiervoor een automatische vloeistofdispenser uitgerust met een cassette voor standaardvolumes. Controleer de putten onder een microscoop op een uniforme celverdeling voordat de plaat gedurende 24 uur in een incubator bij 37 °C wordt geplaatst.Om te beginnen met het GST-kinase pull-downexperiment: maak een 4 mM vanadaatoplossing door 60 µL 0,2 M natriumvanadaat te mengen met 540 µL water. Meng in een tweede buis 2,7 µL 30% peroxide met 1,4 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Voeg de twee oplossingen samen en laat het mengsel 15 minuten staan voor gebruik.Dispenseer met een multichannelpipet twee µL 0,25 M calciumchloride in elke put, gevolgd door 2,5 µL van de bewezen datumoplossing. Incubeer elke plaat 10 minuten bij 37 °C en plaats ze vervolgens op ijs, waarbij de platen op ijs worden gehouden. Verwijder het medium uit elke put met behulp van een vacuüm en voeg onmiddellijk 50 µL ijskoude lysisbuffer per put toe.Laat de plaat, na gebruik van een automatische vloeistofdispenser voorzien van de standaardcassette, 30 minuten op ijs staan om te lyseren. Nadat de platen drie minuten zijn gecentrifugeerd bij 1900 ×g bij vier graden Celsius, worden de cellen uit elke put geschraapt met een multichannelpipet en wordt de gehele inhoud overgebracht naar overeenkomstig gelabelde vbo. Centrifugeer de 96-wellplaten 10 minuten bij 1900 ×g bij vier graden Celsius; vul tijdens het centrifugeren glutathione-gecoate platen met 100 µL ijskoud lysisbuffer per put.Houd de platen op ijs tijdens het spoelen. Keer na centrifugatie van de bodemplaten de glutathionplaten boven een gootsteen om om de lysisbuffer eruit te schudden en dep ze droog met een papieren handdoek. Breng de lysisbuffer van de V-bodemplaten over naar de glutathionplaten door de plaat te kantelen en een multichannelpipet te gebruiken, waarbij u er nauwgezet op let dat het pellet op de bodem niet wordt verstoord.Dek vervolgens de platen af en laat deze minimaal twee uur op ijs staan. Om de binding te voltooien aan het einde van deze tweeuurige bindingsstap, dient een radioactiviteitstation te worden voorbereid, waarbij moet worden gecontroleerd of de nodige veiligheidsvoorschriften voor werk met radioactieve stoffen zijn getroffen. Stel de hybridisatieoven in op 30 °C.Keer de glutathionplaten boven een gootsteen om om de lysisbuffer eruit te schudden en dep ze af met een papieren handdoek. Spoel de putjes drie keer met 100 µL lysisbuffer zonder PMSF. Laat de putjes niet opdrogen.Houd ze in het spoelmiddel tot u klaar bent om verder te gaan. Bereid vervolgens 55 milliliters van een 1X kinasebuffer of 1X KB voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 50 µL van de 1X KB toe aan elke well van de plaat met behulp van een automatische vloeistofdispenser die is uitgerust met een cassette voor standaardvolume.Bereid vervolgens oplossing A door een oplossing te maken die het substraat van belang en myelin basic protein of MVP bevat, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol, één voor één. Keer de platen boven een gootsteen om om de 1X KB-spoeling te verwijderen op een papieren handdoek en voeg onmiddellijk 30 µL oplossing A toe. Gebruik hiervoor een automatische vloeistofdispenser die is uitgerust met een cassette voor kleine volumes. Bewaar de platen op ijs.Bereid vervolgens oplossing B voor in het werkgebied voor radioactiviteit, zoals beschreven in het tekstprotocol, met 20 µL oplossing B per putje. Gebruik een repeaterpipet, wat het mengen bevordert door de uitstootkracht, dek de plaat af en incubeer deze gedurende 30 minuten in een hybridisatieoven op 30 °C. Breng de platen na 30 minuten terug op ijs.Voeg vervolgens met een meerkanaalpipet 50 µL van een tweevoudige sodium dodecyl sulfate of SDS-lysisbuffer toe aan elke put. Alle handelingen in dit gedeelte moeten worden uitgevoerd in een gebied dat is aangewezen voor radioactiviteit. Schakel de hybridisatieoven in en stel deze in op 85 °C.Zodra de oven de gewenste temperatuur heeft bereikt, worden de platen naar de oven overgebracht en 10 minuten geïncubeerd om de monsters te denatureren. Laad vervolgens 15 µL van elke reactie in precast gels van 26 putjes.Bij het gebruik van een meerkanaalpipet om meerdere wells tegelijk te vullen, moet er nauwkeurig worden gecontroleerd of alle tips zijn uitgelijnd met de overeenkomstige wells. Voordat de monsters worden toegevoegd, dient de gel te worden gedraaid bij 150 volt. Zorg ervoor dat de blauwe lijn niet van de onderkant van de gel afloopt, aangezien deze het niet-ingebouwde ATP bevat. Demonteer vervolgens de gels en verwijder het niet-ingebouwde ATP, omdat dit de belichting van de gel op de films zal verdonkeren.Plaats de gels in gelabelde containers en dek ze 15 minuten af met kumasi-kleurstof. Verwijder vervolgens de kumasi-kleurstof. Spoel de gels kort af met water en voeg ontkleuringsoplossing toe.Bewaar de gels totdat de eiwitten duidelijk zichtbaar zijn. Voor elk monster moet een band voor MVP en een band voor het substraat zichtbaar zijn. Om de gels te drogen, snijdt u een groot vel filterpapier en plaatst u dit op de droger.Maak een cellofaanvel nat met gedestilleerd water totdat het glad en rimpelvrij is en plaats het bovenop het papier. Leg de gels bovenop het cellofaanvel en noteer de volgorde van de gels. Maak een tweede cellofaanvel nat en plaats dit bovenop de gels.Rol alle luchtbellen uit voor een mooi uniform oppervlak. Sluit de klep, zet de vacuümpomp aan en droog de gels gedurende drie uur bij 80 °C. Zodra de gels droog zijn, worden ze belicht op dubbele emulsie autoradiografiefilm met behulp van een versterkingsscherm om het signaal te intensiveren.Wikkel de cassette in vershoudfolie of een plastic zak en verzegel deze met plakband om ijsvorming te voorkomen voordat de cassette een nacht bij minus 80 graden Celsius wordt bewaard. Verwijder de cassette de volgende dag uit de vriezer en laat deze ontdooien bij kamertemperatuur. Ontwikkel de film in een donkere kamer met een filmprocessor volgens de getoonde instructies van de fabrikant.Hier zijn representatieve resultaten van een screen waarbij 180 kinasen werden gescreend met een GST-getagd peptide-substraat dat overeenkomt met aminozuren 268 tot en met 283 van kreb regulated transcriptional coactivator two of CRTC2, alsook het klassieke kinase-assay-substraat myelinine basis proteïne of MBP. Slechts twee kinasen, MARK2 en het nauw verwante kinase MARK3, fosforyleerden het CRTC2-peptide. MBP is in alle assays opgenomen als interne controle, aangezien het veel fosforyleerbare residuen bevat en bij 18 kilodalton onderaan de gel loopt.Dit maakt een interpretatie van de specificiteit mogelijk. Sommige kinasen zullen zowel een substraat als MVP robuust fosforyleren. Opmerkelijk is hier dat de wells met alleen GST altijd enige endogene kinaseactiviteit zuiveren.Hierdoor is er in de assay altijd sprake van achtergrondfosforylering. Hoewel dit niet uitsluit dat de fosforylering van het substraat reëel is, suggereert het wel dat de kinase in de in vitro setting minder selectief kan zijn. Het is met name informatief om meerdere substraten met verschillende molecuulgewichten op te nemen om conclusies te trekken over de substraatspecificiteit van de kinase.Omdat de screening in vitro plaatsvindt en er in vivo extra complexiteitsniveaus optreden, moet een kandidaat-kinase in cellen worden gevalideerd. Zo kan een kandidaat-kinase bijvoorbeeld wel het vermogen hebben om een substraat in vitro te fosforyleren, maar mogelijk niet in hetzelfde celtype of in dezelfde subcellulaire compartimenten als het substraat tot expressie komen. Dit wordt doorgaans gedaan met behulp van RNAi-gemedieerde silencing van de kandidaat.Het is ook mogelijk om een secundaire screening uit te voeren met gebruik van een mutant van het substraat die niet gefosforyleerd kan worden, om de specificiteit te bevestigen.

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit...

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

In this video, we describe a method to identify the small-molecule kinase inhibitors that modulate the apoptosis of self-reactive CD4+CD8+ double-positive immature thymocytes. Apoptosis is induced in the double-positive thymocytes by activating them with anti-CD3- and anti-CD28-coated magnetic beads; this is followed by a small-molecule inhibitor treatment and flow cytometry analysis to detect if the inhibitors modulate the apoptotic marker expression.

Identifying Kinase Inhibitors that Modulate the Thymocyte Response to Strong TCR Signals

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Hier presenteren we een kwantitatief en schaalbaar protocol voor het uitvoeren van gerichte kleine molecuulschermen voor kinase-regulatoren van de naïeve-primed pluripotente transitie.

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Leer hoe je kinase-substraatparen identificeert met high throughput screening. Deze methode gebruikt GST-pulldown en autoradiografie om fosforyleringsactiviteit snel te analyseren.

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

Meer video's verkennen