Het meten van TCR-pMHC Binding

In deze video laten we zien hoe de kinetiek gemeten kan worden tussen de T-celantigeenreceptor en het peptide-geladen major histocompatibility complex of PMHC in C two binnen de immunologische synaps tussen een T-cel en een planaire ondersteunde lipidebilaag. We leiden u kort door belangrijke aspecten van eiwitproductie en het verifiëren van de functionele integriteit van de lipidebilaag via calciumfluxmetingen. Voor meer gedetailleerde informatie over het bereiden van de lipidebilaag en het opzetten van een single-molecule fluorescentiemicroscoop, raadpleeg ons parallelle artikel in het Journal of Visualized Experiments. Vervolgens leggen we in detail uit hoe FRET-metingen uitgevoerd en geanalyseerd kunnen worden, zowel in bulk als op single-molecule niveau.

Om de kinetiek van de synaptische binding van de T-celreceptor aan het PMHC af te leiden en onze op FRET gebaseerde strategie te verklaren die in onze algehele aanpak wordt gebruikt, beginnen we met de kristalstructuur van de T-celreceptor of TCR, hier in het blauw, terwijl deze bindt aan het antigeen, het peptide-geladen MHC-molecuul of PMHC, weergegeven in geel en rood. We introduceren ook een single-chain fragment van de variabele domeinen van een T-celreceptor bèta-reactief antilichaam, aangeduid als age 57. Voor kwantitatieve FRET-gebaseerde metingen is het noodzakelijk om zowel de FRET-donor, in ons geval het single-chain fragment, als de FRET-acceptor, het PMHC, op een site-specifieke manier te labelen.

Dit is haalbaar voor recombinante eiwitten door de introductie van een ongepaarde cysteine, die vervolgens covalent kan worden gebonden aan maleïmide-geconjugeerde fluorforen. Zoals getoond, bevestigen we de FRET-donor Alexa Fluor 555 of Cy3 aan het single-chain fragment en de FRET-acceptor Alexa Fluor 647 of Cy5 aan de C-terminus van het MHC-gebonden peptide.

De Indy-afstand zoals weergegeven in deze samengestelde structuur is ongeveer 41 angstrum, zelfs minder dan de eerste straal, de afstand van halve maximale energieoverdracht tussen de twee kleurstoffen. In onze experimenten gebruiken we planaire, op glas ondersteunde lipide dubbellagen als surrogaat-antigeenpresenterende cellen. Deze zijn gefunctionaliseerd met PMXC, het atory-molecuul B seven one en het adhesiemolecuul I chem one.

Op deze manier kan beeldvorming worden uitgevoerd in de modus van totale interne reflectiefluorescentie, waarbij Fluor force in directe nabijheid van de interface wordt verlicht, waardoor de cellulaire achtergrond aanzienlijk wordt verminderd. Fret is alleen detecteerbaar wanneer met single chain fragment gelabelde TCRs binden aan in de laag ingebedde PM hcs. Dit stelt ons in staat om T-C-R-P-M-H-C binding te visualiseren en vervolgens de bindingskinetiek te berekenen in C twee correct gevouwen histo gene Tact.

Extracellulaire delen van P71 en Ichem1 worden gezuiverd uit supernatten van insectencelculturen die geïnfecteerd zijn met het overeenkomstige BUC-virus. De zuivering wordt uitgevoerd in drie stappen, beginnend met nikkel-IMAC-affiniteitschromatografie, gevolgd door ionenuitwisselings- en grootte-uitsluitingschromatografie. His-getagde MHC-klasse II-heterodimeren worden tot expressie gebracht in E. coli als inclusielichaampjes en in vitro gerenatureerd bij 4 °C in aanwezigheid van een placeholder-peptide via snelle verdunning in redoxbuffer.

Het ruimtehoudende peptide zal later worden gesplitst via blootstelling aan UV-licht. Correct gevouwen PMHC-complexen worden gezuiverd en geconcentreerd, waarna het ruimtehoudende peptide wordt gesplitst en bij pH 5,2 wordt vervangen door het fluorescente peptide.

Het eindproduct is gezuiverd op basis van grootte. Het single-chain fragment wordt tot expressie gebracht met een vrije cysteïne als inclusielichaampjes in e coli, in vitro gevouwen via stapsgewijze dialyse en gezuiverd op basis van grootte. Vervolgens wordt het via de vrije cysteïne gelabeld met een geconjugeerde maleïmide-kleurstof en opnieuw gezuiverd op basis van grootte.

Alle recombinante eiwitten worden tot slot gedialyseerd tegen PBS met 50% glycerol, geconcentreerd tot één milligram eiwit per milliliter en voor langdurige bewaring bewaard bij -20 °C. Gebruik de ratiometrische kleurstof URA2 om de intracellulaire calciumspiegels in T-cellen te meten, als middel om de stimulerende potentie van de lipide dubbellaag te verifiëren. Laad de T-celblasten met de URA2-AM-ester.

Deze verbinding dringt de cellen binnen via de AM-groep, maar wordt vervolgens vastgehouden door de werking van esterasen, die het AM-gedeelte afsplitsen. Voeg fira 2:00 AM toe aan ongeveer 3 miljoen T-cellen tot een eindconcentratie van vijf microm MO per liter. Verplaats de cellen van de 24-wells plaat naar een nieuwe buis en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Was de cellen één keer in imaging-buffer die Hanks-gebalanceerde zoutoplossing bevat, inclusief calcium en magnesium, en 1% albumine. Gebruik een geautomatiseerd, UV-compatibel omgekeerd microscoopsysteem om intracellulair calcium te monitoren. Start het timing-protocol en voeg minimaal twee geladen T-cellen toe aan de gefunctionaliseerde lipide dubbellaag die in focus op de objecttafel van de microscoop is geplaatst; neem op regelmatige tijdsintervallen een DIC-beeld en twee fluorescentiebeelden op, geëxciteerd met UV-licht van 340 en 380 nanometer.

Onmiddellijk na het maken van contact met de dubbellaag vertonen T-cellen verhoogde calciumgehaltes, zoals afgelezen door de URA two ratio 15 minuten na aanvang van de run. Voeg een blockerend antilichaam toe aan de cellen dat alle PMHC-antigenen verzadigt. Als gevolg hiervan dalen de intracellulaire calciumgehaltes naar die van de niet-geactiveerde staat, die later als referentie dienen.

Zodra de niveaus van het blokkerende antilichaam zijn afgenomen tot een waarde die de niet-geactiveerde staat weerspiegelt, welke we voor FRET-metingen normaliseren naar één, moeten de T-cellen voor elk experiment worden gekleurd met een TCR-reactieve single-chain fragment FRET-probe. Breng ongeveer 1 miljoen cellen over naar een buis en centrifugeer deze bij 400 G. Giet het medium af en verwijder de resterende mediumdruppels die aan de binnenwanden kleven met een papieren handdoek. Dit garandeert een minimaal incubatievolume van ongeveer 30 µL, zoals eerder vermeld.

De FRET-probe wordt bewaard bij een concentratie van 1 mg/mL in 50% glycerol bij -20 °C. De probe is plaatsspecifiek gelabeld met ofwel Alexa Fluor 555 of Alexa Fluor 647, met een fluorofoor-proteïneratio van 1:1. Voeg 0,3 µL van de probe toe aan de cellen. Tik het pellet voorzichtig enkele keren aan en incubeer de cellen gedurende 20 minuten op ijs.

Was de cellen in ijskoude imagingbuffer. Herhaal deze wasprocedure één keer. Incubatie, centrifugatie en bewaring bij lage temperatuur zorgen ervoor dat T-cellen de fluorescente probe niet internaliseren terwijl ze eraan worden blootgesteld.

Dit zou leiden tot een verhoogde achtergrondfluorescentie. Bovendien verliezen T-cellen de probe in de kou niet tijdens het wassen en de opslag voordat de kamer met de bilair op de microscoopstage-exchange wordt geplaatst. Vervang de PBS opeenvolgend door imaging-buffer en voorkom te allen tijde dat de bilair aan de lucht wordt blootgesteld, aangezien dit de bilair zou vernietigen.

Om de cellulaire achtergrond te verminderen, maken we gebruik van turf-illuminatie. Hiervoor positioneren we de excitatiestraal in een kritische hoek waarbij totale interne reflectie optreedt. Schakel de excitatie uit, zet het brede licht aan, voeg de T-cel toe aan de ltec-kamer en laat ze bezinken op de lipidelaag.

Schakel de excitatie in en focus op een niet-turf verlichtingsveld. Het celmembraan is zichtbaar als een ring langs de optische as in elk brandvlak; bij turf is enkel het basale membraan in contact met de dubbellaag waarneembaar. Brandvlakken daarboven worden niet langer geëxciteerd en zijn daarom niet zichtbaar.

Het timingprotocol begint met rode en groene excitatiepulsen voor de beeldvorming van PMHC en TCR, gevolgd door een rode bleach-puls om de P-M-H-C-F acceptor te ablateren. Een groene puls voor de beeldvorming van de TCR na F-acceptorbleaching, en een rode puls om de ablatie van de F-acceptor te verifiëren, worden uitgevoerd op een subseconde tijdschaal met de kortst mogelijke vertraging tussen de eerste en de tweede groene pulsen. Optioneel kan er aan het begin een DIC-beeld worden verkregen; tweedelige beeldsplitsing maakt gelijktijdige detectie van het fed-donor- en fed-acceptorkanaal mogelijk.

De excitatie van de gefedde acceptor laat de accumulatie van P HCS in de T-celsynaps zien. Deze preble-afbeelding bevestigt de aanwezigheid van pmcs en duidt op reeds TCR-gemedieerde PMHC-binding. Opwindend. De gefedde donor geeft aanleiding tot beelden in beide kanalen.

Het signaal van het gevoede donorKanaal neemt tot op zekere hoogte in intensiteit af door energietransfer naar het F-acceptorkanaal. Het signaal van het FRET-acceptorkanaal bestaat uit FRET-bleedthrough van de gevoede donor en kruisexcitatie van de FRET-acceptor. Desalniettemin zal dit beeld niet voor analyse worden gebruikt.

In het huidige protocol volgt een snelle bleekstap die alle geaccepteerde fluoro-foren elimineert. De intensiteit van het F-donorbeeld na acceptabel bleken is nu hersteld naar hogere niveaus zonder intensiteitsverlies in het FRET-kanaal.

De volgende FRET-acceptorverwachting verifieert het volledige bleken van de F-fat-acceptor. Laten we inzoomen op de synaps om het herstel van de fed-donor te kwantificeren. Bepaal de gemiddelde achtergrondintensiteit als een constante, ongeacht de FRET-acceptor.

Voer fotobleken uit en bepaal vervolgens de gemiddelde intensiteit van de synaps en die van een representatief TCR-cluster. De FRET-opbrengst wordt vervolgens berekend door het verschil voor en na de ablatie van de acceptor te normaliseren. In ons voorbeeld meten we 16% FRET voor de gehele synaps en 26% FRET voor de representatieve cluster.

De opbrengsten van TCR-cluster-fretting zullen later worden omgezet in TCR-bezettingen, die leiden tot tweedimensionale synaptische dissociatieconstante-gegevens op enkelmolecuulniveau. Dit stelt ons in staat om de kinetiek van de synaptische TCR-peptide-MHC-binding af te leiden voor enkelmolecuul-FRET-experimenten. We gebruiken dezelfde reagentia en laboratoriumstrategie als voorheen.

Om echter te garanderen dat we inderdaad de interactie tussen een enkele TCR en een enkel peptide MHC waarnemen, kiezen we ervoor om aan het volgende criterium te voldoen. Een kandidaat-event voor een enkelmolecuul-FRET moet colloquialen met het enkele FRET-acceptormolecuul of FRET-donormolecuul. Hier gebruiken we een enkele pMHC als FRET-acceptormolecuul om het enkelmolecuul-karakter van het waargenomen FRET-event te verifiëren, maar de omgekeerde redenering.

Het gebruik van fed-acceptoren in hogere knoppen en Fred-donoren in lage knoppen is zeker een optie. We stellen T-cellen die in contact komen met een stimulerende lipidenlaag gewoonlijk bloot aan excitatie van 514 en 647 nanometer; sequentiële en repetitieve excitatie van donor en acceptor met een minimale tijdvertraging van één milliseconde wordt gevolgd door een vertragingstijd. Deze kan worden aangepast aan de vereisten van het experiment.

Om een voldoende sterk fluorescent signaal te verkrijgen voor de detectie van een enkele kleurstof binnen milliseconden na excitatie, moeten we hoge excitatievermogensdichtheden toepassen die variëren tussen één en vijf kilowatt per vierkante centimeter. Vanwege fotobleken daalt het aantal zichtbare PMHC fret-acceptormoleculen snel naar een niveau waarop individuele fret-acceptor-fluorescentiekrachten onderscheidbaar worden in een dubbellaag met 30 of meer gelabelde PMCS per vierkante micron. Een voorbeeld wordt hier getoond voor een totale tijdsvertraging van 42 milliseconden.

Een enkel FRET-event, gemarkeerd met de rode cirkel, wordt zichtbaar in het tweede en derde tijdspunt. Het co-lokaliseert met een enkel S5-molecuul, gemarkeerd met een groene cirkel. In dit voorbeeld heeft het waarneembare FRET-event een traceraaplengte van twee; verzamel meer enkelvoudige moleculaire FRET-traces, zoals weergegeven in de tabel in some 128 traces.

Bereken vervolgens de complementaire cumulatieve som van de traces, zoals aangegeven door de groene getallen, en normaliseer deze; zet de genormaliseerde waarden uit in een grafiek en fit deze met een mono-exponentiële functie. De verwachtingswaarde is iets meer dan 1,5 timeframes. Deze waarde is afhankelijk van TCR-peptide-, MHC-binding en fotobleaching; om onderscheid te kunnen maken tussen deze twee bijdragen, moet de verwachtingswaarde daarom voor ten minste drie verschillende tijdstippen worden berekend.

Zet nu alle verwachtingswaarden uit tegen hun respectieve tijdvertragingen en fit de datapunten aan de getoonde functie met de hier aangegeven levensduur van 2,12 seconden en de verwachtingswaarde voor fotobleken f Fred. Het herstel van de donor na acceptabele bleking, zoals hier en eerder in meer detail getoond, kan worden gebruikt om in slechts enkele stappen de tweedimensionale dissociatieconstanten te bepalen zoals deze effectief zijn binnen de immunologische synaps.

Hier richten we onze analyse op TCR-engagement en TCR-clusters waar de binding van T-C-R-P-M-H-C het meest prominent is. Zoals blijkt uit de getoonde metingen variëren de F FRED-opbrengsten aanzienlijk voor individuele TCR-clusters.

Het vermenigvuldigen van F fred met de proportionaliteitsfactor C levert de TCR-bezetting op, een term die de verhouding beschrijft tussen het aantal gebonden PMHC-TCR's en hun totale aantal. C moet eenmaal worden bepaald voor een specifieke set fre-paren en het gebruikte FRE-systeem. Aan het einde van deze presentatie leggen we in meer detail uit hoe C bepaald kan worden, wat bijvoorbeeld het gebruik van SI drie en SI vijf inhoudt, specifiek geplaatst op het TCR R reactieve enkelstrengs antilichaamfragment en de C-terminus van het aan MHC gebonden peptide. Dit bedraagt ongeveer twee synaptische, tweedimensionale dissociatieconstanten die kunnen worden berekend uit de TCR-bezetting, aangeduid als A, en de initiële dichtheid van pmcs aanwezig op de lipide bilaag.

De getoonde relatie is afgeleid van de wet van massawerking en wordt in meer detail toegelicht in het artikel dat bij deze video hoort. In ons voorbeeld bedraagt de initiële dichtheid van pmcs 30 moleculen per vierkante micron. Dit leidt tot een distributie van 2D kds, die effectief zijn in de T-celsynaps met een mediaanwaarde van ongeveer 34 moleculen per vierkante micron.

De on-rate distributie kan worden berekend uit de synaptische 2D KD-distributie en de bijbehorende off-rate, hier 0,41 per seconde, zoals bepaald via single-molecule FRET-trace analyse bij 24 °C. De mediaanwaarde is ongeveer 0,01 vierkante micron per molecuul per seconde. Samenvattend maken FRET-metingen tussen TCR en peptide-MHC een uitgebreide analyse mogelijk van alle kinetische parameters die de reactiedynamiek in C2 beschrijven.

Deze methodologie kan in principe worden gegeneraliseerd naar de analyse van andere receptor-ligandinteracties, aangezien deze integraal kunnen zijn voor cel-celherkenning. Tot slot bespreken we hoe de constante C experimenteel kan worden afgeleid, welke nodig is om vetopbrengsten om te rekenen naar TCR-bezettingen. Deze procedure hoeft slechts eenmaal te worden uitgevoerd.

De bepaalde constante C kan vervolgens worden toegepast voor alle volgende experimenten waarin hetzelfde FRET-systeem met dezelfde fluorforen wordt gebruikt. In deze procedure hebben we in essentie de FRET-opbrengsten, gemeten in individuele TCR-clusters via donorherstel na fotoblekken van de acceptor, gekoppeld aan de overeenkomstige intensiteitswaarden die in het gesensitiseerde FRET-kanaal zijn gedetecteerd. Zoals eerder besproken, wordt de FRET-opbrengst bepaald aan de hand van de achtergrondgecorrigeerde FRET-donor kanaalbeelden vóór en na ablatie van de FRET-acceptor.

Het gesensibiliseerde FRET-kanaal moet worden uitgelijnd met het F-donorkanaal en X- en Y-as, en gecorrigeerd worden voor achtergrondruis. FRET-donor bleed-through en FRET-acceptor kruisexcitaties, zoals hier getoond. Een gedetailleerde beschrijving van hoe men kan corrigeren voor FRET-donor bleed-through en FRET-acceptor kruisexcitaties wordt in het artikel gegeven.

Bereken nu, ter begeleiding van deze video, voor elk TCR-cluster de verhouding tussen het bug-signaal van de gecorrigeerde fret-afbeelding en de bijbehorende gecorrigeerde fret-donorfoto. Bepaal het gecorrigeerde gemiddelde signaal voor enkele fret-donoren en enkelvoudige moleculaire fret-gebeurtenissen en bereken de verhouding. De TCR-bezetting wordt vervolgens afgeleid door beide verhoudingen met elkaar te vermenigvuldigen.

Zet nu de bepaalde FRET-opbrengsten voor individuele TCR-clusters uit tegen hun TCR-bezetting. C wordt vervolgens bepaald via lineaire regressie, zoals hier wordt getoond. In ons voorbeeld komt dit neer op ongeveer twee.

Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om een proteïne-gefunctionaliseerde lipide dubbellaag in combinatie met fluorescentiemicroscopie van enkelvoudige moleculen te gebruiken om de synaptische bindingskinetiek tussen PMHC en TCR te meten. Alle noodzakelijke stappen, inclusief proteïneproductie, T-celmarkering en de uiteindelijke FRET-metingen, werden besproken. Bovendien werd de beeldanalyse in detail getoond, waaruit T-celactivatiecurven en FRET-waarden voortvloeien.

Ten slotte is de methodologie onderliggend aan de bepaling van de kinetische on- en off-rates aangetoond. Een analoge aanpak kan in principe worden gebruikt om andere interacties tussen synaptische receptoren en liganden te bepalen, hoewel passende aanpassingen mogelijk noodzakelijk kunnen zijn.