Name: Het meten van TCR-pMHC Binding In Situ Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: Leer hoe je TCR-pMHC-bindingskinetiek in situ meet met FRET-microscopie in de immunologische synaps. Deze methode kwantificeert affiniteit, off-rate en on-rate op bulk- en single-molecule niveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MA werd ondersteund door een Schrödinger gemeenschap van de Oostenrijkse Science Fonds (FWF, J3086-B11) en dankzij het Max-Planck-Maatschappij voor financiële en administratieve ondersteuning. GS en JH werden ondersteund door de Wenen Science and Technology Fund (WWTF, LS13-030).

<ol><li>Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+TCR+germline+bias+for+MHC+is+surprisingly+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol.%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple.</a> Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature.. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interdisciplinary+science+of+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology.%22%5BJournal%5D)">The interdisciplinary science of T-cell recognition.</a> Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).</li>
<li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Microscopy+on+Planar+Supported+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vizualized+Experiments+J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers.</a> Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158(2015).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinkable+pMHC+monomers+stain+T+cells+specifically+and+cause+ligand-bound+TCRs+to+be+preferentially+transported+to+the+cSMAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC.</a> Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).</li>
<li>Toebes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+use+of+conditional+MHC+class+I+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Design and use of conditional MHC class I ligands.</a> Nat Med. 12, 246-251 (2006).</li>
<li>Tsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+recovery+of+functional+single-chain+Fv+fragments+from+inclusion+bodies+overexpressed+in+Escherichia+coli+by+controlled+introduction+of+oxidizing+reagent--application+to+a+human+single-chain+Fv+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment.</a> J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).</li>
<li>Ruegg, U. T., Rudinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+cleavage+of+cystine+disulfides+with+tributylphosphine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine.</a> Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).</li>
<li>Ruprecht, V., Brameshuber, M., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+single+molecule+tracking+combined+with+photobleaching+for+the+detection+of+rare+molecular+interactions+in+fluid+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes.</a> Soft Matter. 6, 568-581 (2010).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+self+through+two-dimensional+chemistry+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li>
<li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).</li>
<li>Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+repeat+proteins%3A+well-expressed%2C+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Meten van eiwit-eiwit interacties in situ zeer gewenst vooral dan wanneer het lage affiniteit interacties zoals TCR-pMHC-bindende 11. Dit is omdat de aan-snelheid en de stabiliteit van dergelijke interacties significant beïnvloed door de bijzondere omstandigheden waarin binding plaatsvindt. Minimaal-invasieve-FRET gebaseerde beeldvorming benaderingen zijn dus in principe perfect geschikt voor dergelijke taken, maar omvatten een aantal hindernissen die eerst moeten worden overwonnen. Geluid van cellulaire autofluorescentie beperkt de gevoeligheid van de metingen en derhalve tot een minimum worden beperkt. TIRF microscopie dient deze behoefte goed 12 maar vereist de functionalisering van glazen objectglaasjes, bij voorkeur in de vorm van een vlakke glazen ondersteunde lipide dubbellaag ingericht eiwitten keuze 13-15. Een ander voordeel van een gedeeltelijk reconstitutive aanpak is dat recombinant tweelaags-resident FRET partners veel m kan zijnerts gemakkelijk geëtiketteerd kwantitatief, plaatsspecifieke en rationele wijze met kleiner en lichter fluoroforen dan mogelijk zou zijn met celoppervlak eiwitten. TCR&#39;s worden gelabeld met recombinant SCF Vs, die geen invloed T-cel herkenning, zoals hiervoor 2 getest. Bovendien is de eiwitsamenstelling van de SLB, bijvoorbeeld de dichtheid van pMHCs en de keuze van accessoire factoren kan worden aangepast aan de eigen behoeften. We hebben eerder uitgevoerde experimenten met verschillende dichtheden van stimulerende pMHCs, maar significante verschillen in 2D-k off en 2D-K D 2 niet hebben ontdekt. Zo ver hier de erkenning van MHC klasse II moleculen is behandeld slechts, vooral vanwege de aard van hun peptidebinding spleet, die aan beide uiteinden open is en biedt dus grotere peptiden met een linker voor fluorofoor bevestiging. In sommige gevallen kan een dergelijke aanpak ook werken voor de etikettering MHC class I moleculen 16 maar grote voorzichtigheid moeten worden genomen om het gebruik ervan in experimenten te controleren. De gevoeligheid van T-cellen aan antigenen die kunnen worden gemeten via T-celproliferatiebepalingen, evenals het pMHC-TCR bindingskinetiek zoals in vitro gemeten door oppervlakte plasmon resonantie niet worden beïnvloed door de toevoeging van de linker en fluorofoor het peptide. Alternatief MHC klasse I moleculen zelf kan worden in een plaatsspecifieke wijze met de introductie van een ongepaard cysteïne binnen de sequentie van de zware keten (ongepubliceerde observaties) gemerkt. Bij het gebruik van geschikte moleculaire probes elk synaptisch eiwit-eiwit interacties kunnen in principe worden onderzocht op een wijze die hierin is beschreven. Dergelijke sondes, bijvoorbeeld, moet SCF V s of Ontworpen Ankyrine Herhaal Eiwitten (DARPins) 17, monovalent en moeten hun doelgroep stabiel zonder dat de interactie van belang te binden. Natuurlijk structurele information is zeer wenselijk voor rationeel ontwerp probe maar niet absoluut noodzakelijk. Bij de oprichting van een nieuw paar FRET partners, is het raadzaam om op te nemen en te analyseren FRET in bulk als eerste. Sites van label bevestiging kan aanzienlijk worden gevarieerd om de FRET signaal te maximaliseren en ook om te verifiëren dat gemeten FRET rendementen verschillen op basis van de inter-dye afstand. Zodra het systeem is geoptimaliseerd, enkel molecuul FRET-signalen kunnen worden opgenomen door de etikettering van de hoge overvloed FRET partner te beperken tot 10-30% en bleken de lage overvloed FRET partner tot enkele moleculen oplosbaar zijn op het gebied van verlichting. Tenslotte zij opgemerkt dat SLBs benadering sommige maar niet alle aspecten van fysiologische plasmamembraan. Eigenschappen zoals membraan kromming en flexibiliteit domein compartimentering, herschikkingen van het cytoskelet en celmotiliteit en grote variëteit oppervlak tot expressie membraaneiwitten zijn die niet door SLBs maar zou t beïnvloedenhij verwerken in onderzoek. Veel inspanning zal moeten worden geïnvesteerd om beeldvormende technieken die het mogelijk maken de controle op eiwit-eiwit-interacties met &#39;single molecule resolutie in fysiologische synapsen, die niet toegankelijk zijn voor TIRF beeldvorming zijn vast te stellen.

Een fundamenteel begrip van hoe T-cellen herkennen antigenen moeten kijken naar de juiste plaats, dat wil zeggen binnen de immunologische synaps gevormd tussen de T-cel en de APC. Hier worden moleculaire bindingskinetiek niet alleen bepaald door de inherente biochemische eigenschappen van de betrokken maar interactiepartners hangen in hoge mate af van cellulaire parameters, die cellulaire krachten membraan architectuur en laterale interacties tussen membraaneiwitten en synaps-specifieke geometrische beperkingen omvatten 3. Biochemische benaderingen zijn beperkt oplossend vermogen zij noodzakelijk verstoring van ten minste één van de synaptische membranen betrokken. Om deze reden werd een FRET-gebaseerde beeldvorming methodologie ontwikkeld om toezicht te houden binding van de TCR aan antigene pMHCs 2. Hier T-cellen zijn ingericht met een recombinant en plaatsspecifiek gelabeld TcR-reactieve enkele keten antilichaam fragment (SCF V) en geconfronteerd met plan<html> AR-glas ondersteunde lipide bilagen (SLBs), die MHC klasse II-moleculen geladen met een fluorescent gelabeld antigeen peptide, co-stimulerende moleculen en adhesie-eiwitten haven. Synaptic binding tussen kleurstof gelabelde TCR en kleurstof-gelabelde pMHC resultaten in FRET die kunnen worden bewaakt bulk en één enkel molecuul van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. In dit artikel wordt uitgelegd in detail hoe SLBs te gebruiken voor het testen van T-cel synapsen, controleren hun integriteit door middel van een functioneel T-cel calcium-flux test gedrag FRET metingen in bulk en met &#39;single molecule gevoeligheid, en de verkregen gegevens te analyseren. Aanbevelingen worden aangeboden aan het produceren van goed gelijkvormig eiwitten die nodig zijn voor tweelaags functionalisering. Voor meer specifieke informatie over dubbellaagsformatie en instellen van een geschikt TIRF microscoop wordt verwezen naar een extra toegang van het publiek Jupiter publicatie terug gepubliceerd aan rug 4. tent &quot;&gt; Nature of SLBs Functionalizable SLBs kunnen gemakkelijk worden gegenereerd van unilamellaire vesicles (SUV&#39;s) met de twee lipiden 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-fosfocholine (afgekort POPC, 90-99%) en 1,2-dioleoyl- sn - glycero-3 - {[N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiazijnzuur] succinyl} (afgekort DGS NTA-Ni, 1-10%). SUV&#39;s verspreid over schone glasplaatjes een aaneengesloten vlakke dubbellaag 4 vormen. DGS-NTA-Ni dient voor polyhistidine-gemerkte eiwitten anker via polyhistidine-gemedieerde complex-vorming met de synthetische NTA-Ni-bevattende kopgroep (Figuur 1A). Voor een stabiele vereniging één vervangt meestal de inheemse transmembraandomein en cytoplasmatische staart van de hechting eiwit ICAM-1 en de costimulatoire molecuul B7-1 met één tag bevat twaalf histidines (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) (Figuur 1B) . De met peptide beladen klasse II molecule IE k bevat twee membraan ingebedde (α en β) polypeptideketens. De transmembraan / cytoplasmatische domeinen van beide ketens worden vervangen door een label met zes histidines elk (IE k α β 6H 6H of IE k -2x6H). Als alternatief verlenging van de α-keten met twaalf histidinen en verlaten van het extracellulaire domein van de β-keten ongemerkte (die tot IE k α β 12H 0H of IE k -12H) leidt tot bevredigende resultaten (Figuur 1B). Site-specifieke etikettering van pMHCs Het is belangrijk om de pMHC stoichiometrisch en plaatsspecifiek labelen om te kunnen meten FRET opbrengsten te zetten in betekenisvolle equilibrium bindingsconstanten. Dit kan worden bereikt door chemische labeling van een synthetisch peptide dat in de peptidebinding cleft van recombinant-histidine tag MHC klasse II moleculen 2,5 geladen. Het peptide omvat alle resten van de T-celepitoop als well als een korte C-terminale linker (GGS), gevolgd door cysteïne (bijvoorbeeld in de mot cytochroom c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GGSC, de linker is vetgedrukt). Deze cysteïne wordt gebruikt om het peptide stoichiometrisch label met gebruik van maleimide-kleurstof derivaten. Op dit punt extra zorg moet worden besteed aan de controle van kwantitatieve dye-koppeling met de cysteïne bevattend peptide. HPLC-zuivering van het peptide-kleurstof adduct wordt aanbevolen en moet worden gevolgd door electrospray ionisatie massaspectroscopie. Elke opgenomen massa&#39;s die overeenkomen met het peptide educt (zonder kleurstof) weerspiegelen onvolledige labeling. Indien dit waar is, dient de HPLC-gezuiverde peptide wordt onderworpen aan achtereenvolgende ronden van dye-labeling tot labeling kwantitatieve geacht. Merk op dat MALDI-TOF massaspectroscopie moet worden vermeden omdat deze methode houdt laserstraling voor monster ionisatie. Deze behandeling desintegreert het bijgevoegde gevoelige fluoroforen voordat peptide massa wordt uitgelezen en dus underrepre<html> woordigt graden van dye-vervoeging. Indirect Nog plaatsspecifieke labeling van celgebonden TCRs met gebruik van monovalente enkele-keten Fv-fragmenten Het is nog steeds een uitdaging om kleurstoffen oppervlak geassocieerde eiwitten van levende cellen cel in een plaatsspecifieke wijze bevestigen. Om deze hindernis voor oppervlak blootgestelde TCR overwinnen, is een monovalent enkele keten versie (SCF V) van de genen van de TcR -reactive monoklonale antilichaam H57-197 2 geconstrueerd. De kristalstructuur van dit antilichaam in complex met de TCR stelt om rationeel ontwerpen van een uitvoering, waarbij een serine residu in de nabijheid van de C-terminus van het MHC geassocieerde peptide (waarbij het overeenkomstige FRET partner kleurstof gehecht is) wordt vervangen door een cysteïnerest. Deze mutant cysteïne dient dan als een acceptor kleurstof conjugatie (figuur 2). Methodologieën om FRET opnemen nt &quot;&gt; Bulk FRET waarden best overeenstemt met de verhouding tussen gekozen inter-dye afstanden verifiëren en FRET efficiëntie gemeten in de TCR-pMHC bindsysteem 2. Bovendien bulk FRET metingen onthullen kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in synaptische TCR-pMHC affiniteiten ( zie hieronder en protocol paragraaf 3.2). Verschillende benaderingen voor het kwantificeren van FRET efficiëntie hebben in de literatuur 6 geïntroduceerd. In dit artikel FRET wordt geregistreerd via (a) donor herstel na acceptor bleken, en via (b) lichtgevoelig FRET acceptor emissie. De eerste methode (a) vereist het gebruik van een FRET acceptor die gemakkelijk kan worden photobleached en een donor, die vrij photostable. Bovendien is het belangrijk dat de photobleached acceptor niet langer in staat afschrikken van het donor fluorescentie. Als dezelfde detectie-kanaal (donor) wordt gebruikt voor het kwantificeren, geen correctiefactoren eend geen chromatische aberraties moeten worden beschouwd, die deze methode eenvoudig en betrouwbaar maakt. Echter, kunnen kwantitatieve metingen niet worden herhaald op dezelfde plek monster en veranderingen in FRET kan niet worden opgenomen in de tijd. Effecten veroorzaakt door moleculaire diffusie of cellulaire beweeglijkheid snel bleken stap moet worden nagestreefd, waarbij de tijd passeren tussen de eerste FRET donor (vóór acceptor bleken) en de tweede FRET-donor beeldacquisitie (na FRET acceptor bleken) minimaliseert voorkomen. Het is aanbevolen om een ​​krachtige laser lichtbron van de FRET acceptor excitatiegolflengte dienst om verlichting en bleken te minimaliseren. In tegenstelling, in de benadering van FRET metingen gesensibiliseerde emissie (b) de FRET-donor geëxciteerd en de emissie van de acceptor FRET waargenomen in de FRET acceptor kanaal. Veranderingen in FRET acceptor signaal kan worden opgenomen in de tijd, maar de emissie van de FRET-donor in het rood-verschoven acceptor kanaal (termed bleedthrough) en FRET acceptor cross-excitatie via donor excitatie moet nauwkeurig worden bepaald en afgetrokken van de opgenomen FRET acceptor kanaal. Voor deze de overeenkomstige FRET donor en acceptor FRET beelden moeten ruimtelijk worden uitgelijnd. Detectie van enkel molecuul (sm) FRET evenementen Met het gebruik van lasers als excitatiebron, een gevoelige camera en ruis verzwakt TIRF microscopie van de fluorescentie van enkele fluoroforen gemakkelijk te traceren tijd. Soortgelijk geldt voor de detectie van intermoleculaire smFRET gebeurtenissen. Echter, kunnen complicaties worden veroorzaakt door FRET donor bleedthrough en cross-excitatie van de FRET acceptor, en derhalve grote zorg moet worden genomen bij het instellen van de fluorofoor dichtheden in de smFRET experiment. In het protocol hieronder (protocol hoofdstuk 4) werd de TCR gekozen als FRET-donor in hoge overvloed en pMHC als FRET acceptor in lage overvloed. Naar FR verzwakkenET donor bleedthrough voldoende, versieren 10-30% van de TCR met fluorescerende SCF V en 90-70% van de TCR&#39;s met niet-fluorescerende SCF V. Hier werd de FRET acceptor kanaal gekozen als single molecule channel omdat het confocale met de single molecule FRET kanaal. Dit helpt om smFRET gebeurtenissen af ​​te stemmen met &#39;single molecule FRET acceptoren, die de basis vormt van smFRET validatie. Extraheren synaptische off-tarieven door middel smFRET metingen Fotobleken van zowel FRET donor en acceptor FRET moeten worden verantwoord bij het uitpakken van de halfwaardetijd van interacties van single molecule FRET sporen. Het aantal waarneembare FRET-signalen aan het begin van hun verschijning als donor-acceptorpaar N (0) wordt de tijd verminderd zowel ontbinding van het receptor-ligand-complex en fotobleken. Het aantal overlevende complexen op een bepaald tijdstip N (t) kan mathematisch als volgt worden uitgedrukt: De term fotobleken exp (-t / τ bleekmiddel) het tijdstip t wordt beschreven door het product van het aantal waarnemingen n en de verlichtingstijd t slecht vanwege de niet-continue, discrete observatiemodus (dwz bleken uitsluitend tijdens de belichting ). Binnen de kinetische term exp- (t / τ uit) het tijdstip t is het product van het aantal waarnemingen n en de tijd t vertraging voor een FRET observatie (dwz kinetische ontbinding gebeurt continu). Vergelijking 1 kan worden uitgedrukt als: <img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> De term τ bleekwater / τ ziek describes het aantal waarnemingen tot bleking optreedt en wordt gedefinieerd als de verwachtingswaarde &lt;n bleken&gt; van de exponentiële functie. Vergelijking 2 kan als volgt worden vereenvoudigd: <img alt="Vergelijking 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> De verwachtingswaarde &lt;n (t lag)&gt; van het aantal frames N (t) met waar- FRET-gebeurtenissen na tijdstip t wordt rechtstreeks uit het experiment. Het hangt van de instelbare tijd tussen waarnemingen (t lag) in het experiment gekozen en de onbekende waarden τ uit (de inverse van de off-rate Koff) en &lt;n bleken&gt;, de verwachtingswaarde van het aantal waarnemingen voor het bleken optreedt . Aldus berekening van de verwachtingswaarde &lt;n (t lag)&gt; ten minste twee waarden van t <sub&gt; vertraging kan de experimentele bepaling van &lt;n bleken&gt; en r af. Extraheren synaptische 2D-K D waarden door middel van FRET-gebaseerde metingen Meten bezetting TCR a, dat wil zeggen de verhouding tussen gebonden TCR en de totale TCR is centraal bepalen synaptische 2D-KD-waarden. Volgens vergelijking 4 term is recht evenredig met de gemeten FRET verkregen zolang TCR dient als FRET donoren en acceptoren pMHCs als FRET. <img alt="Vergelijking 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> met een bezetting = TCR, C = omrekeningsfactor C is een constante die afhangt van het FRET-systeem en de gebruikte fluoroforen. Dit kan experimenteel worden bepaald zoals hieronder aangegeven. a kan worden omgezet in een 2D-K D volgens vergelijking 5 wanneer debegindichtheid van TCR liganden voorafgaand aan toevoeging van T-cellen aan de bilaag bekend. Dit is vanwege de hoge mobiliteit van SLB-verbonden eiwitten en omdat SLBs bieden een vrijwel onuitputtelijke reservoir van liganden 2. <img alt="Vergelijking 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> met [pMHC oorspronkelijke] = aanvankelijke dichtheid van pMHC vóór de toevoeging van T-cellen Vergelijkingen 4 en 5 kan nu gemakkelijk de synaptische 2D-KD tussen TCR en pMHC. Dit is het meest betrouwbaar gedaan met FRET metingen gebaseerd op donor herstel na acceptor bleken (zie protocol paragraaf 3.1). Echter, het meten C de verhouding tussen de intensiteit I FRET FRET (gecorrigeerd voor achtergrond, FRET donor bleedthrough en FRET acceptor cross-excitatie) en TCR bezetting een te bepalen. Voor dit,moet weten de verhouding R tussen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van enkele TCR-geassocieerde FRET donorfluoroforen (bijvoorbeeld Cy3 of AF555) sm Ik FRET donor en de gemiddelde intensiteit van de enkel molecuul FRET gebeurtenissen sm ik FRET. R is afhankelijk van het FRET-systeem betrokken emissie filters en camera voor fluorescentiedetectie. De TCR een bezetting kan vervolgens direct worden bepaald volgens vergelijking 6. <img alt="Vergelijking 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> met R = sm Ik FRET-donor / sm Ik FRET R werd bepaald als 1,45 voor H57 scFv- Cy3 / Cy5 pMHC-systeem leidt tot: a = bulk I FRET / bulk I TCR-Cy3 • 1,45 De relatie tussen de TCR een bezettingsgraad en FRET opbrengst kan worden bepaald door FRET donor herstelleny na acceptor bleken. Voor deze beide parameters uitgezet tegen elkaar om een aantal TCR microclusters zie figuur 4A .De helling van de lineaire fit geeft de conversiefactor C (met vergelijking 4). Zoals aangetoond in Figuur 4A, C bedragen voor (a) het SCF H57 V - Cy3 / Cy5 pMHC-FRET-systeem en (b) de toegepaste configuratie microscoopsysteem aan 1,995. De TCR bezetting een gemakkelijk als volgt worden afgeleid: TCR bezetting a = FRET opleveren • 1,995

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bacteriële expressie</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>insect cel media voor baculo virus productie</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS met L-glutamine (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>insect cel media voor baculo virus expressie</td></tr><tr><td>Sf9 cellen</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>cellen voor virus productie en expansie</td></tr><tr><td>High Five Cellen</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>cellen voor potein expressie</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bacteriële expressie</td></tr><tr><td>Centramate System</td><td>Pall</td><td></td><td>eiwitconcentratie uit grote volumes</td></tr><tr><td>Centramate cassette 10kDa cutoff</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>eiwitconcentratie uit grote volumes</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Äkta pure 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 kolom</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Gilson HPLC systeem</td><td>Gilson</td><td></td><td>zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &micro;m deeltjesgrootte, 21.2*250mm kolom grootte</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &micro;m deeltjesgrootte, 21.2*50 mm kolom grootte</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 kolom&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Gilson HPLC systeem</td><td>Gilson</td><td></td><td>zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &micro;m deeltjesgrootte, 21.2*250mm kolom grootte</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &micro;m deeltjesgrootte, 21.2*50 mm kolom grootte</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden</td></tr><tr><td>Cy3 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>plaatsspecifiek eiwitlabeling via mutant ongepaarde cysteïnen</td></tr><tr><td>Cy5 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>plaatsspecifiek eiwitlabeling via mutant ongepaarde cysteïnen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>plaatsspecifiek eiwitlabeling via mutant ongepaarde cysteïnen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>plaatsspecifiek eiwitlabeling via mutant ongepaarde cysteïnen</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, celdoorlatend</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>calciumgevoelige kleurstof voor cellabeling</td></tr><tr><td>dimethyl sulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>voor het oplossen van fura-2 am</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>beeldvorming buffer</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine gelyofiliseerd poeder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>supplement voor beeldvorming buffer</td></tr><tr><td>14-4-4S antilichaam</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>blokkerend antilichaam voor H2-I-Ek (herkend door de 5c.c7, 2B4 en AND TCR)</td></tr><tr><td>5 ml polypropyleen ronde bodembuis</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter 0.2&micro;m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &micro;m, fluorescent blauw/groen/oranje/donker rood</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop voor fura-2-gebaseerde calciummetingen&nbsp;</td><td>LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop voor (enkele molecuul) FRET metingen</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>voor details verwijs naar parallelle JoVE bijdrage door Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>planair ondersteunde lipide bilayers</td><td></td><td>voor details verwijs naar parallelle JoVE bijdrage door Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, met L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>T-cel media</td></tr><tr><td>niet-essentieel aminozuur 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>T-cel media supplement</td></tr><tr><td>penicilline/streptomycine/L-glutamine 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>T-cel media supplement</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>T-cel media supplement</td></tr><tr><td>muis interleukin-2 recombinant eiwit</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>T-cel media supplement</td></tr><tr><td>Research Grade Foetale Rundserum</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>T-cel media supplement</td></tr><tr><td>Origin (analyse programma)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td><td>niet-lineaire fitting van twee parameters (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

het meten van tcr-pmhc binding<em&gt; in situ</em&gt; met een fret-gebaseerde microscopie assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cellen zijn opmerkelijk specifiek en effectief bij het herkennen van antigenen in de vorm van peptiden die zijn ingebed in MHC-moleculen (pMHC) op het oppervlak van antigeenpresenterende cellen (APC's). Dit ondanks het feit dat T-cel-antigeenreceptoren (TCR's) meestal een matige affiniteit (µM-bereik) vertonen voor antigeen wanneer binding wordt gemeten in vitro1. Gezien de moleculaire en cellulaire parameters die bijdragen aan de gevoeligheid van T-cellen voor antigenen, is een op microscopie gebaseerde methodologie ontwikkeld als middel om TCR-pMHC-binding in situ te monitoren, zoals deze zich voordoet binnen de synaps van een levende T-cel en een kunstmatige en gefunctionaliseerde glasondersteunde planaire lipide dubbellaag (SLB), die het celmembraan van een antigeenpresenterende cel (APC) nabootst 2. Metingen zijn gebaseerd op Förster-resonantie-energieoverdracht (FRET) tussen een blauw- en roodverschoven fluorescente kleurstof die is bevestigd aan de TCR en de pMHC. Omdat de efficiëntie van FRET omgekeerd evenredig is met de zesde macht van de afstand tussen de kleurstoffen, kan men FRET-signalen gebruiken om synaptische TCR-pMHC-binding te visualiseren. De gevoeligheid van de microscopie-benadering ondersteunt de detectie van FRET-gebeurtenissen van enkele moleculen. Dit maakt het mogelijk om de affiniteit en afschakelingssnelheid van synaptische TCR-pMHC-interacties te bepalen en op zijn beurt de bindingssnelheid te interpoleren. Analoge assays kunnen worden toegepast om andere receptor-ligandinteracties in hun natuurlijke omgeving te meten.

De opname van intracellulair calcium via de fura-2 calcium kleurstof en de daaropvolgende cellulaire analyse om de stimulerende vermogen en dus functionaliteit van SLBs zijn weergegeven in figuur 4 te verifiëren. Zoals duidelijk wordt, calcium stijgt in T-cellen (uitgedrukt als de genormaliseerd fura-2 340nm / 380nm-verhouding met een uitgangswaarde van zijn 1) onmiddellijk zodra ze vestigen op de stimulerende SLBs. Calciumspiegels terug naar basisniveaus kort na de toevoeging van een antilichaam dat blokken pMHCs van TCR betrokkenheid en die eindigt T-celactivering. Figuur 6 toont een typisch experiment met FRET donor acceptor herstel na bleken, dat wordt toegepast om FRET opbrengsten meten en die dient om 2D-KD-waarden te berekenen (zie figuur 4). Let op: de toename van FRET donor intensiteit, die TCR vertegenwoordigt het label via AF555, na een snelle en volledige ablatie van de FRET eencceptor soorten (hier: AF647 geassocieerd met pMHCs). Ook duidelijk is de sterke daling van de FRET-kanaal, dat wil zeggen, de FRET-acceptor kanaal onder FRET donor excitatie, na FRET acceptor bleken. De nauwelijks zichtbare resterende signaal overeenkomt met donor bleedthrough FRET. FRET opbrengsten binnen afzonderlijke TCR microclusters of hele synapsen zijn berekend op basis van de vermelde gemeten intensiteitswaarden (figuur 6B). Figuur 7 toont een traject en de tijdspanne van een enkel molecuul FRET evenement zichtbaar in twee termijnen. Zoals hierboven uiteengezet in de inleiding dergelijk gedrag wordt veroorzaakt door zowel verval van synaptische TCR-pMHC binding en fotobleken. Om onderscheid tussen deze twee bijdragen, de experimentele acquisitietijd frames moeten worden gevarieerd duration: terwijl fotobleken blijft constant worden veranderingen in FRET geval trajectlengte alleen veroorzaakt door de binding kinetiek. Een kwantificering van tracelengths, w<html> hich vormt de basis voor de berekening van de off-rates en bleken figuur 7, zijn in de tabellen 1-3. Bepaling van de 2D-K D s vereist registratie van bulk FRET opbrengsten van FRET-donor label TCRs. Met het gebruik van de experimenteel afgeleide constante C (figuur 4), kan een FRET rendement gemeten voor TCR microcluster of een hele synaps omgerekend in de TCR bezetting een, dat wil zeggen de verhouding tussen pMHC-actief en totaal TCR (figuur 4C) . Bij bekende pMHC dichtheden aanwezig op de SLB vóór toevoeging van de T-cel kan een waarde worden toegepast synaptische 2D-KD-waarden (Figuur 4D) te bepalen. On-tarieven kunnen worden berekend met de wet van de massa-actie (2D-k op = 2D-k off / 2D-K D) van de bepaald synaptische off-rate en 2D-KD waarden. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53.157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Schematische omtrek van het vlakke glas ondersteunde lipide dubbellaag (SLB) systeem. (A) SLBs zijn samengesteld uit POPC (90-99%) en de synthetische lipide DGS Ni-NTA (1-10%) en vormen spontaan als schone glazen oppervlakken zijn geladen met kleine unilamellaire blaasjes (SUV&#39;s), bestaande uit de overeenkomstige lipiden. (B) Eenmaal gevormd, kunnen dergelijke SLBs worden gefunctionaliseerd met oplosbare polyhistidine tag extracellulaire delen afgeleid van pMHCs, costimulatoire B7-1 en ICAM-eiwitten 1 adhesie-eiwitten, om te dienen als APCs om T-cellen. Voor meer informatie over het voorbereiden SLBs verwijzen naar Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> Ad 2. Förster Resonance Energy Transfer-gebaseerde test te kwantificeren TCR-pMHC binding in situ. (A) een samengestelde structuur van een TCR complex met H57 enkele keten fragment aangrijpen van een pMHC illustreert de FRET-gebaseerde benadering hierin beschreven. Let op de korte afstand van ongeveer 41A scheiden van de twee bijbehorende fluoroforen ondergaan FRET. Acceptorplaatsen voor fluorofoor-maleïmiden zijn aangegeven in groen en rood. (B) Het principe van het detecteren van TCR-pMHC interacties in situ geïllustreerd. Alleen SCF V -Versierde TCRs en pMHCs (hier IE k), welke specifieke complexen te vormen, geven aanleiding tot een meetbare FRET signaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> &quot;/&gt; Figuur 3. Chromatogrammen van de uiteindelijke gelfiltratiestap die tot monomere SCF Vs en met peptide beladen IE k -2x6H moleculen. X-as vertegenwoordigt retentievolume in ml, Y-as geven absorptie bij 280 nm in willekeurige eenheden (AU) . (A) H57 SCF V plaatsspecifiek gelabeld met Alexa Fluor 555 maleïmide werd onderworpen aan chromatografie S75 ongereageerde kleurstof scheiden van het proteïne (stap 1.2.5). Fracties die overeenkomt met retentie interval van 14 tot 15 ml (stippellijnen) vertegenwoordigen gelabelde monomeer H57 SCF V. (B) IE k -2x6H moleculen complex vormt met de UV-kliefbare ANP-ruimte houder peptide had UV bestraald geweest, geïncubeerd met plaatsspecifiek Alex 647-maleïmide gemerkt peptide en uiteindelijk onderworpen aan S200 chromatografie om het proteïne te scheiden van vrij peptide (stap 1.1.2.4). Het interval tussen de streeplijnen bevat juiste wijze gevouwen en monomere pMHCs. (A, B) </strong&gt; 0,7 ml monster werd op de kolom gebracht bij het begin van de rum (0 ml punt). De verzamelde fracties werden geconcentreerd. Het eiwit-to-dye-verhouding werd bepaald door photospectrometry voorafgaand aan dialyse tegen PBS / 50% glycerol (voor opslag bij -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figuur 4. Bepaling 2D-K Ds en 2D-k on s. (A) De correlatie tussen de FRET opbrengst zoals bepaald door donor acceptor herstel na bleken en TCR bezetting experimenteel gemeten. TCR bezetting kan worden bepaald voor individuele TCR microclusters zoals uitgelegd in paragraaf 4.2. Een lineaire aanpassing van de gegevens wordt weergegeven door een lijn, waarvan de helling is gelijk aan de verhouding C tussen TCRbezetting en de FRET opbrengst. C een constante is specifiek voor het FRET-systeem en de fluoroforen (Cy3 en Cy5 here) toegepast. In dit voorbeeld leverde 1,988. (B) FRET opbrengstgegevens werden voor individuele TCR microclusters (N = 187, temperatuur = 24 ° C) tot herstel van donor acceptor bleken. Getallen onder histogram balken geven de bovengrens binnen het interval. (C) Conversie van de in (B) gegevens door vermenigvuldiging gemeten FRET opbrengsten met de constante C bepaald (A). Getallen onder balken geven de bovengrens binnen het interval. (D) Histogram (semi-logaritmische, base = 4) die de verdeling van de 2D-K D s gemeten voor individuele TCR microclusters. De mediane 2D-K D is aangegeven in blauw. Getallen onder balken geven de bovengrens in het interval. (E) De in (D) histogram omgezet into 2D-k op -histogram (semi-logaritmische, base = 4) in dienst van de synaptische k off voor de 24 ° C (0,41 s -1). De vastgestelde mediane 2D-k op waarde wordt aangegeven in het blauw. De gegevens werden oorspronkelijk gepubliceerd in Huppa et al. 2 en worden hier gevisualiseerd in een nieuw formaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figuur 5. Functionele validering van SLBs toegepast voor T-cel stimulatie en imaging. (A) TCR-transgene T-cel ontploffing geladen met Fura-2 werden geconfronteerd met stimulerende SLB herbergen antigene pMHCs, ICAM-1 en B-7. Cellular fura-2 emissie geëxciteerd bij 340 nm en 380 nm en DIC afbeeldingen opgenomen. Zoals aangegeven waarden verhouding van de emissie intensiteiten geëxciteerd bij 340 en 380 nm worden getoond in het rechter paneel. Toevoeging van pMHC blokkerende antilichamen 14 min in de experimentele run resulteerde in een afname van de intracellulaire calciumconcentratie die vergelijkbaar zijn met die van rustende T-cellen. (B) Een typische tijdsprofiel van de gemiddelde fura-2&#39;s in T-cellen in contact brengen stimulerende SLBs kenmerkt door een aanvankelijke stijging van intracellulair calcium die 2 tot 4 keer hoger in vergelijking met die van niet-geactiveerde T-cellen of T-cellen verstoken van antigeen na antilichaam-bemiddelde blokkade. Groene cirkels geven tijdstippen getoond in (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figuur 6. Bulk FRET opbrengsten zoals gemeten door middel van FRET donor herstel na FRET acceptor bleken. <strong&gt; (A) Getoond wordt een voorbeeld van een typische synaptische FRET-meting. Zoals is aangegeven op de linker- en op de top van een reeks beelden werd opgedaan met het gebruik van een emissie straalsplitser die aanleiding geven tot een FRET-donor en een FRET acceptor kanaal (voor meer gedetailleerde informatie over bundelsplitsers verwijzen naar Axmann et al 4). De in het linker beeld DIC lijn geeft de grens van het T-cel synaps. Let verlies in intensiteit binnen de FRET acceptor kanaal en de toename van de intensiteit van de FRET-donor kanaal na FRET acceptor bleken (stap 4). (B) FRET-efficiëntie kan worden gekwantificeerd als vermeld voor afzonderlijke synaptische regio of gehele synapsen. Voor inspectie, worden de beelden voor en na FRET acceptor bleken getoond met het gebruik van twee opzoektabellen (LUT, groen en natuurkunde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> </p&gt; <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figuur 7. Single molecule FRET gebeurtenissen verschijnen en verdwijnen insingle stappen en zijn perfect afgestemd op een enkele FRET acceptorfluorofoor. De tijdspanne van de enkel molecuul FRET gebeurtenis wordt getoond. Beelden werden verkregen met behulp van een back-verlichte EMCCD camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figuur 8. Het bepalen van τ off = 1 / k off van gemeten smFRET trajecten. (A) De genormaliseerde cumulatieve sommen waarneembare FRET-signalen (afgeleid van H57 SCF V -AF555 ingericht 5c.c7 TCR transgene T-cel ontploffing herkennen IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 bij 24 ° C) gedurende vier verschillende tijdvertragingen (42 ms, 490 ms, 1007 msec, 1989 msec) werden uitgezet als een functie van het totale aantal waarnemingen. Mono-exponentiële fit functies aanleiding geven tot overeenkomstige de negatieve inverse van de verwachting waarden &lt;n (t lag)&gt;. (B) Verwachting waarden werden uitgezet tegen vertragingen t lag en gemonteerd met behulp van vergelijking &lt;n (t lag)&gt; = τ uit / {(T off / &lt;n bleken&gt;) + t lag} om τ opbrengst uit en &lt;n bleken&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit manuscript beschrijft hoe (enkele molecuul) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde assays uit te voeren om de bindingsdynamiek tussen T-cel antigeen receptor (TCR) en antigeen peptide-geladen MHC-moleculen te meten zoals ze optreden binnen de immunologische synaps van een T-cel in contact met een gefunctionaliseerde planaire ondersteunde lipide bilayer.

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

In deze video laten we zien hoe de kinetiek gemeten kan worden tussen de T-celantigeenreceptor en het peptide-geladen major histocompatibility complex of PMHC in C two binnen de immunologische synaps tussen een T-cel en een planaire ondersteunde lipidebilaag. We leiden u kort door belangrijke aspecten van eiwitproductie en het verifiëren van de functionele integriteit van de lipidebilaag via calciumfluxmetingen. Voor meer gedetailleerde informatie over het bereiden van de lipidebilaag en het opzetten van een single-molecule fluorescentiemicroscoop, raadpleeg ons parallelle artikel in het Journal of Visualized Experiments. Vervolgens leggen we in detail uit hoe FRET-metingen uitgevoerd en geanalyseerd kunnen worden, zowel in bulk als op single-molecule niveau.Om de kinetiek van de synaptische binding van de T-celreceptor aan het PMHC af te leiden en onze op FRET gebaseerde strategie te verklaren die in onze algehele aanpak wordt gebruikt, beginnen we met de kristalstructuur van de T-celreceptor of TCR, hier in het blauw, terwijl deze bindt aan het antigeen, het peptide-geladen MHC-molecuul of PMHC, weergegeven in geel en rood. We introduceren ook een single-chain fragment van de variabele domeinen van een T-celreceptor bèta-reactief antilichaam, aangeduid als age 57. Voor kwantitatieve FRET-gebaseerde metingen is het noodzakelijk om zowel de FRET-donor, in ons geval het single-chain fragment, als de FRET-acceptor, het PMHC, op een site-specifieke manier te labelen.Dit is haalbaar voor recombinante eiwitten door de introductie van een ongepaarde cysteine, die vervolgens covalent kan worden gebonden aan maleïmide-geconjugeerde fluorforen. Zoals getoond, bevestigen we de FRET-donor Alexa Fluor 555 of Cy3 aan het single-chain fragment en de FRET-acceptor Alexa Fluor 647 of Cy5 aan de C-terminus van het MHC-gebonden peptide.De Indy-afstand zoals weergegeven in deze samengestelde structuur is ongeveer 41 angstrum, zelfs minder dan de eerste straal, de afstand van halve maximale energieoverdracht tussen de twee kleurstoffen. In onze experimenten gebruiken we planaire, op glas ondersteunde lipide dubbellagen als surrogaat-antigeenpresenterende cellen. Deze zijn gefunctionaliseerd met PMXC, het atory-molecuul B seven one en het adhesiemolecuul I chem one.Op deze manier kan beeldvorming worden uitgevoerd in de modus van totale interne reflectiefluorescentie, waarbij Fluor force in directe nabijheid van de interface wordt verlicht, waardoor de cellulaire achtergrond aanzienlijk wordt verminderd. Fret is alleen detecteerbaar wanneer met single chain fragment gelabelde TCRs binden aan in de laag ingebedde PM hcs. Dit stelt ons in staat om T-C-R-P-M-H-C binding te visualiseren en vervolgens de bindingskinetiek te berekenen in C twee correct gevouwen histo gene Tact.Extracellulaire delen van P71 en Ichem1 worden gezuiverd uit supernatten van insectencelculturen die geïnfecteerd zijn met het overeenkomstige BUC-virus. De zuivering wordt uitgevoerd in drie stappen, beginnend met nikkel-IMAC-affiniteitschromatografie, gevolgd door ionenuitwisselings- en grootte-uitsluitingschromatografie. His-getagde MHC-klasse II-heterodimeren worden tot expressie gebracht in E. coli als inclusielichaampjes en in vitro gerenatureerd bij 4 °C in aanwezigheid van een placeholder-peptide via snelle verdunning in redoxbuffer.Het ruimtehoudende peptide zal later worden gesplitst via blootstelling aan UV-licht. Correct gevouwen PMHC-complexen worden gezuiverd en geconcentreerd, waarna het ruimtehoudende peptide wordt gesplitst en bij pH 5,2 wordt vervangen door het fluorescente peptide.Het eindproduct is gezuiverd op basis van grootte. Het single-chain fragment wordt tot expressie gebracht met een vrije cysteïne als inclusielichaampjes in e coli, in vitro gevouwen via stapsgewijze dialyse en gezuiverd op basis van grootte. Vervolgens wordt het via de vrije cysteïne gelabeld met een geconjugeerde maleïmide-kleurstof en opnieuw gezuiverd op basis van grootte.Alle recombinante eiwitten worden tot slot gedialyseerd tegen PBS met 50% glycerol, geconcentreerd tot één milligram eiwit per milliliter en voor langdurige bewaring bewaard bij -20 °C. Gebruik de ratiometrische kleurstof URA2 om de intracellulaire calciumspiegels in T-cellen te meten, als middel om de stimulerende potentie van de lipide dubbellaag te verifiëren. Laad de T-celblasten met de URA2-AM-ester.Deze verbinding dringt de cellen binnen via de AM-groep, maar wordt vervolgens vastgehouden door de werking van esterasen, die het AM-gedeelte afsplitsen. Voeg fira 2:00 AM toe aan ongeveer 3 miljoen T-cellen tot een eindconcentratie van vijf microm MO per liter. Verplaats de cellen van de 24-wells plaat naar een nieuwe buis en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Was de cellen één keer in imaging-buffer die Hanks-gebalanceerde zoutoplossing bevat, inclusief calcium en magnesium, en 1% albumine. Gebruik een geautomatiseerd, UV-compatibel omgekeerd microscoopsysteem om intracellulair calcium te monitoren. Start het timing-protocol en voeg minimaal twee geladen T-cellen toe aan de gefunctionaliseerde lipide dubbellaag die in focus op de objecttafel van de microscoop is geplaatst; neem op regelmatige tijdsintervallen een DIC-beeld en twee fluorescentiebeelden op, geëxciteerd met UV-licht van 340 en 380 nanometer.Onmiddellijk na het maken van contact met de dubbellaag vertonen T-cellen verhoogde calciumgehaltes, zoals afgelezen door de URA two ratio 15 minuten na aanvang van de run. Voeg een blockerend antilichaam toe aan de cellen dat alle PMHC-antigenen verzadigt. Als gevolg hiervan dalen de intracellulaire calciumgehaltes naar die van de niet-geactiveerde staat, die later als referentie dienen.Zodra de niveaus van het blokkerende antilichaam zijn afgenomen tot een waarde die de niet-geactiveerde staat weerspiegelt, welke we voor FRET-metingen normaliseren naar één, moeten de T-cellen voor elk experiment worden gekleurd met een TCR-reactieve single-chain fragment FRET-probe. Breng ongeveer 1 miljoen cellen over naar een buis en centrifugeer deze bij 400 G. Giet het medium af en verwijder de resterende mediumdruppels die aan de binnenwanden kleven met een papieren handdoek. Dit garandeert een minimaal incubatievolume van ongeveer 30 µL, zoals eerder vermeld.De FRET-probe wordt bewaard bij een concentratie van 1 mg/mL in 50% glycerol bij -20 °C. De probe is plaatsspecifiek gelabeld met ofwel Alexa Fluor 555 of Alexa Fluor 647, met een fluorofoor-proteïneratio van 1:1. Voeg 0,3 µL van de probe toe aan de cellen. Tik het pellet voorzichtig enkele keren aan en incubeer de cellen gedurende 20 minuten op ijs.Was de cellen in ijskoude imagingbuffer. Herhaal deze wasprocedure één keer. Incubatie, centrifugatie en bewaring bij lage temperatuur zorgen ervoor dat T-cellen de fluorescente probe niet internaliseren terwijl ze eraan worden blootgesteld.Dit zou leiden tot een verhoogde achtergrondfluorescentie. Bovendien verliezen T-cellen de probe in de kou niet tijdens het wassen en de opslag voordat de kamer met de bilair op de microscoopstage-exchange wordt geplaatst. Vervang de PBS opeenvolgend door imaging-buffer en voorkom te allen tijde dat de bilair aan de lucht wordt blootgesteld, aangezien dit de bilair zou vernietigen.Om de cellulaire achtergrond te verminderen, maken we gebruik van turf-illuminatie. Hiervoor positioneren we de excitatiestraal in een kritische hoek waarbij totale interne reflectie optreedt. Schakel de excitatie uit, zet het brede licht aan, voeg de T-cel toe aan de ltec-kamer en laat ze bezinken op de lipidelaag.Schakel de excitatie in en focus op een niet-turf verlichtingsveld. Het celmembraan is zichtbaar als een ring langs de optische as in elk brandvlak; bij turf is enkel het basale membraan in contact met de dubbellaag waarneembaar. Brandvlakken daarboven worden niet langer geëxciteerd en zijn daarom niet zichtbaar.Het timingprotocol begint met rode en groene excitatiepulsen voor de beeldvorming van PMHC en TCR, gevolgd door een rode bleach-puls om de P-M-H-C-F acceptor te ablateren. Een groene puls voor de beeldvorming van de TCR na F-acceptorbleaching, en een rode puls om de ablatie van de F-acceptor te verifiëren, worden uitgevoerd op een subseconde tijdschaal met de kortst mogelijke vertraging tussen de eerste en de tweede groene pulsen. Optioneel kan er aan het begin een DIC-beeld worden verkregen; tweedelige beeldsplitsing maakt gelijktijdige detectie van het fed-donor- en fed-acceptorkanaal mogelijk.De excitatie van de gefedde acceptor laat de accumulatie van P HCS in de T-celsynaps zien. Deze preble-afbeelding bevestigt de aanwezigheid van pmcs en duidt op reeds TCR-gemedieerde PMHC-binding. Opwindend. De gefedde donor geeft aanleiding tot beelden in beide kanalen.Het signaal van het gevoede donorKanaal neemt tot op zekere hoogte in intensiteit af door energietransfer naar het F-acceptorkanaal. Het signaal van het FRET-acceptorkanaal bestaat uit FRET-bleedthrough van de gevoede donor en kruisexcitatie van de FRET-acceptor. Desalniettemin zal dit beeld niet voor analyse worden gebruikt.In het huidige protocol volgt een snelle bleekstap die alle geaccepteerde fluoro-foren elimineert. De intensiteit van het F-donorbeeld na acceptabel bleken is nu hersteld naar hogere niveaus zonder intensiteitsverlies in het FRET-kanaal.De volgende FRET-acceptorverwachting verifieert het volledige bleken van de F-fat-acceptor. Laten we inzoomen op de synaps om het herstel van de fed-donor te kwantificeren. Bepaal de gemiddelde achtergrondintensiteit als een constante, ongeacht de FRET-acceptor.Voer fotobleken uit en bepaal vervolgens de gemiddelde intensiteit van de synaps en die van een representatief TCR-cluster. De FRET-opbrengst wordt vervolgens berekend door het verschil voor en na de ablatie van de acceptor te normaliseren. In ons voorbeeld meten we 16% FRET voor de gehele synaps en 26% FRET voor de representatieve cluster.De opbrengsten van TCR-cluster-fretting zullen later worden omgezet in TCR-bezettingen, die leiden tot tweedimensionale synaptische dissociatieconstante-gegevens op enkelmolecuulniveau. Dit stelt ons in staat om de kinetiek van de synaptische TCR-peptide-MHC-binding af te leiden voor enkelmolecuul-FRET-experimenten. We gebruiken dezelfde reagentia en laboratoriumstrategie als voorheen.Om echter te garanderen dat we inderdaad de interactie tussen een enkele TCR en een enkel peptide MHC waarnemen, kiezen we ervoor om aan het volgende criterium te voldoen. Een kandidaat-event voor een enkelmolecuul-FRET moet colloquialen met het enkele FRET-acceptormolecuul of FRET-donormolecuul. Hier gebruiken we een enkele pMHC als FRET-acceptormolecuul om het enkelmolecuul-karakter van het waargenomen FRET-event te verifiëren, maar de omgekeerde redenering.Het gebruik van fed-acceptoren in hogere knoppen en Fred-donoren in lage knoppen is zeker een optie. We stellen T-cellen die in contact komen met een stimulerende lipidenlaag gewoonlijk bloot aan excitatie van 514 en 647 nanometer; sequentiële en repetitieve excitatie van donor en acceptor met een minimale tijdvertraging van één milliseconde wordt gevolgd door een vertragingstijd. Deze kan worden aangepast aan de vereisten van het experiment.Om een voldoende sterk fluorescent signaal te verkrijgen voor de detectie van een enkele kleurstof binnen milliseconden na excitatie, moeten we hoge excitatievermogensdichtheden toepassen die variëren tussen één en vijf kilowatt per vierkante centimeter. Vanwege fotobleken daalt het aantal zichtbare PMHC fret-acceptormoleculen snel naar een niveau waarop individuele fret-acceptor-fluorescentiekrachten onderscheidbaar worden in een dubbellaag met 30 of meer gelabelde PMCS per vierkante micron. Een voorbeeld wordt hier getoond voor een totale tijdsvertraging van 42 milliseconden.Een enkel FRET-event, gemarkeerd met de rode cirkel, wordt zichtbaar in het tweede en derde tijdspunt. Het co-lokaliseert met een enkel S5-molecuul, gemarkeerd met een groene cirkel. In dit voorbeeld heeft het waarneembare FRET-event een traceraaplengte van twee; verzamel meer enkelvoudige moleculaire FRET-traces, zoals weergegeven in de tabel in some 128 traces.Bereken vervolgens de complementaire cumulatieve som van de traces, zoals aangegeven door de groene getallen, en normaliseer deze; zet de genormaliseerde waarden uit in een grafiek en fit deze met een mono-exponentiële functie. De verwachtingswaarde is iets meer dan 1,5 timeframes. Deze waarde is afhankelijk van TCR-peptide-, MHC-binding en fotobleaching; om onderscheid te kunnen maken tussen deze twee bijdragen, moet de verwachtingswaarde daarom voor ten minste drie verschillende tijdstippen worden berekend.Zet nu alle verwachtingswaarden uit tegen hun respectieve tijdvertragingen en fit de datapunten aan de getoonde functie met de hier aangegeven levensduur van 2,12 seconden en de verwachtingswaarde voor fotobleken f Fred. Het herstel van de donor na acceptabele bleking, zoals hier en eerder in meer detail getoond, kan worden gebruikt om in slechts enkele stappen de tweedimensionale dissociatieconstanten te bepalen zoals deze effectief zijn binnen de immunologische synaps.Hier richten we onze analyse op TCR-engagement en TCR-clusters waar de binding van T-C-R-P-M-H-C het meest prominent is. Zoals blijkt uit de getoonde metingen variëren de F FRED-opbrengsten aanzienlijk voor individuele TCR-clusters.Het vermenigvuldigen van F fred met de proportionaliteitsfactor C levert de TCR-bezetting op, een term die de verhouding beschrijft tussen het aantal gebonden PMHC-TCR's en hun totale aantal. C moet eenmaal worden bepaald voor een specifieke set fre-paren en het gebruikte FRE-systeem. Aan het einde van deze presentatie leggen we in meer detail uit hoe C bepaald kan worden, wat bijvoorbeeld het gebruik van SI drie en SI vijf inhoudt, specifiek geplaatst op het TCR R reactieve enkelstrengs antilichaamfragment en de C-terminus van het aan MHC gebonden peptide. Dit bedraagt ongeveer twee synaptische, tweedimensionale dissociatieconstanten die kunnen worden berekend uit de TCR-bezetting, aangeduid als A, en de initiële dichtheid van pmcs aanwezig op de lipide bilaag.De getoonde relatie is afgeleid van de wet van massawerking en wordt in meer detail toegelicht in het artikel dat bij deze video hoort. In ons voorbeeld bedraagt de initiële dichtheid van pmcs 30 moleculen per vierkante micron. Dit leidt tot een distributie van 2D kds, die effectief zijn in de T-celsynaps met een mediaanwaarde van ongeveer 34 moleculen per vierkante micron.De on-rate distributie kan worden berekend uit de synaptische 2D KD-distributie en de bijbehorende off-rate, hier 0,41 per seconde, zoals bepaald via single-molecule FRET-trace analyse bij 24 °C. De mediaanwaarde is ongeveer 0,01 vierkante micron per molecuul per seconde. Samenvattend maken FRET-metingen tussen TCR en peptide-MHC een uitgebreide analyse mogelijk van alle kinetische parameters die de reactiedynamiek in C2 beschrijven.Deze methodologie kan in principe worden gegeneraliseerd naar de analyse van andere receptor-ligandinteracties, aangezien deze integraal kunnen zijn voor cel-celherkenning. Tot slot bespreken we hoe de constante C experimenteel kan worden afgeleid, welke nodig is om vetopbrengsten om te rekenen naar TCR-bezettingen. Deze procedure hoeft slechts eenmaal te worden uitgevoerd.De bepaalde constante C kan vervolgens worden toegepast voor alle volgende experimenten waarin hetzelfde FRET-systeem met dezelfde fluorforen wordt gebruikt. In deze procedure hebben we in essentie de FRET-opbrengsten, gemeten in individuele TCR-clusters via donorherstel na fotoblekken van de acceptor, gekoppeld aan de overeenkomstige intensiteitswaarden die in het gesensitiseerde FRET-kanaal zijn gedetecteerd. Zoals eerder besproken, wordt de FRET-opbrengst bepaald aan de hand van de achtergrondgecorrigeerde FRET-donor kanaalbeelden vóór en na ablatie van de FRET-acceptor.Het gesensibiliseerde FRET-kanaal moet worden uitgelijnd met het F-donorkanaal en X- en Y-as, en gecorrigeerd worden voor achtergrondruis. FRET-donor bleed-through en FRET-acceptor kruisexcitaties, zoals hier getoond. Een gedetailleerde beschrijving van hoe men kan corrigeren voor FRET-donor bleed-through en FRET-acceptor kruisexcitaties wordt in het artikel gegeven.Bereken nu, ter begeleiding van deze video, voor elk TCR-cluster de verhouding tussen het bug-signaal van de gecorrigeerde fret-afbeelding en de bijbehorende gecorrigeerde fret-donorfoto. Bepaal het gecorrigeerde gemiddelde signaal voor enkele fret-donoren en enkelvoudige moleculaire fret-gebeurtenissen en bereken de verhouding. De TCR-bezetting wordt vervolgens afgeleid door beide verhoudingen met elkaar te vermenigvuldigen.Zet nu de bepaalde FRET-opbrengsten voor individuele TCR-clusters uit tegen hun TCR-bezetting. C wordt vervolgens bepaald via lineaire regressie, zoals hier wordt getoond. In ons voorbeeld komt dit neer op ongeveer twee.Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om een proteïne-gefunctionaliseerde lipide dubbellaag in combinatie met fluorescentiemicroscopie van enkelvoudige moleculen te gebruiken om de synaptische bindingskinetiek tussen PMHC en TCR te meten. Alle noodzakelijke stappen, inclusief proteïneproductie, T-celmarkering en de uiteindelijke FRET-metingen, werden besproken. Bovendien werd de beeldanalyse in detail getoond, waaruit T-celactivatiecurven en FRET-waarden voortvloeien.Ten slotte is de methodologie onderliggend aan de bepaling van de kinetische on- en off-rates aangetoond. Een analoge aanpak kan in principe worden gebruikt om andere interacties tussen synaptische receptoren en liganden te bepalen, hoewel passende aanpassingen mogelijk noodzakelijk kunnen zijn.

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Methoden voor het bestuderen van mitochondriale bio-energetica onder fysiologisch relevante substraatconcentraties in immuuncellen zijn beperkt. We bieden een gedetailleerd protocol dat gebruik maakt van fluorespirometrie met hoge resolutie om veranderingen in de reactie van het mitochondriale membraanpotentieel op de energievraag in menselijke T-cellen, monocyten en perifere mononucleaire cellen te beoordelen.

Fluorespirometrie met hoge resolutie om dynamische veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal in menselijke immuuncellen te beoordelen

Leer hoe je TCR-pMHC-bindingskinetiek in situ meet met FRET-microscopie in de immunologische synaps. Deze methode kwantificeert affiniteit, off-rate en on-rate op bulk- en single-molecule niveau.

Het meten van TCR-pMHC Binding

Meer video's verkennen