Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

In deze video laten we zien hoe biofunctionaliserede planaire ondersteunde lipide dubbellagen worden geprepareerd en gekarakteriseerd. We zullen ook in detail de architectuur beschrijven van een total internal reflection-microscoop met mogelijkheden voor detectie van enkelvoudige moleculen. We zullen de excitatievermogensdichtheid, de vloeibaarheid en de proteïnedichtheid van de lipide dubbellaag meten.

Laten we beginnen met de korte inleiding tot de op vlak glas ondersteunde lipide dubbellaag. Wanneer kleine unilamellaire vesikels een schoon glasoppervlak raken, knappen ze open en verspreiden ze zich om een aaneengesloten lipide dubbellaag te vormen. Op een waterkussen kiezen we doorgaans voor palm-materiaal.

Olefosfocholine of POPC is het dominante lipide omdat het vloeibare lipide-dubbellagen vormt bij kamertemperatuur en 37 °C. Voor functionalisatie voegen we nikkel-antox toe, een synthetisch lipide met een nikkelchelaterende kopgroep, dat polyhistidine-tag-eiwitten bindt. Denk hierbij aan het co-stimulerende molecuul B7-1, het adhesiemolecuul ICAM-1 en het fluorescent gelabelde, peptide-geladen MHC-molecuul voor T-celherkenning, zoals hier getoond; dit dubbellaagsysteem kan echter in principe worden ingezet om geheel andere processen in diverse biologische systemen aan te pakken.

Vanwege de aard van het planaire systeem kunnen fluorescentie-events worden gemonitord in de modus van totale interne reflectie, wat de cellulaire achtergrond aanzienlijk vermindert en zeer geschikt is voor fluorescentiemicroscopie van enkelvoudige moleculen. Voor de lipidepreparatie zijn de lipiden POPC en nikkel-antiox in chloroform en een schone rondbodemkolf nodig. Los de lipiden op in de gewenste verhouding in chloroform en droog deze onder vacuüm zoals hier getoond. Na een nachtelijke behandeling in hoogvacuüm vormen de lipiden een film aan de binnenzijde van de kolf. Gebruik voor de rehydratatie van de lipiden ontgaste PBS door 10 milliliter van de ontgaste PBS toe te voegen aan het gedroogde lipidemengsel.

Niet mengen. Vul de kolf nu met een inert gas zoals stikstof of argon om lipidoxidatie te voorkomen en draai de kolf. De lipiden vormen een melkachtige suspensie.

Neem een kleine monsterhoeveelheid als blanco voor de spectrofotometer om gasuitwisseling tijdens de volgende stap te voorkomen. Het is zeer belangrijk om de kolf met de lipidsuspensie zorgvuldig af te sluiten. Gebruik een hittebestendige plakband, bijvoorbeeld autoclaafband, om luchtbescherming te waarborgen tijdens de fysieke vorming met gebruik van een gesloten ultrasoonbad.

Nadat de kolf is gemonteerd, wordt de sonicatieprocedure gestart bij een maximaal vermogen van 170 watts. Soniceren gedurende 60 minuten. Door de fysieke vorming is de troebeling aanzienlijk afgenomen.

Dit kan worden geverifieerd door spectrofotometrie bij 550 nanometer. Gebruik het aliquot dat vóór de sonicatie is afgenomen als blanco. De optische dichtheid bij 230 nanometer, die indicatief is voor de lipidquantity, moet constant blijven.

Hier vullen we kleine ultracentrifugatiebuisjes met één milliliter vesicle-suspensie en plaatsen deze in een rotor met vaste hoek van een tafelmodel ultracentrifuge. Het is zeer belangrijk om alleen kleine unilamellaire vesicles te gebruiken voor de bereiding van de dubbellaag. Grotere en dichtere multilamellaire vesicles, die ook tijdens sonicatie worden gevormd, beïnvloeden de vloeibaarheid van de dubbellaag en moeten daarom worden gepellet en door centrifugatie worden verwijderd.

Ten eerste centrifugeren we gedurende één uur bij 150.000 G bij kamertemperatuur. Het resulterende supernatant wordt vervolgens nog acht uur gecentrifugeerd bij 288.000 G bij vier graden Celsius. Glazen plaatjes moeten zeer schoon zijn voordat lipidevesikels zich daarop kunnen verspreiden om een aaneengesloten en vloeibare dubbellaag te vormen.

Hiervoor plaatsen we dekglasjes in een Teflon-houder, die we vervolgens in een glazen vat plaatsen. Neem grote voorzorgsmaatregelen door een veiligheidsbril, beschermende handschoenen en een laboratoriumjas te dragen en werk in een zuurkast. We voegen één deel 30% waterstofperoxide toe, gevolgd door drie delen geconcentreerd zwavelzuur om zeer reactief en oxidatief peroxymonosulfuurzuur te vormen.

Dit mengsel reageert heftig met organische stoffen, waaronder die van de huid, ogen en kleding. Het warmt onmiddellijk op. Incubeer de coupes gedurende 30 minuten.

Pak het dekglas vast met een pincet. Was het zuur grondig af aan beide zijden van het schone dekglas met gedestilleerd water of hoogwaardig gedeïoniseerd water. Plaats het glas vervolgens op een Teflon-standaard en laat het niet langer dan 10 minuten drogen om meerdere individuele lipide dubbellagen tegelijkertijd te kunnen produceren. We lijmen de gedroogde dekglazen vast met snelhardende lijm.

Tweecomponenten epoxylijm voor een LabTech-kamer met acht of 16 putjes. Verwijder eerst voorzichtig het oorspronkelijke lept-glazen dekglas uit het frame. Meng de twee lijmcomponenten in een verhouding van één op één.

Verdeel het gelijkmatig in de onderste groeven van het kamerframe. Plaats het schone dekglas op de met lijm bedekte onderzijde van het kamerframe. Zorg ervoor dat de lijm gelijkmatig is verdeeld tussen het glazen objectglas en het plastic frame.

Laat de lijm 30 minuten uitharden. Verdun de fysieke lipidesuspensie in PBS in een verhouding van 1 op 10 en filtreer deze door een 0,2 micron filter; breng 120 microliters van deze verdunning aan in elke well van een acht-well chamber of 60 microliters in elke well van een 16-well chamber. Zorg ervoor dat het gehele glasoppervlak bedekt is en wacht 20 minuten.

De dubbellaag is nu gevormd. Om resterende lipiden te verwijderen, spoelt u elke put af met 30 milliliters PBS. Vermijd onder alle omstandigheden blootstelling van het glasoppervlak aan lucht. Dit zou de dubbellaag onmiddellijk vernietigen. Om ervoor te zorgen dat elke put hetzelfde volume buffer bevat voor de volgende stap van proteïnedecoratie, vult u elke put volledig en verwijdert u de vloeistofkoepel.

Verwijder 330 µL. Hierdoor blijft er ongeveer 350 µL in elke put achter. Om de dubbellaag met eiwitten te functionaliseren, bereidt u een mastermix voor met polyhistidine-getagde eiwitten naar keuze en voegt u 50 µL hiervan toe aan elke put.

Eiwitten binden aan de nikkel-anti-kopgroep van het donkere lipide om reproduceerbare resultaten te garanderen; meng grondig maar voorzichtig en incubeer altijd 60 minuten om ongebonden eiwitten te verwijderen. Was opnieuw met 30 milliliters PBS. Laten we ons nu richten op de microscopiehardware.

Ten eerste illustreren we de vereisten van totale interne reflectiemicroscopie voor objectief-gebaseerde TIRF-microscopie. Er is een olie-immersie-objectief met een hoge numerieke apertuur nodig. De inkomende laser-excitatiebundel wordt gereflecteerd door de dichroïsche spiegel en via een set van twee of drie lenzen uitsluitend op het achterste brandvlak van het objectief gefocust.

Vervolgens leidt het laserlicht het objectief als een gecollimeerde bundel langs de optische as. Op deze manier wordt het fluorescente preparaat in de gehele diepte belicht. Wanneer u de bundel loodrecht op de optische as verplaatst, blijft de bundel gecollimeerd, maar verlaat deze het objectief onder een hoek.

Wanneer u verder verschuift, zult u op een bepaald punt de kritische hoek bereiken waarbij de straal volledig wordt gereflecteerd op de interface tussen het glazen dekglas en het preparaat. De intensiteit van de resulterende evanescente golf neemt exponentieel af, waardoor alleen de onderste lagen, die zich in de directe nabijheid van de interface bevinden tot enkele honderden nanometers, worden geëxciteerd. Nu illustreren we hoe u de laserstraal handmatig in het achterste brandvlak van het objectief kunt focussen.

Door gebruik te maken van drie of twee lenzen wordt met de eerste twee lenzen de diameter van de laserstraal vergroot. De verhouding tussen hun brandpuntsafstanden bepaalt de grootte van de belichtingsspot in het objectvlak. Om te waarborgen dat de straal gecollimeerd blijft, dient de afstand tussen deze lenzen zo te worden ingesteld dat deze gelijk is aan de som van beide brandpuntsafstanden.

De derde lens wordt gebruikt om de verbrede bundel te focussen in het achterste brandvlak van het objectief. Omdat de brandpuntsafstand van deze lens moet aansluiten op de afmetingen van de microscoopbehuizing en die van een bijbehorende periscoop, moet deze in ons geval veel langer zijn, variërend rond de 75 centimeter. De afstand tussen lens twee en drie heeft geen invloed op de eigenschappen van de bundel.

Daarom kan de oneindige ruimte daartussen worden gebruikt om de bundel op een gedefinieerde manier te modificeren zonder vervormingen. U kunt bijvoorbeeld een diafragma plaatsen en precies op het objectvlak projecteren. In essentie kunt u hetzelfde bereiken met het gebruik van twee lenzen in plaats van drie.

Het systeem met twee lenzen is minder scherp gedefinieerd, maar introduceert minder lensaberraties. Eenvoudige kenmerken, zoals een diafragma, kunnen nog steeds zeer goed worden geïmplementeerd voor temporele modulatie. Een gas-, ijzer- of solid-state laser moet worden geplaatst voor een sluiter met een bereik in milliseconden, bijvoorbeeld een mechanische sluiter of een optische modulator.

Een goed alternatief is een diodelaser, die elektronisch gemoduleerd kan worden en geen externe sluiter nodig heeft. Twee spiegels zijn voldoende om de straal op elke gewenste plaats en in elke richting te richten. Zoals eerder besproken, worden de twee lenzen gebruikt om de straal te verbreden en deze te focussen op het achterste brandvlak van het microscoopobjectief.

We kunnen de bundel verplaatsen voor de turf-configuratie door de onderste spiegel van de periscoop op een optische rail te verschuiven. Voor beelddetectie gebruiken we een zeer gevoelige camera. Bijvoorbeeld, een electron multiplying charge coupled device of em CCD. Een tweede laserbundel met een andere golflengte kan in het bundelpad worden uitgelijnd.

Met het gebruik van spiegels en een dichroïsche overlay. Voor gelijktijdige detectie in twee kleuren plaatsen we een commercieel verkrijgbaar bundelsplitsingsapparaat in het emissiepad. Voor experimenten is het zeer nuttig om twee onafhankelijke excitatiebundelpaden aanwezig te hebben.

Bijvoorbeeld één voor turf-imaging en een tweede voor gerichte fotobleaching of activatie. Dit kan eenvoudig worden gerealiseerd door een set van 2 50 50 beamsplitters te implementeren. Zoals getoond in onze illustratie, zullen twee verschillende lens- en spiegelafstelsystemen leiden tot twee individuele bundelprofielen en bundelhoeken.

Bijvoorbeeld een verbrede straal voor beeldvorming in de turf en een meer gefocuste straal voor bleaching of activatie buiten de turf. Een diafragma kan in de straal buiten de turf worden geplaatst om de bleaching- of activatieplek nauwkeurig vorm te geven. Twee extra shutters, één voor elk straalpad, maken onafhankelijke controle mogelijk over het schakelen van de laserstraal, waardoor het objectief in een recht, niet-gekanteld pad blijft.

Zet de vermogensmeter aan en stel deze in op de overeenkomstige golflengte van de laser. Meet het vermogen van het laserlicht bij het objectief en noteer dit. Verplaats nu de spiegel achter de microscoop om de laserstraal bij het objectief in de turfpositie te kantelen.

Kijk nooit rechtstreeks in het laserlicht. In de rechterbenedenhoek ziet u het intensiteitsprofiel van de excitatielaser, zoals gevisualiseerd via de emissie van een dubbellaag versierd met fluorescerende eiwitten. Hier gebruiken we een vals-kleurweergave om regio's met verschillende intensiteiten te accentueren.

Meet de gemiddelde intensiteit van de achtergrond binnen een voldoende groot interessegebied. Deze waarde is afhankelijk van specifieke camera-instellingen, zoals EM-gain en uitleessnelheid, en moet van alle gemeten intensiteiten worden afgetrokken. Bepaal de gemiddelde intensiteit binnen het gehele verlichte gebied.

Kies een diameter die groot genoeg is zodat de intensiteitswaarden aan de periferie vergelijkbaar zijn met die van de achtergrondmeting van de camera; meet de gemiddelde intensiteit van het centrale gebied. Dit gebied definieert de region of interest waarin de microscopie-experimenten later zullen worden uitgevoerd. Trek nu de gemiddelde achtergrondintensiteitswaarde af van de intensiteiten van zowel het geëlimineerde als het centrale gebied.

Vermenigvuldig vervolgens de achtergrondgecorrigeerde intensiteiten met het overeenkomstige aantal pixels van de regio-omvang om tot de geïntegreerde intensiteiten te komen. Stel de geïntegreerde intensiteit van het belichte gebied in op één en bereken de fractie voor het centrale gebied. Het vermogen is gemeten met de vermogensmeter.

In ons geval is vijf milliwatt direct proportioneel aan de geïntegreerde intensiteit van het gehele verlichte gebied. Vermenigvuldig deze waarde met het vermogensfraction van het centrale gebied om het vermogen binnen het centrale gebied te bepalen. In ons voorbeeld is dit 1,15 milliwatt; de factor om het aantal pixels om te rekenen naar vierkante micron hangt af van de feitelijke pixelgrootte van de camera-chip en de vergroting van het emissiepad.

Dit kan eenvoudig worden bepaald met een micrometer-preparaat. In ons voorbeeld komt het centrale gebied overeen met 170.8 square microns. De vermogensdichtheid is het gemeten vermogen gedeeld door het oppervlak en is dus gelijk aan 1.15 milliwatt gedeeld door 170.8 square microns, oftewel 0.007 milliwatt per square micron.

Dat is 0,7 Kilowatt per vierkante centimeter. Om de vloeibaarheid van de dubbellaag te bepalen, voeren we een experiment uit voor fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP). Zoals te zien is in de video linksonder, maken we beelden van de fluorescente dubbellaag bij een lage vermogensdichtheid.

In de film rechtsonder ziet u de overeenkomstige lab-tech kamer op de microscoop. Vervolgens bleken we een cirkelvormig gebied met korte pulsen met een hoge vermogensdichtheid en monitoren we het herstel bij een lage vermogensdichtheid. Opnieuw biedt de montage een overzicht van het experiment voor verschillende tijdspunten, waarbij tijd nul overeenkomt met de bleekpulsen.

We kwantificeren de gemiddelde achtergrondgecorrigeerde fluorescentie-intensiteit binnen de gemarkeerde cirkel en normaliseren alle gemeten intensiteiten ten opzichte van de intensiteit aan het begin van het experiment. Vóór de bleach-pulsen plotten we de genormaliseerde intensiteitswaarden tegenover de tijd. De verzadigingswaarde vertegenwoordigt in ons geval de mobiele fractie van meer dan 90%. Maak eerst een afbeelding van de dubbellaag bij een lage excitatievermogensdichtheid.

Door bijvoorbeeld een optische dichtheidsfilter met een logaritmische attenuatiewaarde van twee te plaatsen, wordt het vermogen met een factor 100 verminderd. De belichtingstijd moet gedurende de gehele procedure constant zijn en voldoende om een enkele vloeistofkracht af te beelden bij de niet-geattenueerde vermogensdichtheid; in ons geval 10 milliseconden bij 0,7 kilowatt per vierkante centimeter. Gebruik een valse-kleurweergave om gebieden met verschillende intensiteiten te accentueren.

Kies één interessegebied waarin later metingen op enkelvoudige molecuulniveau zullen worden uitgevoerd en één gebied van dezelfde grootte. Bereken voor de achtergrondsubtractie de geïntegreerde intensiteit na aftrek van de achtergrond. Verwijder nu het optische dichtheidsfilter uit het pad van de excitatiebundel, bleach het gebied en maak een afbeelding.

Individuele fluorescentie-eenheden zullen diffunderen in het gebleekte gebied. Enkele fluorescentie-eenheden zijn diffractiebeperkt met een typische diameter van twee tot drie pixels; selecteer een regio van zeven bij zeven pixels rond elk enkel molecuulsignaal en een tweede regio vlakbij. Voor de achtergrondcorrectie is het belangrijk om uitsluitend het signaal van enkele fluorescentie-eenheden te kwantificeren.

Daarom is het raadzaam om eiwitten op de BI-laag te beelden met een verhouding tussen label en eiwit van minder dan één, of voor specifiek gelabelde eiwitten voor SAT. Zelfs bij een verhouding tussen label en eiwit van één, zoals getoond in ons voorbeeld, meten we de geïntegreerde intensiteiten voor beide regio's en trekken we de achtergrond af van het signaal. Neem het laatst waargenomen event in ons voorbeeld niet mee, aangezien er waarschijnlijk bleaching is opgetreden tijdens de belichting. We berekenen het gemiddelde van de gecorrigeerde signalen; in dit geval doen we dit voor één flu van vier, wat we over negen frames observeren.

Deze procedure moet echter voor ten minste enkele honderden enkelvoudige molecuulgebeurtenissen worden uitgevoerd. Laten we teruggaan naar ons oorspronkelijke dubbellaagsbeeld, waargenomen bij een verlaagde excitatievermogensdichtheid. De moleculaire dichtheid wordt bepaald door de geïntegreerde intensiteit van het interessegebied voor de lage excitatievermogensdichtheid te corrigeren door deze te vermenigvuldigen met honderd en te delen door de gemiddelde intensiteit van een enkel molecuul en het oppervlak.

We hebben te maken met een dichtheid van 421,4 Fluor-krachten per vierkante micron. In ons voorbeeld, met een lipide-proteïneverhouding van één, komt dit overeen met hetzelfde aantal moleculen per vierkante micron. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om een proteïne-gefunctionaliseerde lipide dubbellaag te prepareren en te karakteriseren met behulp van single-molecule fluorescentiemicroscopie.

Bovendien dient u bekend te zijn met de basisprincipes voor het aanpassen en upgraden van een standaardmicroscoop voor dit doel. We zullen deze methodologie later gebruiken om de bindingskinetiek van aan een dubbellaag gebonden antigeen aan celgebonden T-celreceptoren te bepalen, maar veel andere toepassingen op basis hiervan zijn zeker haalbaar.