Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen
31 oktober 2015
Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.
In deze video laten we zien hoe we bio functioneel gemodificeerde planaire ondersteunde lipide bilayers bereiden en karakteriseren. We beschrijven ook in detail de architectuur van een totaal interne reflectiemicroscoop met mogelijkheden voor detectie op eenmoleculair niveau. We meten de excitatie vermogensdichtheid, de vloeibaarheid en de eiwitdichtheid van de lipide bilayer.
Laten we beginnen met een korte inleiding over planaire glasondersteunde lipide bilayers. Wanneer kleine uni lamellaire blaasjes een schone glasoppervlakte tegenkomen, barsten ze open en verspreiden zich om een aaneengesloten lipide bilayer te vormen. Op een waterkussen kiezen we doorgaans voor palmmateriaal.
Oleoylfosfocholine of POPC is het overheersende lipide omdat het bij kamertemperatuur en 37 graden Celsius vloeibare lipide bilayers vormt. Voor functionele modificatie voegen we nikkel antiox toe, een synthetisch lipide met een nikkelchelerende kopgroep, die poly histamine tag eiwitten bindt. Bijvoorbeeld de co-stimulatoire molecuul B zeven een, het adhesiemolecuul, ICAM een, en het fluorescent gelabelde peptide beladen MHC-molecuul voor T-cel herkenning zoals hier getoond, maar dit bilayer systeem kan in principe worden gebruikt om volledig verschillende processen in een verscheidenheid van biologische systemen aan te pakken.
Vanwege de aard van het planaire systeem kunnen fluorescentiegebeurtenissen worden gemonitord in totale interne reflectiemodus, die de cellulaire achtergrond aanzienlijk vermindert en zeer goed geschikt is voor fluorescentiemicroscopie op eenmoleculair niveau Voor lipide bereiding heb je de lipiden, POPC en nikkel antiox chloroform nodig, en een schone ronde bodemkolf. Los de lipiden op in de gewenste verhouding en chloroform en droog ze onder vacuüm zoals hier getoond. Na hoge vacuüm behandeling overnacht vormen de lipiden een film aan de binnenkant van de kolf. Voor lipide rehydratie, gebruik Degas PBS bij 10 milliliter van de Degas PBS tot de gedroogde lipidemengsel.
Niet mengen. Om lipide oxidatie te voorkomen, vul je de kolf met een inert gas zoals stikstof of argon, draai de kolf. De lipiden vormen een melkachtige suspensie.
Neem een kleine steekproef als een blanco voor de spectrofotometer om gasuitwisseling tijdens de volgende stap te voorkomen. Het is erg belangrijk om de kolf met de lipidesuspensie goed te verzegelen. Gebruik een hittebestendige plakband, bijvoorbeeld autoclaaftape waarbij luchtbescherming tijdens fysische vorming met behulp van een gesloten ultrasone bad.
Na het monteren van de kolf, start je de sonicatieprocedure bij een maximaal vermogen van 170 watt. Soniceer gedurende 60 minuten. Vanwege de fysische vorming is de troebelheid aanzienlijk gedaald.
Dit kan worden geverifieerd door spectrofotometrie bij 550 nanometer. Gebruik de aliquot genomen vóór sonicatie als blanco. De optische dichtheid bij 230 nanometer, die indicatief is voor de lipide hoeveelheid, moet constant blijven.
Hier vullen we kleine ultra centrifugatiebuizen met één milliliter visueel suspensie en plaatsen ze in een vaste hoek rotor van een tafelcentrifuge. Het is erg belangrijk om alleen kleine uni laina blaasjes te gebruiken voor bilayer bereiding. Grotere en meer dichte multi laina blaasjes, die ook worden gevormd tijdens sonicatie, interfereren met bilayer vloeibaarheid en moeten daarom worden gepaleerd en verwijderd door centrifugatie.
Eerst centrifugeren we gedurende één uur bij 150.000 G bij kamertemperatuur. De resulterende snat wordt vervolgens gedurende aanvullende acht uur gecentrifugeerd bij 288.000 G bij vier graden Celsius. Glasvlakken moeten zeer schoon zijn voordat lipideblaasjes zich erop kunnen verspreiden om een aangrenzende en vloeibare bilayer te vormen.
Hiervoor plaatsen we dekglasjes in een Teflon kussen, dat we vervolgens in een glazen vat oefening. Wees uiterst voorzichtig met oogbescherming, beschermende handschoenen en een laboratoriumjas en werk in een chemisch kabinet. We voegen één deel 30% waterstofperoxide toe en vervolgens drie delen geconcentreerd zwavelzuur om een zeer reactieve en oxidatieve perio mono zwavelzuur te geven.
Dit mengsel reageert gewelddadig met organische stoffen, inclusief die van uw huid, ogen en kleding. Het verwarmt onmiddellijk. Incubeer de slides gedurende 30 minuten.
Pak het dekglas met een pincet. Was de zuur grondig af op beide kanten van het schone dekglas met W gedistilleerd of hoogwaardig niet-geïoniseerd water. Plaats vervolgens de slide op een Teflon stand en laat deze niet langer dan 10 minuten drogen om meerdere individuele lipide bilayers tegelijkertijd te kunnen produceren. We lijmen gedroogd dekglas met snel uithardend.
Tweekomponente epoxylijm op een acht wel of een zestien wel lab tech kamer. Verwijder eerst voorzichtig het originele lept glas plaatje uit zijn frame. Meng de twee lijmcomponenten in een verhouding van één op één.
Verspreid het gelijkmatig in de bodemgroeven van het kamerframe. Plaats het schone dekglas op de met lijm bedekte bodem van het kamerframe. Zorg ervoor dat de lijm gelijkmatig is verspreid tussen de glasplaat en het plastic frame.
Laat de lijm 30 minuten uitharden. Verdun de lipide fysieke suspensie in PBS één op tien en filter het door een 0,2 micron filter bij 120 microliters van deze verdunning in elk putje van een acht wel kamer of 60 microliters in elk putje van een zestien wel kamer. Zorg ervoor dat het hele glasoppervlak is bedekt en wacht 20 minuten.
De bilayer is nu gevormd Om residuele les kwijt te raken spoelt u elk putje met 30 milliliter PBS. Vermijd ten koste van alles luchtblootstelling van het glasoppervlak. Dit zou de bilayer onmiddellijk vernietigen om ervoor te zorgen dat elk putje hetzelfde volume buffer bevat Voor de volgende eiwitversieringsstap, vult u elk putje volledig en verwijdert u de vloeistof koepel.
Neem 330 microliters weg. Dit laat ongeveer 350 microliters binnen elk putje over om de bilayer met eiwitten te versieren, bereid een mastermix voor met poly histamine tag eiwitten naar keuze en voeg 50 microliters ervan toe aan elk putje.
Eiwitten binden zich aan de nikkel anti kopgroep van het don
Overzicht
Dit artikel demonstreert de voorbereiding en karakterisering van bio-functionele planaire ondersteunde lipide bilayers. Het schetst ook de architectuur van een totaal interne reflectiemicroscoop ontworpen voor detectie van enkele moleculen.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Planaire ondersteunde lipide bilayers zijn essentieel voor het bestuderen van membraaneiwitten.
- Functionalisering maakt specifieke eiwitinteracties mogelijk.
- Totaal interne reflectiemicroscopie minimaliseert achtergrondruis voor verbeterde beeldvorming.
- Fluorescent gelabelde eiwitten kunnen met hoge resolutie worden gevisualiseerd.
Doel van Studie
- Om een stabiele lipide bilayer voor te bereiden voor eiwitstudies.
- Om eiwitmobiliteit en dichtheid binnen de bilayer te karakteriseren.
- Om een ruisverminderde microscopieopstelling voor detectie van enkele moleculen te ontwikkelen.
Gebruikte Methoden
- Voorbereiding van lipide bilayers met behulp van kleine unilamelaire vesikels.
- Functionalisering met nikkel-chelerende lipiden voor eiwitbinding.
- Karakterisering van lipide bilayers door middel van sonicatie en centrifugatie.
- Implementatie van totaal interne reflectiemicroscopie voor beeldvorming.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle vorming van vloeibare lipide bilayers op glasoppervlakken.
- Karakterisering van eiwitbinding en mobiliteit binnen de bilayer.
- Demonstratie van effectieve detectiecapaciteiten van enkele moleculen.
- Totstandbrenging van een protocol voor reproduceerbare voorbereiding van lipide bilayers.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbaar platform voor het bestuderen van membraaneiwitten.
- Hoge resolutie beeldvormingstechnieken verbeteren ons begrip van eiwitdynamica.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor verschillende biologische toepassingen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Single molecule fluorescence microscopy on planar supported lipid bilayers enables direct visualization of membrane protein dynamics at near-native conditions, providing critical mechanistic insights for target validation in immunology and cell signaling. This approach reduces biological ambiguity by quantifying protein mobility, density, and interactions in a reproducible, noise-reduced format, supporting early-stage go/no-go decisions in discovery pipelines. The method’s compatibility with total internal reflection fluorescence (TIRF) allows scalable, label-efficient screening of protein-ligand or protein-protein interactions relevant to therapeutic target de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of protein binding and mobility in lipid bilayers functionalized with nickel-chelating lipids, supporting mechanistic interrogation of targets like ICAM-1 and MHC-peptide complexes.
- Operational Value: Uses recombinant polyhistidine-tagged proteins for specific, oriented immobilization via nickel-antiox lipids, ensuring reproducible presentation of therapeutic targets.
- Predictive Value: Quantifies protein density (e.g., 421 molecules/µm²) and mobile fraction (>90% in FRAP), providing biophysical benchmarks for target engagement and complex stability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates highly mobile, protein-functionalized bilayers in a standardized format via sonication, centrifugation, and controlled vesicle fusion, enabling batch-to-batch consistency.
- Quantitative Output: Measures single-molecule fluorescence intensities and diffusion characteristics, allowing detection of binding events and conformational changes at physiological relevance.
- Scalability: Compatible with multi-well chamber formats (8- or 16-well) using epoxy-anchored coverslips, supporting parallelization for ligand screening or mutant analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to immune synapse formation studies involving co-stimulatory molecules (B7-1) and adhesion molecules (ICAM-1), informing biologics or small molecule modulation strategies.
- Mechanistic De-risking: Enables real-time tracking of protein diffusion and binding kinetics, reducing uncertainty in target mechanism prior to cellular or animal model validation.
- Translational Continuity: Bridges purified protein biochemistry and cellular assays by maintaining native-like lipid environment and physiological protein densities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for membrane-associated proteins where native conformation and lateral mobility are critical to function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein clustering, diffusion, and ligand-induced changes in model membranes that mimic the plasma membrane.
- Screening: Enables assay development for binding affinity and kinetics using single-molecule sensitivity, with background suppression via TIRF illumination.
- Analytics: Provides integrated intensity measurements, diffusion coefficients, and mobile fractions that quantify target behavior under defined lipid compositions.
- Translational Research: Maintains relevance to physiological contexts by preserving protein orientation and mobility, facilitating extrapolation to cell-based systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse membrane proteins (e.g., receptors, adhesion molecules) across projects through standardized lipid formulation and functionalization chemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in membrane protein studies by providing direct, quantitative single-molecule data in a biomimetic environment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lipid hydration, sonication, centrifugation, and surface passivation steps, minimizing variability in bilayer formation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by enabling early biophysical characterization that informs downstream assay design and lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by delivering empirical data on protein stability, mobility, and ligand accessibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, sonication protocols, and surface chemistry to achieve uniform, fluid bilayers without multilamellar vesicle contamination.
- Depends on access to TIRF-capable microscopy with sensitive detection (e.g., EMCCD), laser alignment systems, and environmental controls for long-term imaging.
- Necessitates standardization of protein labeling density (e.g., His-tag:NIILS ratio ≤1) to avoid artifacts from overcrowding or aggregation during functionalization.
- Must account for lipid oxidation risks during preparation, mitigated by inert gas flushing and prompt use of sonicated suspensions.
- Limited to extracellular or peripherally associated membrane proteins; not suitable for transmembrane domain structural studies requiring native bilayer thickness or asymmetric lipid composition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:23
Introduction
1:36
Vesicle Preparation
4:22
Bilayer Preparation
8:12
Principles of Total Internal Reflection Microscopy
10:44
Architectural of the Microscopy System
12:41
Power Measurement
15:38
Measurement Bilayer Fluidity
16:39
Measurement Protein Density on the Bilayer
19:25
Conclusion
