High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

Het algemene doel van deze procedure is om de recalcitrantie bij thermochemische voorbehandeling en enzymatische hydrolyse tussen verwante biomassa-varianten te meten. Dit wordt bereikt door de biomassamonsters eerst voor te bereiden voor testen middels korrelgrootteverkleining en extractie van zetmeel en oplosbare suikers. De tweede stap bestaat uit het met hoge precisie doseren van de biomassa in thermochemisch compatibele high-throughput reactorplaten.

De monsters worden voorbehandeld in een stoomreactor. Vervolgens worden de monsters gedurende drie dagen digested met een standaard commerciële cellulase om de cellulose en hemicellulose te hydrolyseren. De laatste stap is de bepaling van de glucose en xylose die tijdens de enzymatische hydrolyse zijn vrijgekomen middels GO pod- en XDH-assays.

Uiteindelijk wordt high-throughput glucose- en xylosekwantificatie gebruikt om de relatieve suikervrijgave tussen monsters te bepalen op basis van gram suiker per gram startbiomassa. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden op laboratoriumschaal, zoals laboratoriumschaal voor-behandeling en enzymatische hydrolyse, is dat deze techniek gelijktijdig op honderden of zelfs duizenden monsters kan worden uitgevoerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van biomassa-conversie, zoals welke cultivars of varianten meer geschikt zijn voor conversie naar suikers en daaropvolgende producten.

De implicaties van deze techniek kunnen dus worden uitgebreid naar het begrijpen van de structuur en functie van de celwand, omdat de mutaties die we genereren in de biosyntheseweg van de celwand gescreend kunnen worden op structurele chemische veranderingen. Deze methode kan inzicht bieden in de recalcitrantie van plantencelwanden. Het kan ook worden toegepast op andere componenten van biomassaconversie, zoals studies naar enzymactiviteit en synergie.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode er moeite mee hebben, omdat het grote monstersets van biomassa-varianten omvat die op milligramschaal identiek en gelijktijdig behandeld moeten worden. Daarom zijn gespecialiseerde robotica en apparatuur vereist. Om de procedure te starten, brengt u ongeveer 250 mg voorheen gemalen biomassa over van een barcode-antistatische zak naar een genummerd theezakje; rol het theezakje voorzichtig op en zorg ervoor dat de uiteinden over de biomassa worden gevouwen om verlies tijdens het ontstijzelen en de extractie te voorkomen. Sluit vervolgens elk theezakje door het dicht te binden met vertind koperdraad en noteer het nummer van het theezakje voor elk gebarcodeerd monster.

Voeg 500 milliliters van een eerder bereide zetmeelverwijderingsenzymoplossing toe aan een plastic container. Voeg vervolgens 120 theezakjes toe aan de enzymbufferoplossing voor een batch-protocol. Na incubatie in een schudapparaat wordt de biomassa gespoeld en 30 minuten geweekt in enkele liters gedeïoniseerd water, na een grondige spoeling van de zetmeelvrije biomassa.

Om bufferszouten te verwijderen, worden de theezakjes in een socklit-kolom geplaatst voor extractie. Stel de socklit-reflux in met 95% ethanol en extraheer de monsters gedurende 24 uur. Zodra de extractie is voltooid, worden de theezakjes uitgerold en wordt de gedroogde biomassa teruggeplaatst in de oorspronkelijke barcodebuis.

Antistatische zakken. Breng ten minste 50 milligram van de gedroogde biomassa over naar een hopper met barcode. Scan de barcodes van de antistatische zakken en de ontvangende hopper om een nauwkeurige monsterregistratie te waarborgen. Nadat de hoppers op een robotisch weegapparaat zijn geplaatst, worden vijf milligram van de gedroogde monsters robotisch gewogen in zuurbestendig roestvrij staal.

Weeg drie replica's van elk monster af in 96-wells platen, verdeeld over de plaat om lokale variaties te minimaliseren. Voeg vervolgens 250 µL gedeïoniseerd water toe aan elke well en verzegel de platen met zelfklevende siliconen POLYTETRAFLUOROETHYLEEN of PTFE-tape. Doorboor de PTFE-tape bij elke stoompoort met een soldeertip van een achtste inch.

Klem voor elke plaat de platen stevig vast met glasvezelversterkte PTFE-pakkingen van 0,031 inch dik tussen de platen en lege platen aan de boven- en onderzijde van de stapel. Voorbehandel de monsters met een stoomreactor ingesteld op 180 °C gedurende 17,5 minuten. Koel de reactorplaten na afloop af tot 50 °C door deze te vullen met gedeïoniseerd water.

Wanneer de platen zijn afgekoeld, centrifugeert u deze in een swinging-bucket rotor op 1700 GS gedurende 20 minuten. Verwijder vervolgens de plafondfolie.

Voeg 40 µL van de eerder bereide 8% enzymvoorraadoplossing toe aan elke put. Nadat de plaat opnieuw is afgedicht met nieuwe PTFE-tape, wordt de afgedichte plaat in een magnetische plaatklem geplaatst. Meng de monsters voorzichtig door minstens 15 keer om te keren en incubeer gedurende 70 uur bij 50 °C. Na incubatie worden de reactorplaten gemengd en gecentrifugeerd.

Vervolgens wordt de vloeistofbehandelingsrobot gebruikt om de kwantificering van glucose en xylose uit te voeren via enzymgekoppelde colorimetrische assays: xylose-dehydrogenase (XDH) voor xylose en glucose-oxidase/peroxidase (GO POD) voor glucose. Het deck is ingericht met reservoirs met GO POD- en XDH-reagentia, evenals water voor verdunning en 96-kanaals 200 µL tiprekken voor elk reagens. Deze tips worden hergebruikt voor meerdere reactorplaten.

Het deck bevat ook wegwerptips van 200 microliter voor het verwijderen van water en de suikerstandaardeditie, evenals vooraf bereide suikerstandaarden. Vanuit de opslagcarrousel met HPLC-vials brengt de robot drie heldere microtiterplaten binnen, één voor het maken van verdunningen van het hydrolysemengsel en elk één voor de XDH- en GoPod-assays. De grijper verplaatst alle vier de platen naar posities op het deck.

Wegwerptips met 96 kanalen van 100 microliter worden vanuit het carrousel naar het deck gebracht voor gebruik bij het overbrengen van de reactor naar de verdunningsplaat en van de verdunning naar de XDH- en go pod-platen. Met behulp van de variabele achtkanals pipetteur wordt het water dat vóór de voorbehandeling is toegevoegd verwijderd uit de drie putjes in elke hoek van de reactorplaat om overdracht naar de verdunningsplaat te voorkomen. Aangezien deze 12 putjes worden gebruikt voor suikerstandaarden met de 96-kanals pipetteerkop.

Nadat de drie tips in elke hoek zijn verwijderd, wordt 180 µL water toegevoegd aan de wells van de verdunningsplaat. Na het wisselen van de tips worden de XD-, H- en go pod-reagentia vanuit hun respectievelijke reservoirs overgebracht naar de bijbehorende assayplaten met behulp van de 96-kanaals pipetteerkop.

Terwijl dit gebeurt, worden de suikerstandaarden toegevoegd aan de drie wells in elke hoek van de verdunningsplaat. Na het wisselen naar kleinere tips wordt de 96-kanaals pipetteerkop gebruikt om 20 µL hydrolysaat-supernatans over te brengen naar de verdunningsplaat, waarna de plaat drie keer wordt gemengd. Het monster dient nabij de bovenkant van de vloeistof te worden opgezogen om vervuiling van de tips door biomassa-deeltjes te beperken.

Na het mengen wordt er opeenvolgend 20 µL overgebracht. Gebruik hiervoor de 96-kanaals pipetteerkop naar de XDH- en go pod-platen. Nadat elke plaat door trier is gemengd, worden de sample tips reactor- en verdunningsplaten teruggeplaatst in een afvalrek in het carrousel; de XDH- en go pod-platen worden verplaatst naar een apart carrouselrek en één uur rusten voordat ze worden uitgelezen in de spectrofotometer, met gebruik van een ultraviolet-zichtbaar 96-wells plaatlezer.

Stel de gemeten golflengte in op 510 nanometer en registreer de absorbentie ten opzichte van een reagensblank. Stel vervolgens de gemeten golflengte op de platenlezer in op 340 nanometer en registreer de absorbentie met behulp van een klein spatel. Doseer ongeveer vier milligram van de geprepareerde biomassa in een roestvrijstalen cupje van 80 µL, ontworpen voor de autosampler van de massaspectrometer.

Maak met een standaard perforator handmatig glazen filterdiskjes uit glasvezelplaten van type ad zonder bindmiddel. Laad de monsters met een pincet in de rekken van de autosampler; laad de monsters willekeurig in de cups om bias door spectrometersdrift in de loop van de tijd te voorkomen. Nadat de kalibratie is uitgevoerd en de juiste parameters in de massaspectrometer zijn ingevoerd, start u de data-acquisitie en wacht u ten minste 60 seconden om voldoende gegevens te verkrijgen voor de verzameling van achtergrondspectra. Start ten slotte de geautomatiseerde autosampler-methode met een helium-draaggasstroomsnelheid van 0,9 liters per minuut.

Een voorbeeld van trends is een onderzoek naar de recalcitrantie van 755 natuurlijke varianten van poplar die bemonsterd zijn in het Pacifisch Noordoosten. De resultaten geven aan dat naarmate de verhouding tussen syringe en guil stijgt, de recalcitrantie afneemt tot een verhouding van ongeveer twee, waarna de verbetering van de recalcitrantie stagneert. Uitschieters zijn hier te zien waar het PT four CL one-gen was gedownreguleerd.

Bij populieren vertoonden verschillende van de honderd gescreende cultivar duidelijk een toename in recalcitrantie, wat blijkt uit de afname van de suikervrijgave. Verschillende tarwestro-variëteiten, geteeld op diverse locaties en geoogst na verschillende variaties in groeicondities, resulteerden in 20 onderscheidende populaties op basis van combinaties van de bovengenoemde variabelen. Deze monstersets zijn gemakkelijk te onderscheiden en duiden op positieve en negatieve variabelen.

Voor de pyrolyse van recalcitrante stoffen kan moleculaire bundelmassa-spectrometrie worden gebruikt om veranderingen in de samenstelling van de celwand te evalueren. Massaspectrale fragmenten worden toegewezen aan verschillende lignine-monomeren. Bij het vergelijken van een monster met een hoog ligninegehalte versus een hoog koolhydraatgehalte zijn de verschillen in de spectrale gegevens duidelijk zichtbaar.

Het gebruik van massaspectrometriegegevens, gekoppeld aan een hoofdcomponentenanalyse, wordt hier geïllustreerd. De plot van de loadings van de hoofdcomponenten kan helpen bij het identificeren van welke chemische kenmerken worden verklaard in de scores-classificatieplot, evenals het verduidelijken van welke kenmerken veranderen tussen de monsterclusters. Eenmaal beheerst, kan deze techniek worden gebruikt om wekelijks duizenden monsters te screenen, mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zo consistent mogelijk te zijn en alleen monsters binnen een gerelateerde set met elkaar te vergelijken.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor andere onderzoekers om te werken aan high-throughput screeningmethoden en andere gebieden met betrekking tot de recalcitrantie van plantencelwanden, met behulp van zaken als ionische vloeistoffen en alkalische voorbehandeling. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u grote monstersets biomassa op microschaal correct moet prepareren, hanteren en analyseren op verschillen in recalcitrantie met behulp van korrelgroottevermindering en extractie, thermochemische voorbehandeling en enzymatische hydrolyse. Houd er rekening mee dat werken met hoge druk, stoom en geautomatiseerde apparatuur uiterst gevaarlijk is en dat alle veiligheidsvoorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en het gebruik van veiligheidsinterlocks op alle apparatuur tijdens het uitvoeren van deze procedures.