Name: High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer hoe je high-throughput screening toepast voor biomassa-analyse met thermochemische voorbehandeling en enzymatische hydrolyse. Deze methode identificeert optimale grondstoffen voor biobrandstoffen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen stagiair Evelyn Von Neida bedanken die onschatbare inzichten heeft geboden over de voorbereiding van biomassamonsters voor beide hoogwaardige doorvoerlijnen die in dit manuscript worden besproken. Ondersteuning voor de ontwikkeling van dit werk en manuscript werd verstrekt door het BioEnergy Science Center. Het BioEnergy Science Center is een U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center ondersteund door het Office of Biological and Environmental Research in het DOE Office of Science. Het National Renewable Energy Laboratory (NREL) is een nationaal laboratorium van het US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, geëxploiteerd voor DOE door de Alliance for Sustainable Energy, LLC. Dit werk werd ondersteund door het U.S. Department of Energy onder Contract No. DE-AC36-08-GO28308 met het National Renewable Energy Laboratory.

1. High-throughput bepaling van glucose en xylose Opbrengsten Na enzymatische versuikering 9,29 <ol><li> Monstervoorbereiding (Malen, De-stijven, Extraction, voorbehandeling) <ol><li> Grind ten minste 300 mg van elk monster biomassa met een Wiley molen, zodat de deeltjes door een 20 mesh (850 urn) scherm. Transfer naar anti-statische zip-top zakken (meestal bar-code) en opnemen monster informatie aan de barcode database. </li><li> Voeg ongeveer 250 mg of meer van de grond biomassa uit de anti-statische zak naar een genummerde (met potlood, geen gebruik maken van inkt of marker) theezakje voorzichtig oprollen van de theezakjes, en zorg ervoor dat de uiteinden vouw over de biomassa om te voorkomen verlies tijdens de-stijven en extractie. </li><li> Wikkel het theezakje gesloten met tin beklede koperdraad. Noteer het theezakje nummer voor elke barcode monster. </li><li> Bereid de-stijven enzymoplossing van commerciële enzymen (gewoonlijk 0,25% (v / v) glucoamylase (~ 1600 AGU / L) en1,5% (v / v) alfa-amylase (KNU ~ 2900-S / L) in 0,1 M natriumacetaat (pH 5,0)). Bereid 16 ml per g bulk biomassa of 500 ml per 120 theezakje monsters. Opmerking: Ladingen kan verwijderen zetmeelgehalte van gemalen biomassa empirisch worden bepaald door het testen van zetmeel na digestie met verschillende enzymes en verhoudingen. </li><li> In een plastic container, voeg 16 ml van de stijven enzym oplossing per 1 g bulk gemalen biomassa. Voor een partij de-stijven protocol, voeg 120 theezakjes aan 500 ml van de buffer-enzymoplossing. </li><li> Incubeer in een schudder bij 55 ° C gedurende 24 (± 4) uur bij 120 rpm om mogelijke zetmeel te verwijderen. </li><li> Na de-de stijven incubatie, spoel en genieten van de biomassa in verschillende liter gedemineraliseerd water gedurende 30 min. Herhaal dit proces nog twee keer met buffer zouten die stoten (vorming van gasbellen in de oplossing die kan leiden tot een plotselinge en hevige stijging van het niveau van de oplossing, waardoor hete vloeistof ethanol cascade veroorzaken verwijderenuit het reactievat) tijdens de winning. </li><li> Na de uitputtende spoelen van de-de gesteven biomassa, plaats de theezakjes in de kolom Soxhlet voor de extractie. Nr huls is vereist voor deze stap. </li><li> Stel de Soxhlet reflux, met behulp van 95% ethanol en haal de monsters gedurende 24 uur. </li><li> Verwijder de theezakjes uit de Soxhlet reactor en verspreid in een enkele laag op een plat lade. </li><li> Laat de monsters een nacht drogen bij kamertemperatuur in een zuurkast. </li><li> Rol de theezakjes en de terugkeer van de gedroogde biomassa originele streepjescode van anti-statische zakken. Opmerking: De anti-statische zakken zijn efficiënt bij het verminderen van statische elektriciteit in de biomassa, verbetering van de rijeigenschappen. Als andere opslagopties worden gebruikt, kunnen aanvullende biomassa nodig zijn vanwege de biomassa vasthouden aan de zijkant van de opslaghouder. </li><li> Overdracht ten minste 50 mg van de gedroogde biomassa een barcode hopper (gebruik van meer materiaal is beter voor nauwkeurige dosering). Skunnen barcodes antistatische zakken en de stortbunker nauwkeurige sample volgen waarborgen. </li><li> Hoppers lading op vaste wegen robot, met veel aandacht voor de volgorde van de monsters in de rekken. Laad genoeg reactor platen om alle monsters bevatten en selecteer de afgifte-protocol gebaseerd op het aantal gebruikte platen. </li><li> Robot weegt 5 mg van de gedroogde monsters (± 0,3 mg) in zuurbestendig roestvrij staal 96-wells platen. Weeg 3 herhalingen van elk monster verdeeld rond de plaat aan een gelokaliseerde variaties te minimaliseren. </li><li> Omvat 8 control biomassa monsters van een goed gekarakteriseerde biomassa standaardmateriaal teneinde assayprestaties volgen. Voor meerdere platen, zal het gebruik van meerdere standaard biomassa hoppers deeltjesgrootte drift veroorzaakt door zeven in de hoppers dan herhaald doseren cycli te minimaliseren. Opmerking: In elke plaat, moeten er 24 monsters met 3 herhalingen, 4 blanks bestaande uit gedemineraliseerd water en enzymen, en 8 controls via de eerder gekarakteriseerde standaard biomassa. De 3 hoek putten van elk van de 4 hoeken van de plaat zijn gereserveerd voor de suiker normen. </li><li> Controleer leeg en suiker standaard putten voor de dolende biomassa deeltjes te verwijderen indien aanwezig. </li><li> Voeg 250 gl gedeïoniseerd water aan elk putje en de platen afdichten met silicone lijm-backed polytetrafluorethyleen (PTFE) tape. </li><li> Met behulp van een 1/8 &quot;soldeerbout tip, doorboren de PTFE-tape aan elkaar stoom poort (117 in totaal) voor elke plaat. Gebruik een leeg bord gestapeld op afgedichte reactor plaat als een gids en het beperken PTFE-film beweging. </li><li> Klem de platen goed af met 0,031 &quot;dik glasvezelversterkt PTFE pakkingen (geperforeerd met gaten voor stoom poorten) tussen de platen en de lege borden op de boven- en onderkant van de stapel. Behandel de monsters via stoom reactor ingesteld op 180 ° C gedurende 17,5 min of andere temperatuur / tijd-combinaties op basis van gewenste ernst. </li><li> Koel reactor platen 50 °; C door overstromingen met gedemineraliseerd water. </li></ol></li><li> Enzymatische versuikering <ol><li> Bereid een enzymatische versuikering oplossing bestaande uit 8% (v / v) enzymoplossing in 1,0 M natriumcitraat, pH 5,0. Bereid 5 ml per reactor plaat. Opmerking: Moet verdund worden moet worden bepaald op basis van activiteiten en eiwitgehalte van de specifieke voorraad enzymoplossing. </li><li> Wanneer de platen zijn koel, centrifugeer ze in een swinging bucket rotor bij 1500 xg gedurende 20 min. Verwijder afdichting film. Opmerking: Deze platen zijn zwaar en de centrifuge specificaties moeten worden gecontroleerd op compatibiliteit. </li><li> Voeg 40 ul van de 8% enzym voorraadoplossing aan elke well (70 mg enzym per gram biomassa). </li><li> Verzegelt met nieuwe PTFE-tape. Plaats verzegelde plaat in magnetische plaat klem. </li><li> Meng de monsters door omkeren (ten minste 15 maal) en incubeer bij 50 ° C gedurende 70 uur. </li><li> Wanneer de versuikering heeft gesloten, meng door inversie en centrifuge de platen bij 1500 xg gedurende 20 min. </li></ol></li><li> Sugar Assay <ol><li> Bereid een reeks van 6 glucose en xylose gecombineerd kalibratienormen in 0,014 M citraatbuffer (pH 5,0) van 0 tot 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 en 0,75 mg / ml aanbevolen) en 0-,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 en 0,6 mg / ml aanbevolen) respectievelijk glucose en xylose. </li><li> Bereid de glucose oxidase / peroxidase (goPod) en xylose dehydrogenase (XDH) reagens volgens de instructies in de kit. </li><li> Met behulp van een pipet, verwijder 200 ul van vloeistof uit de 4 hoeken putten en rand putten grenzend aan de hoek putten (12 in totaal putten) van de reactor plaat. </li><li> Met behulp van een pipet, afzien 180 ui gedeïoniseerd water aan elk putje van een 96-well polystyreen met vlakke bodem verdunning plaat. Geen water toe te voegen aan de 12 suiker standaard en hoek putten (verwijder deze tips bij gebruik van een 96-kanaals head). </li><li> Met behulp van een pipet, afzien 180 ul goPod reagens aan elk putje van de glucose test platen. </li><li> Met behulp van een pipet, afzien 180 ul XDH reagens aan elk putje van de xylose assay plaat. </li><li> Met behulp van een pipet 20 ul hydrolysaat fracties van de 96-well reactor plaat om de verwatering plaat. Pipet uit het bovenste gedeelte van de putten biomassa vaste stoffen en restvloeistof in de hoek putjes voorkomen. Meng door trituratie ten minste 10 cycli. </li><li> Met behulp van een pipet 110 ul van suiker normen, in tweevoud, op de hoek putjes van de verdunning plaat. </li><li> Met behulp van een pipet 20 pi fracties van de verdunning plaat om de glucose en xylose assay platen. Meng door trituratie. </li><li> Incubeer glucose en xylose testplaten bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Breken elk oppervlak luchtbellen zorgvuldig voor te lezen. Een warmte kanon even over het oppervlak van de plaat werkt goed. </li><li> Met behulp van een ultraviolet / zichtbare 96 putjes plaatlezer, stellen de gemeten golflengte 510 nm en noteer de absorptie tegen een blanco reagens.Deze meting bewaakt de vorming van quinonimine, dat evenredig is aan glucoseconcentratie. De glucoseconcentratie wordt berekend uit de kalibratiecurve gebaseerd op de calibratiestandaarden bereid in 1.3.1. </li><li> Met behulp van een ultraviolet / zichtbare 96 putjes plaatlezer, stellen de gemeten golflengte 340 nm en noteer de absorptie. Deze meting bewaakt de reductie van NAD + tot NADH, die evenredig is met xylose concentratie. De xylose concentratie wordt berekend uit de kalibratiecurve gebaseerd op de calibratiestandaarden bereid in 1.3.1. </li></ol></li></ol> 2. High-throughput Bepaling van Total en Lignine Lignine Monomeer content met behulp pyMBMS 28 <ol><li> Monstervoorbereiding <ol><li> Slijpen en haal de biomassa met behulp van de in de stappen 1.1.1 en 1.1.6-1.1.8 beschreven methoden. Dit geldt ook voor het slijpen en het extraheren van een set van standaarden als experimentele controles gebruiken. Opmerking: De pyMBMS MEASURements zijn niet deeltjesgrootte afhankelijk, dus als alleen met behulp van de pyMBMS protocol, moet de voorbereiding van biomassa worden uitgevoerd om het monster te passen in de monsterhouder, &lt;4 mm. </li><li> Met een kleine spatel afgifte ongeveer 4 mg (3 tot 5 mg de voorkeur) van de bereide biomassa in een 80 ui roestvrijstalen beker ontworpen voor de autosampler. </li><li> Zorg ervoor dat ten minste 10% van de monsters geanalyseerd zijn controlenormen zoals die verkrijgbaar bij de National Institute of Standards and Technology (suikerriet bagasse-8491; populieren-8492; pine-8493, of stro-8494). De standaard kan ook elke soort analoog aan de te analyseren monsters reeds gekarakteriseerd met behulp van standaard werkwijzen. </li><li> Willekeurig laden van de monsters in de auto-sampler bekers met een pincet om vertekening te vermijden wegens mogelijke spectrometer drift in de tijd. Noot: een randomisatie van de monsters zou de meting van alle samples eenmaal, gevolgd door een re-randomisatie omvattenvan de orde van de monsters een duplicaat metingen. Randomisatie programma&#39;s zijn online beschikbaar. </li><li> Met behulp van een standaard perforeren, handmatig glas filter discs van het type A / D glasvezel platen, zonder bindmiddel. Houd de ronde glasvezel filter met een pincet, centreren het over het monster cup, en duwen in het monster met behulp van een 3,5 mm inbussleutel om het materiaal in elke kop tijdens het experiment te beperken. </li></ol></li><li> Instrumental Protocol <ol><li> Kalibreer de massa spectrometer met een bekende standaard die piekintensiteiten over het gehele bereik van verbindingen die kunnen bestaan ​​voor de experimentele monsters over. Voor typische biomassa monsters gebruiken perfluortributylamine (PFTBA). </li><li> Stel het draaggas helium debiet 0,9 l / min onder toepassing van een gasmeter. </li><li> Stel de autosampler oven om een ​​pyrolysetemperatuur van 500 ° C en de interface temperatuur 350 ° C via de autosampler software. Opmerking: een 1/8 &quot;RVS verwarmdtransportleiding verpakt in verwarmingsband dat de autosampler verbinding met de massaspectrometer wordt via een warmte-controller bij 250 ° C. </li><li> Begin data-acquisitie op de massaspectrometer en wacht ten minste 60 seconden om voldoende gegevens voor de achtergrond spectra collectie te verkrijgen. </li><li> Start de automatische autosampler methode met de specificaties van 2.2.2. Opmerking: de auto-sampler daalt elk monster afzonderlijk in de auto-sampler oven. De totale data acquisitie is ongeveer 1,5 min; echter, pyrolyse van een typische 4 mg monster voltooid na 30 sec. </li><li> Recordbedrag iongehalte (TIC) van elk monster met behulp massaspectrometer software op scansnelheid 0,5 sec. Neem intensiteiten tussen m / z 30-450. Opmerking: Typische biomassa verbindingen gebruik zachte ionisatie op 17 eV. Het instrument kan grotere intervallen vanaf m / z 1 opnemen op 1000; zal echter scansnelheid worden beperkt door de computer CPU-kracht. </li><li> Verwijder de achtergrond van de spectra met behulp van de malijkse verbeteren functie in de software. Opmerking: gedeelte van de basislijn aan het begin van de gegevensverzameling A 60 scan wordt gebruikt om een ​​gemiddelde achtergrondwaarde te berekenen. Dit gemiddelde achtergrondspectra wordt uit het experimentele monster spectra automatisch in de massaspectrometer software. </li><li> Importeren enkele kolom tekstbestand door de massaspectrometer software die de spectrale gegevens voor elk monster in een databaseprogramma breiden en alle monsters in een gegevensbank. Voeg eventueel van toepassing metagegevens naar de spreadsheet. Importeer de opgemaakte gegevens (spreadsheet / CSV-bestand) in een statistisch softwarepakket en betekenen normaliseren van de spectra om rekening te houden met variatie in de gepyrolyseerde monster massa. </li><li> Gebruik een statistisch softwarepakket a principal component analysis (PCA) uitvoeren met het spectrale gegevens groepering van de gerepliceerde standaardmonsters gebruikt bij de metingen analyseren en te evalueren welke pieken integraal indeling van chemische zijnverbindingen in de belasting 28 te plotten. Opmerking: PCA groepen de monsters op basis van de gelijkenis van hun spectra en maakt een controle van de normen experimentele fout meten vanwege instrument drift tijdens de run. </li><li> Om de lignine syringyl (S) / guaiacyl (G) verhouding berekenen som van de gebieden van de S pieken (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 en 210) en delen door de som van G pieken bij 124, 137, 138, 150, 164 en 178. </li><li> Om de totale lignine-gehalte te berekenen, tel de lignine pieken met m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 en 210. </li><li> Berekenen van een correctiefactor voor het schalen van de pyMBMS meting om een ​​standaard methode voor het schatten van de totale lignine, zoals Klason lignine. Verdeel de Klason lignine waarde van de individuele norm door het totale ligninegehalte gemeten die standaard monster met behulp pyMBMS. </li><li> Pas deze correctiefactor al like-soorten in de dataset. Herhaal dit voor elk type biomassa geanalyseerd. Noot: De correctiefactor kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van de S / G van de biomassa geanalyseerd. </li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Billion-Ton+Update%3A+Biomass+Supply+for+a+Bioenergy+and+Bioproducts+Industry%22">U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry</a>. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).</li>
<li>Henry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Resources+for+Food%2C+Fuel+and+Conservation%22%5BJournal%5D)">Ch. 5.</a> Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).</li>
<li>Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+plant+biomass+resources+available+for+replacement+of+fossil+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil.</a> Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).</li>
<li>Furtado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+plants+for+biofuel+and+biomaterial+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Modifying plants for biofuel and biomaterial production.</a> Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).</li>
<li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).</li>
<li>Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Lignocellulosic+Biomass+Using+Analytical+Spectroscopy%3A+an+Evolution+to+High-Throughput+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques.</a> Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacidolysis+of+lignin%3A+comparison+with+acidolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Wood+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis.</a> J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).</li>
<li>DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+and+automatable+high-throughput+compositional+analysis+of+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).</li>
<li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+determination+of+glucan+and+xylan+fractions+in+lignocelluloses%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses.</a> Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).</li>
<li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignocellulose+recalcitrance+screening+by+integrated+high-throughput+hydrothermal+pretreatment+and+enzymatic+saccharification%5BTitle%5D)+AND+%22Ind.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification.</a> Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).</li>
<li>Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+high-throughput+screening+system+to+identify+cellulosic+biomass%2C+pretreatments%2C+and+enzyme+formulations+that+enhance+sugar+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).</li>
<li>Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+sugar+content+in+biomass+hydrolysates+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).</li>
<li>Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+corn+stover+composition+and+sources+of+variability+via+NIRS%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose+%28Dordrecht%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).</li>
<li>Tucker, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fourier+transform+infrared+quantification+of+sugars+in+pretreated+biomass+liquors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).</li>
<li>Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+multivariate+calibration+models+for+corn+stover+feedstock+and+dilute-acid+pretreated+corn+stover%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose+%28Dordrecht%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).</li>
<li>Ona, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+determination+of+wood+constituents+by+Fourier-transform+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Wood+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy.</a> J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).</li>
<li>Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+quantitative+method+to+assess+eucalyptus+wood+properties+for+kraft+pulp+production+by+FT-Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pulp+Pap.+Sci%22%5BJournal%5D)">A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy.</a> J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).</li>
<li>Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+biomass+analysis.+New+tools+for+compositional+analysis+of+corn+stover+feedstocks+and+process+intermediates+from+ethanol+production%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).</li>
<li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).</li>
<li>Chen, M., Zhao, J., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+different+chemical+pretreatments+of+corn+stover+for+enhancing+enzymatic+digestibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenergy%22%5BJournal%5D)">Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility.</a> Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).</li>
<li>Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+S%2FG+ratio+and+lignin+content+in+a+Populus.+family+influences+the+release+of+xylose+by+dilute+acid+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).</li>
<li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+prediction+of+eucalypt+lignin+syringyl%2Fguaiacyl+content+using+multivariate+analysis%3A+a+comparison+between+mid-infrared%2C+near-infrared%2C+and+Raman+spectroscopies+for+model+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 93(2014).</li>
<li>Lupoi, J. S., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+woody+and+herbaceous+biomasses+lignin+composition+with+1064+nm+dispersive+multichannel+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Spectro%22%5BJournal%5D)">Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy.</a> Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+syringyl%3Aguaiacyl+ratios+using+FT-Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).</li>
<li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl%2Fguaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li>
<li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li>
<li>Sykes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).</li>
<li>Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDecker%2C+S+%22Biomass+Conversion%22">Biomass Conversion</a>. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).</li>
<li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Fuels%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De belangrijkste monstervoorbereiding stappen voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare gegevens bij het uitvoeren van high-throughput screening experimenten zijn als volgt: Sugar afgifte test: In het algemeen worden monsters in partijen variëren van enkele tientallen tot enkele duizenden tegelijk. Elke belangrijke stap wordt gewoonlijk uitgevoerd voor alle monsters vóór vooruit om variaties tussen monsters bereiding te minimaliseren. De-stijven was ...

Als de wereldwijde levering van niet-hernieuwbare brandstoffen en bijbehorende producten afneemt, hebben wetenschappers uitgedaagd om soortgelijke brandstoffen en chemicaliën maken op basis van plantaardige bronnen 1. Een belangrijk aspect van dit werk is bepalen welke soorten planten geschikt voor de productie van biobrandstoffen en biomaterialen 2,3 zijn. Meestal worden deze voedingen geëvalueerd lignine, cellulose en hemicellulose inhoud; evenals hun gevoeligheid voor deconstructie (weerbarstigheid) door middel van thermische, mechanische en / of chemische voorbehandeling met of zonder daaropvolgende enzym versuikering. Meer gedetailleerde analyses worden gebruikt om de specifieke samenstelling van de lignine en hemicellulose fracties en een optimale enzymactiviteit noodzakelijk te bepalen. Transgene modificaties van planten die niet intrinsiek bezitten ideale eigenschappen voor biochemische en thermochemische conversie naar gewenste grondstoffen hebben de onderzoekers voorzien van een zeer uitgebreide bron van de pottiële grondstoffen 4. De standaard analytische methoden voor het kwantificeren van de chemische eigenschappen van de plant, terwijl zeer bruikbaar voor kleine sample sets, ongeschikt voor het snel screenen van honderden of duizenden monsters 5-7. De HTP hierin beschreven werkwijzen zijn ontwikkeld om grote aantallen varianten biomassa snel en efficiënt te evalueren van veranderingen in celwand weerspannigheid aan thermochemische en / of enzymatische afbraak. Het is cruciaal om te begrijpen dat de HTP screeningstesten die hierin zijn beschreven zijn niet bedoeld om de conversie of de opbrengst te maximaliseren. Het doel is om relatieve verschillen in de intrinsieke weerbarstigheid verwante biomassa monsters te bepalen. Hierdoor vele analysestappen verschillen van de &quot;typische&quot; biomassa conversie assays, waarbij het doel is om maximale omzetting snelheid of mate te verkrijgen. Zo worden lagere voorbehandeling severities en kortere enzymhydrolyse keer gebruikt maximaliseren afwijkenschillen tussen de monsters. Meestal gaan hoge enzymladingen gebruikt om verschillen als gevolg van experimentele variatie in enzymactiviteit, die de resultaten aanmerkelijk kunnen scheef verminderen. Snelle technieken waarmee de samenstelling van plantaardige celwanden en de monomere suikers bevrijde volgende enzymatische versuikering omvatten robotics, aangepast, thermochemisch compatible 96-well platen en aanpassingen van standaard laboratoriummethoden 8-11 en instrumentele protocollen, zoals vibratiespectroscopie (infrarood (IR), nabij-infrarood (NIR), of Raman) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) 12-17. Deze methoden zijn de sleutel tot het isoleren van grondstoffen met een hoog cellulose of lage gehalten lignine, of die naar verwachting de hoogste glucose, xylose, ethanol opleveren, enz. Deze methoden hebben downscaled analyses die kleinere hoeveelheden biomassa en verbruiksgoederen in dienst ingeschakeld, wat leidt tot vermindering van de experimentele kosten 18 </sup&gt;. Een ander kenmerk van deze methodiek is dat verschillende experimentele omstandigheden snel kunnen worden en in sommige gevallen tegelijk, geëvalueerd. Zo kan een grote verscheidenheid aan voorbehandeling strategieën of enzym cocktails worden beproefd, waardoor de meest optimale experimentele parameters snel worden geïdentificeerd en toegepast. Populaire voedingsmaterialen, zoals maïsstro 9, populier 8,10, suikerriet bagasse 8 en switchgrass 8 zijn succesvol geëvalueerd met behulp van deze werkwijzen HTP. Totaal lignine en lignine monomeer samenstelling worden ook vaak gekwantificeerd biomassa trekken. Verlagingen van lignine is aangetoond dat de enzymatische verteerbaarheid van polysacchariden 19,20 te verhogen. De rol die de lignine monomeer verhouding (vaak gerapporteerd als syringyl / guaiacyl (S / G)) speelt in de deconstructie van de plant celwand wordt nog onderzocht. Sommige rapporten hebben aangegeven dat een verlaging van de S / Gverhouding heeft geleid tot een verhoogde glucose opbrengst na hydrolyse 21, terwijl andere studies onthullen het tegenovergestelde trend 19,22. High throughput methoden voor het evalueren van lignine en de monomeren zijn vibrationele spectroscopie (IR, NIR, Raman en 23-26) in combinatie met multivariate analyse, en pyrolyse moleculaire bundel massaspectrometrie (pyMBMS) 27,28. Bij de ontwikkeling van HTP methoden voor het screenen van biomassa, moet een aantal integrale overwegingen in het achterhoofd worden gehouden. Een belangrijk aspect is de complexiteit van de werkwijze. Wat is het vereiste niveau voor de techniek? Chemometrische analyses, bijvoorbeeld, vereisen bijzondere vaardigheden voor het construeren, evalueren en onderhouden voorspellende modellen. De standaard methoden vertonen ongewenste stappen voorbereidende of data-analyse of dienst giftige reagentia. De ontwikkeling van de modellen is een continu proces waarbij nieuwe gegevens worden opgenomen in het model in de tijd om de robuustheid van het model te verhogen. Andere considking is de kostenbesparing en verminderde experimentele analyse maal de voorgestelde high-throughput methoden. Als de methode tamelijk snel, maar zeer duur, kan het geen haalbare techniek voor vele laboratoria om aannemen. De werkwijzen toegelicht in dit handschrift varianten gestandaardiseerde technieken, bewerkt om de doorvoersnelheid mogelijkheden amplificeren. Deze protocollen kwantitatief de biomassa eigenschappen van belang te meten zonder de noodzaak van de ontwikkeling van voorspellende modellen. Dit is een belangrijk kenmerk van deze technieken, aangezien voorspellingsmethoden, terwijl met een sterke correlatie met de standaard analyses gebruikt om modellen te ontwikkelen, zijn niet zo nauwkeurig als werkelijk meten van de hoeveelheid van belang voor de monsters. Overwegende dat de gebruikte zijn in wezen verkleinde versies van de standaard bench-schaal analysemethoden methoden, nauwkeurigheid en precisie worden verhandeld voor snelheid en doorvoer. Meestal, dit resultaat is te danken aan hogere fouten in klein volume pipetteren en wegen; alsmede een toename van svoldoende heterogeniteit als monster wordt verkleind. Terwijl de grote sample sets kunnen worden gescreend en vergeleken, moet grote zorgvuldigheid worden betracht bij het maken van vergelijkingen tussen afzonderlijke campagnes en bench-schaal resultaten. De meest tijdrovende stappen omvatten de fysieke manipulatie van de biomassa. Slijpen monsters kan enkele minuten per monster, met inbegrip van het schoonmaken van de molen tussen de monsters te nemen. Handmatig laden, lossen en schoonmaken hoppers en het vullen en legen van theezakjes en sample zakken is ook zeer arbeidsintensief. Terwijl elke stap een minuut of langer kan duren, kan het doen van duizenden monsters vele uren of zelfs dagen duren. De robot kan een typische reactor geladen plaat biomassa in ongeveer 3 tot 4 uur of 6-8 platen dag -1 -1 robot. Deze situatie is afhankelijk van de nauwkeurigheid parameters, alsmede het type en de hoeveelheid biomassa te testen gebruikt. Vullen reactor platen met water, verdund zuur of enzym wordt snel gedaan met behulp van een liquid handling robot. Pherbehandeling van een stapel platen (1-20 reactor platen) duurt tussen 1 en 3 uur na montage, koelen en demontage inbegrepen. Enzymhydrolyse duurt 3 dagen en de suiker analyse vereist ongeveer 1 uur van prep tijd plus 10 min per reactor plaat om de test te voltooien en lees de resultaten. Een wekelijks schema van set voorbehandeling en analyse dagen herbergt een redelijke werkschema minimaliseren oneven uur weekend inspanningen voor menselijke component van het assay en maakt bewerking ~ 800 tot 1000 samples per week op een permanente basis. De maximale doorvoersnelheid hangt af van verschillende factoren, vooral hoeveel hardware (robots, reactoren platen, enz.) En hoeveel &quot;software&quot; (dwz, personeel) zijn beschikbaar voor de handmatige werk te doen. De praktische bovengrens is 2500 tot 3000 monsters / week; echter, dat de output vereist 7 dagen per week operatie en meerdere stagiaires en technici. In vergelijking zou 3000 monsters met HPLC ongeveer 125 dagen sam vereisenple analyse plus de extra arbeid van de hand met een gewicht van de monsters in de reactoren en filtering monsters voorafgaand aan analyse.

<table><tbody><tr><td>Biomek FX Automated Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Automated Liquid Handler</td></tr><tr><td>Wiley mill</td><td>Thomas Scientific</td><td>3375E15 (Model 4), of 3383L20 (Mini-mill)</td><td></td></tr><tr><td>anti-static tassen</td><td>Minigrip*</td><td>MGST4P02503</td><td>2.5x3", meerdere leveranciers beschikbaar</td></tr><tr><td>tin-coated koperdraad</td><td>McMaster-Carr</td><td>8871K84</td><td>0.016" diameter, buig-en-blijf draad</td></tr><tr><td>theezakjes</td><td>Herbco</td><td>press n' brew theezakjes</td><td>3.5x5 inches</td></tr><tr><td>gluco-amylase</td><td>Novozymes</td><td>Spirizyme Fuel&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>alpha-amylase</td><td>Novozymes</td><td>Liquozyme SC DS</td><td></td></tr><tr><td>natriumacetaat trihydraat</td><td>elke chemische leverancier</td><td></td><td>reagentiakwaliteit</td></tr><tr><td>azijnzuur</td><td>elke chemische leverancier</td><td></td><td>reagentiakwaliteit</td></tr><tr><td>190 proof (95%) ethanol</td><td>elke chemische leverancier</td><td></td><td>reagentiakwaliteit</td></tr><tr><td>hoppers</td><td>Freeslate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well C-276 Hastelloy platen</td><td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td><td>N/A (op maat gemaakt)</td><td></td></tr><tr><td>1/8&rdquo; soldeerboutpunt</td><td>Sears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicoon-zelfklevende teflontape</td><td>3M</td><td>5180</td><td>3" breed (36-meter rollen)</td></tr><tr><td>enzymoplossing</td><td>Novozymes</td><td></td><td>Cellic CTec2</td></tr><tr><td>citroenzuurmonohydraat</td><td>elke chemische leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>trinatriumcitraatdihydraat</td><td>elke chemische leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wegwerp, polystyreen 96-well platen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>of equivalent; meerdere leveranciers beschikbaar</td></tr><tr><td>glucoseoxidase/peroxidase&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-glucose assay kit</td></tr><tr><td>xylose dehydrogenase</td><td>Megazyme</td><td>K-Xylose</td><td>Megazyme D-xylose assay kit</td></tr><tr><td>glucose standaardoplossing</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-glucose assay kit</td></tr><tr><td>xylose standaardoplossing</td><td>Megazyme</td><td>K-Xylose</td><td>Megazyme D-xylose assay kit</td></tr><tr><td>roestvrijstalen steekproefbekers</td><td>Frontier Laboratories</td><td>PY1-EC80F</td><td></td></tr><tr><td>glasvezelbladen</td><td>Pall</td><td>66227</td><td>8x10" bladen; cirkels geponst met standaard perforator</td></tr><tr><td>Suikerriet Bagasse Hele Biomassa Brandstof</td><td>NIST</td><td>8491</td><td></td></tr><tr><td>Eastern Cottonwood (poplar) Hele Biomassa Brandstof</td><td>NIST</td><td>8492</td><td></td></tr><tr><td>Monterey Pine Hele Biomassa Brandstof</td><td>NIST</td><td>8493</td><td></td></tr><tr><td>Tarwestroo Hele Biomassa Brandstof</td><td>NIST</td><td>8494</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput screening van weerspannigheid variaties in lignocellulose: total lignine, lignine monomeren, en enzymatische sugar release

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

De omzetting van lignocellulose biomassa naar brandstoffen, chemicaliën en andere producten is onderzocht als een mogelijke weg om het gebruik van niet-hernieuwbare energiebronnen te verminderen. Om te identificeren welke planten uit een diverse pool de gewenste chemische eigenschappen hebben voor downstream toepassingen, moeten attributen zoals het cellulose- en ligninegehalte of de monomeersuikerafgifte na enzymatische saccharificatie worden vergeleken. De experimentele en data-analyseprotocollen van de standaardanalysemethoden kunnen tijdrovend zijn, waardoor het aantal te meten monsters wordt beperkt. High-throughput (HTP) methoden verhelpen de tekortkomingen van de standaardmethoden en maken een snelle screening van beschikbare monsters mogelijk om degenen met de gewenste eigenschappen te isoleren. Deze studie illustreert de HTP suikerafgifte en pyrolyse-moleculaire bundel massaspectrometrie pipelines die worden gebruikt in het National Renewable Energy Lab. Deze pipelines hebben de efficiënte beoordeling van duizenden planten mogelijk gemaakt terwijl experimentele tijd en kosten worden verminderd door reductie in arbeid en verbruiksartikelen.

Het gecombineerde effect van de thermochemische voorbehandeling en daaropvolgende enzym versuikering wordt gemeten als een functie van de massa van glucose en xylose vrijgegeven op het einde van de test. De resultaten worden in termen van mg glucose en xylose vrijkomt per gram biomassa. Dit staat in schril contrast met gerapporteerde gegevens van bench-scale testen die gewoonlijk wordt gerapporteerd als percentage theoretische opbrengst gebaseerd op analyse van de samenstelling van het uitgangsmateriaal. Omdat het nog n...

De structuur en chemische eigenschappen van de plantencelmuur worden geëvalueerd om ideale grondstoffen voor biobrandstoffen en biomaterialen te identificeren. Standaardmethoden hebben beperkingen wanneer ze worden toegepast op grote datasets. Deze hoogdoorvoerpre-behandelings-, enzym-saccharificatie- en pyrolyse-moleculaire bundel massaspectrometrie-methoden vergelijken een groot aantal biomassamonsters met verminderde experimentele tijd en kosten.

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de recalcitrantie bij thermochemische voorbehandeling en enzymatische hydrolyse tussen verwante biomassa-varianten te meten. Dit wordt bereikt door de biomassamonsters eerst voor te bereiden voor testen middels korrelgrootteverkleining en extractie van zetmeel en oplosbare suikers. De tweede stap bestaat uit het met hoge precisie doseren van de biomassa in thermochemisch compatibele high-throughput reactorplaten.De monsters worden voorbehandeld in een stoomreactor. Vervolgens worden de monsters gedurende drie dagen digested met een standaard commerciële cellulase om de cellulose en hemicellulose te hydrolyseren. De laatste stap is de bepaling van de glucose en xylose die tijdens de enzymatische hydrolyse zijn vrijgekomen middels GO pod- en XDH-assays.Uiteindelijk wordt high-throughput glucose- en xylosekwantificatie gebruikt om de relatieve suikervrijgave tussen monsters te bepalen op basis van gram suiker per gram startbiomassa. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden op laboratoriumschaal, zoals laboratoriumschaal voor-behandeling en enzymatische hydrolyse, is dat deze techniek gelijktijdig op honderden of zelfs duizenden monsters kan worden uitgevoerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van biomassa-conversie, zoals welke cultivars of varianten meer geschikt zijn voor conversie naar suikers en daaropvolgende producten.De implicaties van deze techniek kunnen dus worden uitgebreid naar het begrijpen van de structuur en functie van de celwand, omdat de mutaties die we genereren in de biosyntheseweg van de celwand gescreend kunnen worden op structurele chemische veranderingen. Deze methode kan inzicht bieden in de recalcitrantie van plantencelwanden. Het kan ook worden toegepast op andere componenten van biomassaconversie, zoals studies naar enzymactiviteit en synergie.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode er moeite mee hebben, omdat het grote monstersets van biomassa-varianten omvat die op milligramschaal identiek en gelijktijdig behandeld moeten worden. Daarom zijn gespecialiseerde robotica en apparatuur vereist. Om de procedure te starten, brengt u ongeveer 250 mg voorheen gemalen biomassa over van een barcode-antistatische zak naar een genummerd theezakje; rol het theezakje voorzichtig op en zorg ervoor dat de uiteinden over de biomassa worden gevouwen om verlies tijdens het ontstijzelen en de extractie te voorkomen. Sluit vervolgens elk theezakje door het dicht te binden met vertind koperdraad en noteer het nummer van het theezakje voor elk gebarcodeerd monster.Voeg 500 milliliters van een eerder bereide zetmeelverwijderingsenzymoplossing toe aan een plastic container. Voeg vervolgens 120 theezakjes toe aan de enzymbufferoplossing voor een batch-protocol. Na incubatie in een schudapparaat wordt de biomassa gespoeld en 30 minuten geweekt in enkele liters gedeïoniseerd water, na een grondige spoeling van de zetmeelvrije biomassa.Om bufferszouten te verwijderen, worden de theezakjes in een socklit-kolom geplaatst voor extractie. Stel de socklit-reflux in met 95% ethanol en extraheer de monsters gedurende 24 uur. Zodra de extractie is voltooid, worden de theezakjes uitgerold en wordt de gedroogde biomassa teruggeplaatst in de oorspronkelijke barcodebuis.Antistatische zakken. Breng ten minste 50 milligram van de gedroogde biomassa over naar een hopper met barcode. Scan de barcodes van de antistatische zakken en de ontvangende hopper om een nauwkeurige monsterregistratie te waarborgen. Nadat de hoppers op een robotisch weegapparaat zijn geplaatst, worden vijf milligram van de gedroogde monsters robotisch gewogen in zuurbestendig roestvrij staal.Weeg drie replica's van elk monster af in 96-wells platen, verdeeld over de plaat om lokale variaties te minimaliseren. Voeg vervolgens 250 µL gedeïoniseerd water toe aan elke well en verzegel de platen met zelfklevende siliconen POLYTETRAFLUOROETHYLEEN of PTFE-tape. Doorboor de PTFE-tape bij elke stoompoort met een soldeertip van een achtste inch.Klem voor elke plaat de platen stevig vast met glasvezelversterkte PTFE-pakkingen van 0,031 inch dik tussen de platen en lege platen aan de boven- en onderzijde van de stapel. Voorbehandel de monsters met een stoomreactor ingesteld op 180 °C gedurende 17,5 minuten. Koel de reactorplaten na afloop af tot 50 °C door deze te vullen met gedeïoniseerd water.Wanneer de platen zijn afgekoeld, centrifugeert u deze in een swinging-bucket rotor op 1700 GS gedurende 20 minuten. Verwijder vervolgens de plafondfolie.Voeg 40 µL van de eerder bereide 8% enzymvoorraadoplossing toe aan elke put. Nadat de plaat opnieuw is afgedicht met nieuwe PTFE-tape, wordt de afgedichte plaat in een magnetische plaatklem geplaatst. Meng de monsters voorzichtig door minstens 15 keer om te keren en incubeer gedurende 70 uur bij 50 °C. Na incubatie worden de reactorplaten gemengd en gecentrifugeerd.Vervolgens wordt de vloeistofbehandelingsrobot gebruikt om de kwantificering van glucose en xylose uit te voeren via enzymgekoppelde colorimetrische assays: xylose-dehydrogenase (XDH) voor xylose en glucose-oxidase/peroxidase (GO POD) voor glucose. Het deck is ingericht met reservoirs met GO POD- en XDH-reagentia, evenals water voor verdunning en 96-kanaals 200 µL tiprekken voor elk reagens. Deze tips worden hergebruikt voor meerdere reactorplaten.Het deck bevat ook wegwerptips van 200 microliter voor het verwijderen van water en de suikerstandaardeditie, evenals vooraf bereide suikerstandaarden. Vanuit de opslagcarrousel met HPLC-vials brengt de robot drie heldere microtiterplaten binnen, één voor het maken van verdunningen van het hydrolysemengsel en elk één voor de XDH- en GoPod-assays. De grijper verplaatst alle vier de platen naar posities op het deck.Wegwerptips met 96 kanalen van 100 microliter worden vanuit het carrousel naar het deck gebracht voor gebruik bij het overbrengen van de reactor naar de verdunningsplaat en van de verdunning naar de XDH- en go pod-platen. Met behulp van de variabele achtkanals pipetteur wordt het water dat vóór de voorbehandeling is toegevoegd verwijderd uit de drie putjes in elke hoek van de reactorplaat om overdracht naar de verdunningsplaat te voorkomen. Aangezien deze 12 putjes worden gebruikt voor suikerstandaarden met de 96-kanals pipetteerkop.Nadat de drie tips in elke hoek zijn verwijderd, wordt 180 µL water toegevoegd aan de wells van de verdunningsplaat. Na het wisselen van de tips worden de XD-, H- en go pod-reagentia vanuit hun respectievelijke reservoirs overgebracht naar de bijbehorende assayplaten met behulp van de 96-kanaals pipetteerkop.Terwijl dit gebeurt, worden de suikerstandaarden toegevoegd aan de drie wells in elke hoek van de verdunningsplaat. Na het wisselen naar kleinere tips wordt de 96-kanaals pipetteerkop gebruikt om 20 µL hydrolysaat-supernatans over te brengen naar de verdunningsplaat, waarna de plaat drie keer wordt gemengd. Het monster dient nabij de bovenkant van de vloeistof te worden opgezogen om vervuiling van de tips door biomassa-deeltjes te beperken.Na het mengen wordt er opeenvolgend 20 µL overgebracht. Gebruik hiervoor de 96-kanaals pipetteerkop naar de XDH- en go pod-platen. Nadat elke plaat door trier is gemengd, worden de sample tips reactor- en verdunningsplaten teruggeplaatst in een afvalrek in het carrousel; de XDH- en go pod-platen worden verplaatst naar een apart carrouselrek en één uur rusten voordat ze worden uitgelezen in de spectrofotometer, met gebruik van een ultraviolet-zichtbaar 96-wells plaatlezer.Stel de gemeten golflengte in op 510 nanometer en registreer de absorbentie ten opzichte van een reagensblank. Stel vervolgens de gemeten golflengte op de platenlezer in op 340 nanometer en registreer de absorbentie met behulp van een klein spatel. Doseer ongeveer vier milligram van de geprepareerde biomassa in een roestvrijstalen cupje van 80 µL, ontworpen voor de autosampler van de massaspectrometer.Maak met een standaard perforator handmatig glazen filterdiskjes uit glasvezelplaten van type ad zonder bindmiddel. Laad de monsters met een pincet in de rekken van de autosampler; laad de monsters willekeurig in de cups om bias door spectrometersdrift in de loop van de tijd te voorkomen. Nadat de kalibratie is uitgevoerd en de juiste parameters in de massaspectrometer zijn ingevoerd, start u de data-acquisitie en wacht u ten minste 60 seconden om voldoende gegevens te verkrijgen voor de verzameling van achtergrondspectra. Start ten slotte de geautomatiseerde autosampler-methode met een helium-draaggasstroomsnelheid van 0,9 liters per minuut.Een voorbeeld van trends is een onderzoek naar de recalcitrantie van 755 natuurlijke varianten van poplar die bemonsterd zijn in het Pacifisch Noordoosten. De resultaten geven aan dat naarmate de verhouding tussen syringe en guil stijgt, de recalcitrantie afneemt tot een verhouding van ongeveer twee, waarna de verbetering van de recalcitrantie stagneert. Uitschieters zijn hier te zien waar het PT four CL one-gen was gedownreguleerd.Bij populieren vertoonden verschillende van de honderd gescreende cultivar duidelijk een toename in recalcitrantie, wat blijkt uit de afname van de suikervrijgave. Verschillende tarwestro-variëteiten, geteeld op diverse locaties en geoogst na verschillende variaties in groeicondities, resulteerden in 20 onderscheidende populaties op basis van combinaties van de bovengenoemde variabelen. Deze monstersets zijn gemakkelijk te onderscheiden en duiden op positieve en negatieve variabelen.Voor de pyrolyse van recalcitrante stoffen kan moleculaire bundelmassa-spectrometrie worden gebruikt om veranderingen in de samenstelling van de celwand te evalueren. Massaspectrale fragmenten worden toegewezen aan verschillende lignine-monomeren. Bij het vergelijken van een monster met een hoog ligninegehalte versus een hoog koolhydraatgehalte zijn de verschillen in de spectrale gegevens duidelijk zichtbaar.Het gebruik van massaspectrometriegegevens, gekoppeld aan een hoofdcomponentenanalyse, wordt hier geïllustreerd. De plot van de loadings van de hoofdcomponenten kan helpen bij het identificeren van welke chemische kenmerken worden verklaard in de scores-classificatieplot, evenals het verduidelijken van welke kenmerken veranderen tussen de monsterclusters. Eenmaal beheerst, kan deze techniek worden gebruikt om wekelijks duizenden monsters te screenen, mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zo consistent mogelijk te zijn en alleen monsters binnen een gerelateerde set met elkaar te vergelijken.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor andere onderzoekers om te werken aan high-throughput screeningmethoden en andere gebieden met betrekking tot de recalcitrantie van plantencelwanden, met behulp van zaken als ionische vloeistoffen en alkalische voorbehandeling. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u grote monstersets biomassa op microschaal correct moet prepareren, hanteren en analyseren op verschillen in recalcitrantie met behulp van korrelgroottevermindering en extractie, thermochemische voorbehandeling en enzymatische hydrolyse. Houd er rekening mee dat werken met hoge druk, stoom en geautomatiseerde apparatuur uiterst gevaarlijk is en dat alle veiligheidsvoorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en het gebruik van veiligheidsinterlocks op alle apparatuur tijdens het uitvoeren van deze procedures.

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Plantaardige biomassa is een belangrijke koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof die gebruikt kunnen worden voor de productie van biobrandstoffen. Plantaardige biomassa bestaat voornamelijk uit celwanden, een structureel complex composietmateriaal genoemd lignocellulose. Hier beschrijven we een protocol voor een uitgebreide analyse van de inhoud en de samenstelling van de polyfenolische lignine.

Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel I: Lignine

Een methode gebaseerd op confocale Raman microscopie wordt gepresenteerd die biedt label-free visualisatie van lignine in plantaardige celwanden en vergelijking van lignification in verschillende weefsels, monsters of soort.

Label-free In situ Imaging van Lignification in Plant celwanden

Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit...

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Een eenvoudige, snelle methode voor het bepalen van de versuikering potentieel van grote aantallen van plantaardige biomassa monsters is beschreven. De geautomatiseerde platform voor deze analyse heeft betrekking op de voorbereiding van de plantaardige biomassa voor analyse in platen met 96 putjes en de daaropvolgende prestaties van de voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers.

High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen

Een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek wordt toegepast om down-reguleren van de maïs cinnamoyl co-enzym A-reductase (ZmCCR1) gen tot lagere planten ligninegehalte. Lignine down-regulatie van de celwand wordt gevisualiseerd door microscopische analyses en gekwantificeerd door de Klason methode. Compositionele veranderingen in hemicellulose en cellulose geanalyseerd.

Lignine Neerregeling van<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi en Klason Lignine Analyse

Adaptieve evolutie en isolatietechnieken worden beschreven en aangetoond dat derivaten van Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 die in staat zijn om snel te consumeren hexose en pentose gemengde suikers in enzym versuikerd undetoxified hydrolysaten en te accumuleren meer dan 40 g / l ethanol opleveren.

Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

OrganoCat is een methode voor de voorbehandeling en fractionering van lignocellulose onder milde omstandigheden tot lignine, fermenteerbare suikers en cellulosepulp. In een bigene, bifasische oplosmiddelensysteem van water en 2-methyltetrahydrofuraan met 2,5-furancarbonzuur als katalysator, worden de OrganoCat-producten in situ gescheiden voor eenvoudige productterugwinning.

Fractionering van lignocellulosische biomassa met behulp van het OrganoCat-proces

Diepe eutectische oplosmiddel-gebaseerde, microgolf-ondersteunde voorbehandeling is een groen, snel en efficiënt proces voor lignocellulosische fractionering en hoogzuiver lignine herstel.

Ultrasnelle lignineextractie uit ongewone mediterrane lignocellulosische residuen

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer hoe je high-throughput screening toepast voor biomassa-analyse met thermochemische voorbehandeling en enzymatische hydrolyse. Deze methode identificeert optimale grondstoffen voor biobrandstoffen.

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release (Video) | JoVE Journal

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

Meer video's verkennen