Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS
11 juli 2016
Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.
Het algemene doel van dit MALDI-TOF Mass Spectrometry-protocol is om de typering van zeldzame pathogenen te verbeteren door middel van een snelle en kosteneffectieve procedure. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van diagnostische microbiologie te beantwoorden, het maakt een snelle opheldering van zeldzame bacteriële pathogenen mogelijk. Vandaag willen we het hebben over odoratimimus en bacteriën van het geslacht Myroides.
Om de methode te demonstreren en om over de interpretatie van de resultaten te praten. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden omdat het overbrengen van bacteriën, het overleggen met metrische gegevens en de interpretatie van resultaten technische vaardigheden en microbiologische expertise vereisen. We hadden eerst het idee om MALDI-TOF MS te gebruiken om te screenen op zeldzame bacteriën toen we een patiënt in ons ziekenhuis hadden die leed aan een diabetische voedselinfectie veroorzaakt door myroides odoratimus.
Begin dit protocol met de extractie van bacterieel DNA, 16S ribosomale DNA PCR en Sanger-sequencing zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een houten tandenstoker om een enkele bacteriekolonie over te brengen naar een putje van een 96-wels stalendoel. Breng één microliter van 70% formique zuur aan op het luchtgedroogde organisme op het stalendoel en laat het ongeveer twee tot drie minuten drogen.
Leg de vlek bedekt met één microliter matrixoplossing met 50 mg/ml CHCA in een organisch oplosmiddel bestaande uit 50% acetonitril, 2,5 trifluorazijnzuur en 47,5% water. Laat de uitstrijk en de overgelegde matrix ongeveer vijf minuten in een afzuigkap drogen. Om de monsters te introduceren, belucht u de monsterlaadpoort van de massaspectrometer door op de in/uit-knop van het instrument te drukken.
Open de laadpoort en plaats de MALDI-TOF MS-doelplaat met de gedroogde bacterie-uitstrijk en matrix. Sluit de poort en vacuüm opnieuw. Observeer het vacuüm en start de meting wanneer het 4,5 miljoen millibar bereikt.
Open de MMIS-analysesoftware en klik op het bestandsmenu. Selecteer "Nieuwe classificatie" en er zou een nieuw venster genaamd "MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard" moeten openen. Typ de projectnaam in het veld "Projectnaam" en klik op "Nieuw", onder het nieuwe dialoogvenster genaamd "Nieuw project", controleer de projectnaam en ga verder door op de knop "OK" te klikken.
Observeer in de MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard het venster voor analytenplaatsing. Selecteer doelposities, klik met de rechtermuisknop op een geselecteerde positie en selecteer "Voeg monsters toe". Typ in de automatisch geopende tabelweergave de monsternaam, monster-ID en optioneel een opmerking in.
Klik op de knop "Volgende" om verder te gaan. Observeer vervolgens de selectie van het venster met MALDI Biotyper-methoden. Selecteer "Bruker Taxonomie" uit de MSP's van Taxonomie-bomen en klik op "Volgende" om door te gaan.
Observeer vervolgens het venster met het projectoverzicht. Controleer de ingevoegde vermeldingen hierboven voor het eigenlijke classificatieproject. Start de classificatierun door op de knop "Voltooien" te klikken.
Metingen starten automatisch wanneer het juiste vacuüm is bereikt. Volg de classificatierun totdat de meting met succes is voltooid. Zodra de meting is voltooid, opent u het menu "Bekijk" en klikt u op "Resultaten" om de resultatentabel in het MALDI Biotyper Real Time Classification Project One te bekijken.
Bekijk de Bruker-Daltonik MALDI Biotyper-classificatieresultaten als een html-bestand in de standaardwebbrowser. Druk de resultaten af en bewaar ze. Hier worden spectra weergegeven die zijn verkregen door MALDI-TOF MS die in realtime worden gemeten en geclassificeerd.
Aan de spectra wordt een soortnaam en een scorescore toegekend die de kwaliteit van de meting weergeeft. Scores boven de 2.300 vertegenwoordigen een zeer waarschijnlijke soortidentificatie. Een score tussen 2.000 en 2.300 geeft een veilige soortidentificatie aan.
Een score onder 1.700 en 2.000 duidt op een waarschijnlijke soortidentificatie. En een score onder 1.700 is niet betrouwbaar. De identificatie van bacteriële pathogenen gekweekt op een zuivere cultuur op een vast medium duurt twee tot drie minuten.
Het is belangrijk om te onthouden dat zeldzame bacteriële pathogenen alleen kunnen worden gevonden met MALDI-TOF MS wanneer de instrumenten betrouwbaar de juiste spectra bevatten. Anders moet het worden verwijderd door MaSDA-spectra van getypte stammen van hun gekarakteriseerde isolaten te integreren. In het geval dat scoreresultaten niet tot een ondubbelzinnige stamidentificatie leiden, kunnen verdere methoden, zoals biochemisch profileren of 16S rDNA-sequencing worden toegepast.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in bacteriedetectie, kan deze ook worden toegepast op andere micro-organismen zoals schimmels of anaërobe organismen. Bovendien kan bacterieweerstand worden gemeten. Vergeet niet om met een matrix te werken die een gevaarlijke stof is, draag handschoenen, beschermende bril en werk onder een kap.
Bovendien is het absoluut noodzakelijk om de matrix en uitstrijk grondig te drogen om spetteren in de analysekamer te voorkomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van MALDI-TOF-massaspectrometrie om de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen te verbeteren. Door deze methode te integreren met moleculaire technieken, kunnen onderzoekers een nauwkeurigere diagnostiek binnen de microbiologie bereiken.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Diagnostische Technieken
- Pathogeenidentificatie
Achtergrond
- MALDI-TOF MS is een krachtig instrument voor het typeren van pathogenen.
- Zeldzame bacteriële pathogenen vormen een uitdaging voor de routinediagnostiek.
- Inzicht in de beperkingen van traditionele methoden is cruciaal.
- Technische vaardigheden zijn vereist voor een effectieve implementatie.
Doel van de studie
- Om de typering van zeldzame pathogenen te verbeteren.
- Om een snelle en kosteneffectieve diagnostische procedure te bieden.
- Om de methode te demonstreren aan de hand van specifieke bacteriële voorbeelden.
Gebruikte methoden
- MALDI-TOF-massaspectrometrie voor pathogenen-screening.
- 16S rRNA-gensequencing voor moleculaire identificatie.
- Technische procedures voor bacteriële overdracht en overlay.
- Interpretatie van massaspectrometrie-resultaten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van Myroides odoratimimus.
- Aantoonde de mogelijkheden van snelle diagnostiek voor zeldzame pathogenen.
- Benadrukte het belang van technische expertise.
- Bood inzichten in de toepasbaarheid van de methode in klinische omgevingen.
Conclusies
- MALDI-TOF MS in combinatie met moleculaire technieken verbetert de diagnostiek.
- Training is essentieel voor een effectief gebruik van de methode.
- Toekomstige toepassingen kunnen het bereik van pathogeenidentificatie verbreden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Een nauwkeurige identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen is cruciaal voor diagnostische microbiologie in biofarmaceutische R&D, in het bijzonder voor immuungecompromitteerde patiëntpopulaties. De integratie van MALDI-TOF MS met 16S rRNA-sequencing maakt een snelle, kosteneffectieve identificatie op soortniveau mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie bij de validatie van antimicrobiële targets. Deze gecombineerde aanpak verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen door het aantal fout-negatieven bij de detectie van pathogenen te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de identiteit van zeldzame pathogenen in infectiemodellen te bevestigen.
- Operationele waarde: Biedt een robuuste, aan de nomenclatuur voldoende stamidentificatie die essentieel is voor reproduceerbare risicoreductie van targets.
- Predictieve waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door middel van een accurate karakterisering van pathogenen in ziekterelevante systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve score-uitgangen (bijv. >2.300 voor een zeer waarschijnlijke ID) die gestandaardiseerde hit-bevestiging in antimicrobiële screenings mogelijk maken.
- Operationele waarde: Faciliteert de gereedheid van de assay via snelle (<3 min) identificatie van zuivere culturen, waardoor de screeningdoorvoer en schaalbaarheid worden verbeterd.
- Waarde voor reproduceerbaarheid: Garandeert vergelijkbaarheid tussen laboratoria door gestandaardiseerde spectrale matching en vertrouwen op gevalideerde databases.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische continuïteit door zeldzame pathogenen te valideren in klinisch relevante infectiemodellen.
- Operationele waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk wanneer score-drempelwaarden (2.000–2.300) een zekere species-identificatie bevestigen.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de afstemming van biomarkers wanneer de aanwezigheid van pathogenen correleert met de gastheerrespons in immuungecompromitteerde modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische evaluatie, waarbij een nauwkeurige identificatie van het pathogeen de basis vormt voor mechanistische studies en de beoordeling van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door zeldzame bacteriële agentia in infectiemodellen te bevestigen, waardoor mechanische ambiguïteit wordt verminderd.
- Screening: Levert assay-klare, gevalideerde biologische systemen met kwantitatieve outputs voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt op scores gebaseerde uitlezingen (bijv. MALDI Biotyper-classificatie) die objectieve vergelijking van condities en hit-validatie mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door pathogenenvalidering in ziekterelevante systemen, indien ondersteund door bronmateriaal.
- Enterprise Reuse: Functioneert als een herbruikbare diagnostische capaciteit over meerdere projecten met zeldzame pathogenen, waardoor redundante validatie-inspanningen worden verminderd.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie, vermindering van foutieve pathogeentoewijzingen en mechanistische risicoreductie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van pathogeenidentificatie tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen in antimicrobiële programma's, kapitaalefficiëntie via snelle diagnostiek en verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risicogebaseerde prioritering van antimicrobiële kandidaten met behulp van bevestigde pathogeenidentiteiten in preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist microbiologische expertise voor bacteriële overdracht, matrix-overlay en interpretatie van resultaten.
- Afhankelijk van MALDI-TOF MS-instrumentatie met bijgewerkte taxonomische databases (bijv. Bruker Taxonomy) voor nauwkeurige spectrale matching.
- Noodzaak tot gestandaardiseerde protocollen voor monsterpreparatie om een droge matrix en uitstrijk te garanderen en contaminatie van de analyzer te voorkomen.
- Vereist terugvalopties naar 16S rRNA-sequencing of biochemisch profiel wanneer MALDI-TOF-scores onder de 1.700 vallen voor een niet-betrouwbare identificatie.
- Omvat veiligheidsprotocollen voor het hanteren van gevaarlijke matrixoplossingen (bijv. mierenzuur, acetonitril) onder een zuurkast met PBM.
