Name: Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Leer MALDI-TOF MS en 16S rRNA-sequencing voor snelle identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen zoals Myroides odoratimimus. Deze methode verbetert diagnostische microbiologie in klinische settings.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Prof. Enno Jacobs bedanken voor zijn voortdurende steun.

1. Winning van bacterieel DNA <ol><li> Bereiding van PBS oplossing <ol><li> Weeg 1,65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O en 8,80 g NaCl in een kolf en vul met gedestilleerd water tot een eindvolume van 1000 ml. Breng de pH op 7,4. Voor gebruik in definitieve filteren de oplossing door een bacterie-proof (0,22 pm) filter. </li></ol></li><li> DNA-extractie van Gram-negatieve bacteriën <ol><li> Streak de patiënt materiaal op de juiste cultuur media (bijvoorbeeld Columbia bloed agar), identificeren en te isoleren potentiële ziekteverwekkers. </li><li> Bereid pure cultuur en het uitvoeren van Gram-kleuring om morfotype te bepalen en om de zuiverheid te bevestigen en van de cultuur 49. </li><li> Kies een enkele bacteriële kolonie en breng het met een 1 pl eenmalig gebruik enting lus in een steriele 2,0 ml reactie buis die 1 ml PBS-oplossing bevat. </li><li> Incubeer deze suspensie in een thermomixer bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Na incubatie liet het bacteriële extract (die het opgeloste DNA) afkoelen tot kamertemperatuur en ofwel zodanig gebruikt voor amplificatie en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik (figuur 1a). </li></ol></li><li> DNA Extraction van Gram-positieve bacteriën <ol><li> Streak de patiënt materiaal op de juiste cultuur media (bijvoorbeeld Columbia bloed agar), identificeren en te isoleren potentiële ziekteverwekkers. Uitvoeren Gram-kleuring om morfotype van cultuurbevestigende. </li><li> Bereid reincultuur en uitvoeren van Gram-kleuring om morfotype bepalen en zuiverheid van cultuurbevestigende. </li><li> Kies een enkele bacteriële kolonie met een steriele 1 pi enting lus en hang deze in 500 ul PBS oplossing in een 2,0 ml reactie buis. </li><li> Voeg 500 ul glazen kralen en breng de buis een oscillerende homogenisator werkt bij maximale frequentie en amplitude (50 Hz), gedurende 5 min. Gebruik glazen kralen met een diameter 1,0 mmde bacteriële celwanden verstoren. </li><li> Incubeer de buis 10 minuten bij 95 ° C en koel af tot kamertemperatuur. Met het extract rechtstreeks voor de PCR-reactie of bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik. </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNA PCR <ol><li> Bereiding van amplificatieprimers <ol><li> Gebruik de primers TPU1 (5&#39;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]) als voorwaartse primer en RTU4 (5&#39;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#39;) als reverse primer 25. Bereid een primer voorraad oplossing met DNAse en RNAse gratis water, met een concentratie van 100 pmol / ul (100 uM) en vul het verder om een ​​werkende oplossing bij 10 pmol / pl. Bewaar de primer voorraad en werkende oplossing bij -20 ° C of direct te gebruiken. </li></ol></li><li> Bereiding van de PCR-mix <ol><li> Pipetteer 1 ul van elke primer, 1 ui dNTP-mengsel (100 mM), 2,5 pi van het DNA-extract, 5 gl 10 x PCR-buffer (bevattende 25 mM MgCl 2), 0,25 pl Taq-polymerase (5 eenheden / ul) en 39.25 pi DNase- en RNAse gratis PCR water in een steriele 200 ul reactie buis. </li></ol></li><li> PCR protocol <ol><li> Start het PCR programma gebouwd als volgt: Ten eerste, een eerste incubatiestap bij 95 ° C gedurende 5 minuten die nodig is om het Taq-polymerase te activeren. Ten tweede, 35 amplificatiecycli, met een 1 min. denaturatiestap bij 95 ° C, 1 min. primer annealing stap bij 50 ° C, en 1,5 minuten primerverlenging bij 72 ° C. Ten derde, een laatste verlenging gedurende 10 min bij 72 ° C. Tenslotte wordt de PCR reactie afgekoeld tot 4 ° C. OPMERKING: Staphylococcus aureus en H 2 O fungeren als positieve en negatieve controle (Figuur 1b). </li><li> Plaats de buis met het PCR-reactiemengsel in de thermocycler en start het programma. </li></ol></li><li> Zuivering van het PCR product Opmerking: Om de PCR te zuiveren, ofwel verscheidene protocollenenzymen gebaseerde of op silica adsorptie- matrix kan worden gebruikt. De single-step PCR cleanup hier gebruikt maakt gebruik van twee hydrolytische enzymatische reacties. Terwijl exonuclease I (Exo I) enkelstrengs DNA verwijdert, garnalen alkalische fosfatase (SAP) hydrolyseert zonder rechtspersoonlijkheid dNTPs. De tweede procedure is gebaseerd op een silica membraan adsorptie techniek met een hoog zoutgehalte snel binden - wassen - laag zoutelutie cyclus. <ol><li> Voeg 1,5 ul van een mengsel dat zowel enzymatische Exo I en SAP aan 25 ui PCR-product, meng en overbrengen in een thermocycler toepassing van een eenvoudig protocol van eerst 15 minuten bij 37 ° C gevolgd door 15 min bij 80 ° C. Bewaar het gezuiverde PCR-product, hetzij bij -20 ° C of direct gebruiken als doelwit voor PCR labelen. </li></ol></li></ol> 3. DNA agarosegelelektroforese <ol><li> Bereiding van de elektroforese buffer (TBE-buffer) <ol><li> Titreer 54,0 g (445 mM) Tris-base, 27,5 g (445 mmol) boorzuur en 20 ml van een 0,5 M EDTA (10mM) bij pH 8,0 met NaOH in een kolf en vul met gedestilleerd water tot een totaalvolume van 1000 ml. Verdun deze 5x buffer 1:10 met gedestilleerd water (0,5x TBE) voor elektroforese. </li></ol></li><li> Bereiding van de laadbuffer <ol><li> Meng 250 mg broomfenolblauw, 250 mg xyleencyanol FF en 15 g polysucrose (Materials Table) in een kolf. Vul vervolgens 0,5x TBE buffer tot een totaal volume van 100 ml. Aliquot de lading kleurstof 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik. </li></ol></li><li> Gieten van de Agarose Gel <ol><li> Weeg 6 g standaard agarose elektroforese 300 ml 0,5x TBE buffer (zie paragraaf 3.1.1) in een kolf, een 2% te bereiden (w / v) agarosegel. Dan zet de agarose mengsel in een magnetron, verwarm het bijna-kookpunt totdat de agarose volledig is opgelost en de oplossing lijkt duidelijk. </li><li> Laat de gesmolten agarose afkoelen voldoende en voeg 10 ul van een 1% (w / v) voorraad ethidiumbromide oplostie. Giet de oplossing in een gietvorm en plaats een gel kam (rekening houdend met 30 putjes) in de gietvorm. Verwijder de kam als de gel is volledig gestold en wordt de gel in de elektroforese kamer die 0,5x TBE buffer. OPMERKING: Ethidiumbromide is giftig en mutageen. Daarom moet worden behandeld met de nodige voorzichtigheid. Het is raadzaam om nitril handschoenen te gebruiken. Er zijn alternatieve intercalerende nucleïnezuur vlekken die kan worden gebruikt als een niet-toxisch alternatief. </li></ol></li><li> Agarosegelelektroforese van de PCR- producten Opmerking: Om de juiste maat van de PCR amplicons verifiëren en de DNA-concentratie van de gezuiverde PCR-product wordt gescheiden in een agarose gel schatten. <ol><li> Pipetteer 2 pi van de laadbuffer in een PCR-reactie buis en voeg 8 pi van het PCR-product. Pipet dit mengsel in de putjes van de gel. Voeg 8 pi van een molecuulgewicht groottemarker (DNA ladder) in een aparte goed om de grootte van het PCR-product te schatten. </li><li> Van toepassing zijneen constante spanning bij 10 V / cm en stop de elektroforese als de broomfenolblauw marker ¾ van de totale lengte van de gel bereikt. Visualiseer de gescheiden PCR-fragmenten met behulp van een UV-transilluminator (golflengte 302 nm) en documenteren ze met behulp van een gel-documentatiesysteem. Schatting van de hoeveelheid DNA door visuele vergelijking met de DNA-ladder. Gebruik ongeveer 10 ng als doelwit voor de etikettering PCR. </li></ol></li></ol> 4. Sanger Sequencing <ol><li> Cycle Sequencing PCR OPMERKING: Voer de PCR labeling in een 10 ul reactie met behulp van een commerciële kit (Materials tabel). <ol><li> Voeg 2 pl 5x reactie mastermix, 2 pi van het DNA-preparaat, 1,5 pi TPU1 of RTU4 werkende oplossing (10 pmol / ul) en 4,5 ul DNAse en RNAse gratis water. </li><li> Zet deze sequencing reactie mix in een thermocycler en start een ander PCR. In totaal werkwijze 25 cycli bestaande uit een denaturatiestap (96 ° C,10 sec), een annealing stap (45-60 ° C, 5 sec) en een verlengingsstap (60 ° C, 2 min). Koel de reactie bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Zuivering van de sequentie reactie <ol><li> Zuiver het labeling reactiemengsel met behulp van commerciële spin kolommen voor PCR zuivering (Materials tabel). </li><li> Load 10 ul van de sequentie reactie op de vooraf gehydrateerde gelfiltratie matrix en voer een centrifugatiestap bij 750 xg gedurende 3 min. OPMERKING: Bij de toepassing van deze procedure zonder lokaal kleurstof terminatoren worden vastgehouden in de gelmatrix. </li><li> Dan droog het waterige eluaat onder vacuüm concentrator. Centrifugeer bij 2500 xg gedurende 20 tot 30 minuten bij 40 ° C tot volledig droog. </li><li> Voeg 10 ul van zeer gedeïoniseerd formamide dan denatureren bij 90 ° C gedurende 2 minuten en koel het mengsel op ijs. Pipetteer 10 ul van de gedenatureerde monsters op een 96 well plaat ul. Bewaar de gedroogde en gereinigd PCR product bij -20 ° C als de analyseop een later tijdstip worden uitgevoerd. </li></ol></li><li> 16S rRNA Gene sequentiebepaling en analyse van de DNA sequentie OPMERKING: Voer sequentie-analyse op een geautomatiseerde sequencer (Materials tabel). De sequencer hier gebruikt is een geautomatiseerde op fluorescentie gebaseerde capillaire elektroforese systeem 4 monsters simultaan geanalyseerd (50 cm 4-capillair array) met een vloeibaar polymeer 67 (figuur 1c). <ol><li> Plaats de microtiterplaat in de sequencer. Schrijf een staalkaart (plaat record) zoals uiteengezet in 2, sla het op en start de sequencing run / analyse na de stappen in 1. LET OP: De duur van een reeks run is 2 uur en levert gegevens van 800 tot 1000 bp. </li><li> Open de sequencing analyse software (Materials tabel). Sequence gegevens worden gegeven als een tekstbestand (.seq) en een bestand met de elektroferogram zoals kwaliteits-waarden (QV) (.ab1). OPMERKING: Base roeping is automatisch pergevormd door de sequentieanalyse software en de onderliggende elektroferogram visueel onderzocht (bijvoorbeeld piekhoogte, piekscheiding) vóór de sequentie wordt gebruikt voor verdere toepassingen. </li><li> Vergelijk de opgeslagen DNA-sequentie-bestand naar de NCBI nr database met behulp van BLAST-algoritme (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide). </li></ol></li></ol> 5. MALDI-TOF-MS LET OP: De massaspectrometer maakt gebruik van een 337 nm N2 laser en wordt bediend door een specifieke control software (Materials tabel). Spectra worden in lineaire modus en een massabereik 2.000 tot 20.000 Da valt. Interpretatie van de gegevens en de verdeling van de scores van de monsters wordt uitgevoerd in real time uitgevoerd door een analyse software (Materials Table) (figuur 1d). <ol><li> Bereiding van bacteriën voor MALDI-TOF MS Analysis <ol><li> Groeien de bacteriën van belang (bijvoorbeeld, Myroides odoratimimus) op ColUmbia bloed agar met 5% paardenbloed bij 37 ° C gedurende 18 tot 24 uur, afhankelijk van de bacteriestam (Figuur 2a). Uitvoeren Gram-kleuring de morfotype van het onderzochte organisme en zuiverheid van de kweek te controleren. </li><li> Gebruik een houten tandenstoker voor het overbrengen van een bacteriële kolonie een putje van een 96 putjes staal target (figuur 2b en 2c). Spot 1 ui 70% mierenzuur bovenop de lucht gedroogd organisme voor het doel staal en laten drogen gedurende ongeveer 2-3 min. </li><li> Vervolgens bedekken de plek met 1 pi matrixoplossing, bevattende 50 mg / ml CHCA (α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur) in een organisch oplosmiddel (50% acetonitril, 2,5% trifluorazijnzuur, 47,5% H2O). Opmerking: Het zuur overlay methode (op plaat bereidingswijze) gebruikt worden om de kwaliteit van de massaspectra verbeteren. Het is aangetoond dat bij Gram-positieve bacteriën dergelijke &quot;zuuraanval&quot; verhoogt de stand values van de gemeten spectra 45. OPMERKING: U een geautomatiseerd monstervoorbereiding (Materials Table) worden toegepast waarin contactloze spots van 1 ui 70% mierenzuur en na een eerste droogcyclus, 1 ui matrixoplossing worden aangebracht op het bacteriële vlek. De monsters worden vervolgens gedroogd onder gestandaardiseerde omstandigheden bij 60% relatieve vochtigheid en zijn klaar om te gebruiken voor analyse. </li><li> Laat de uitstrijkjes met matrix bedekt lucht drogen weer voor ongeveer 5 min in een kap. Deze bacteriële uitstrijkje met de toegepaste matrix is ​​nu stabiel gedurende vele uren. OPMERKING: Bacteriële uitstrijkjes zonder matrix kan niet stabiel zijn als gevolg van afbraak van eiwitten. </li></ol></li><li> Het uitvoeren van de MALDI-TOF MS Analysis <ol><li> Introductie van de monsters <ol><li> Open de besturingssoftware van onze MMIS (Materials tabel). </li><li> Beluchten het monster laden haven van de massaspectrometer door op de IN / OUT-toets van het instrument. </li><li> Open de laadhaven na een klik en steek de MALDI-TOF-MS doel bord met de gedroogde bacteriële uitstrijkje plus matrix. </li><li> Sluit de haven en weer te evacueren. Observeren vacuüm en wanneer zij tot 4,5 x 10 -6 mbar beginnen meting. </li></ol></li><li> monsteranalyse <ol><li> Open de analyse software van onze MMIS (Materials Table) en klik op het menu &quot;Bestand&quot;. Selecteer &quot;Nieuwe classificatie&quot; en een nieuw venster &quot;MALDI biotyper real time classificatie-wizard&quot; wordt geopend. Typ de naam van het project, bijvoorbeeld &quot;Myroides meting project_1, in het veld&quot; naam Project &quot;en druk op de knop&quot; Nieuw &quot;. Onder de nieuwe dialoogvenster met de naam&quot; New project &quot;naam check project en ga door op de knop&quot; OK &quot;. </li><li> In de &quot;MALDI biotyper real time classificatie tovenaar&quot; observeren het venster &quot;Analyt plaatsing&quot; geopend. Selecteer doel posities (bijvoorbeeld A1, A2, A3 ...), rechts-click elke geselecteerde positie (aangegeven met een blauw vierkant) en selecteer &quot;samples toevoegen&quot;. In de automatisch geopend tabel type in de steekproef van naam, monster-ID en eventueel een reactie uitzicht. Klik op de knop &quot;Next&quot; om verder te gaan. </li><li> In de &quot;MALDI biotyper real time classificatie tovenaar&quot; observeren het venster &quot;Selectie van MALDI biotyper methods&quot; geopend. Selecteer &quot;Bruker Taxonomie&quot; van &quot;MSP&#39;s van taxonomie bomen&quot; en klik op &quot;Next&quot; om verder te gaan. </li><li> In de &quot;MALDI biotyper real time classificatie tovenaar&quot; observeren het venster &quot;Project summary&quot; geopend. Controleer de geplaatste inzendingen hierboven gegeven voor de eigenlijke indeling project. Start de indeling gerund door op de knop &quot;Finish&quot; (figuur 2d - f). De meting wordt automatisch gestart wanneer de juiste vacuüm is bereikt. </li><li> Volg de kwalificatie run totdat de meting is voltooid. Bekijk hier de resultaten tabel in thij &quot;MALDI Biotyper Realtime Classification Project Myroides meting project_1&quot; opent het menu &quot;View&quot; en klik op &quot;resultaten&quot;. </li><li> Bekijk de &quot;Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classification resultaten&quot; als HTML-bestand in de standaard webbrowser. Afdrukken en de resultaten opslaan. </li></ol></li><li> Meet een testnorm dagelijks voorafgaand aan analyse proeven om het instrument te kalibreren en het uitvoeren van instrument validatie wekelijks (instrument zelftest). LET OP: Tijdens de meting MALDI-TOF spectra worden geanalyseerd in real time door de analyse software (Materials tabel). Een lijst van tien soorten met hun scores gegeven en wordt in de laboratorium informatiesysteem (LIS) voor het melden. </li><li> Evalueer kritisch de MALDI-TOF MS resultaten (zie representatieve resultaten) en eventueel ook andere tests, zoals biochemische en antibioticagevoeligheid profielen of 16S rRNA gen sequencing en eventueel Gram-kleuring voortoewijzen van een bacteriële soort tot de microbiologische rapport. </li></ol></li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Zowel MALDI-TOF MS en 16S rRNA gensequentie bieden de mogelijkheid om grote aantallen verschillende bacteriën te identificeren. MALDI-TOF MS is een snelle en goedkope methode die gemakkelijk te hanteren en grote databases van bacteriële massaspectra zijn. Daarom MALDI-TOF MS is een snelle, kosteneffectieve en betrouwbare methode voor screening studies gericht op zeldzame bacteriële pathogenen 17,20,39,51 voeren. In een prospectieve studie ter vergelijking van MALDI-TOF MS met andere fenotypische identificatie...

Secure identificatie van zeldzame pathogenen in routine diagnostiek wordt bemoeilijkt door het feit dat de klassieke culturele en biochemische methoden zijn omslachtig en soms twijfelachtig. Verder is een diagnostische microbiologie laboratorium een ​​groot aantal pathogenen, variërend van enkele honderden tot enkele duizenden, dagelijks, die het gebruik van geautomatiseerde systemen moeten verwerken. Naast de behandeling van een hoge dagelijks volume wordt de nauwkeurige identificatie van bacteriële species nodig. Dit is gerechtvaardigd omdat zij verschillen in hun antimicrobiële gevoeligheid patroon en dus correcte identificatie geeft de clinicus met essentiële informatie om juiste antibiotica te kiezen (bijvoorbeeld Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43. Geautomatiseerde microbiële identificatiesystemen (AMIS) gestandaardiseerde sets enzymatische reacties van toepassing op de metabolische eigenschappen van bacteriële isolaten karakteriseren <sup&gt; 13,15,16,26,27. Hoewel de in deze systemen patronen maken gebruik van een groot aantal verschillende biochemische reacties, bijvoorbeeld 47 in de GN kaart van het AMIS gebruikt in deze studie 52 Deze strategie toelaat veilige identificatie slechts een beperkt aantal bacteriën. Bovendien is de database een geavanceerd expertsysteem, duidelijk gericht op detectie van relevante en zeer relevante bacteriën van medisch belang 13,15,16,36. Twee andere systemen op grote schaal gebruikt in laboratoria, ook deze biochemische benadering voor bacteriële identificatie passen. Recente studies tonen vergelijkbare identificatie nauwkeurigheid tussen de in deze studie AMIS en één van de deelnemers (93,7% en 93,0% respectievelijk), terwijl de 3 e AMIS een identificatie nauwkeurigheid van slechts 82,4% op species niveau 35. Dergelijke verschillen kunnen worden verklaard door de kwaliteit van de onderliggende identificatiegegevens gevonden, versies van kits en software, verschillen in metabolisme en vaardigheid van technisch personeel 35,36. Twee automatische MALDI-TOF MS systeem (MALDI-TOF microbiële identificatiesysteem, MMIS) worden hoofdzakelijk gebruikt. Deze systemen zorgen voor detectie van een groot aantal bacteriesoorten basis van hun eiwitten vingerafdruk massaspectra. Bijvoorbeeld, de databank van de MMIS gebruikte bevat 6000 referentiespectra. Identificatiesystemen op basis van massaspectrometrie bieden een snelle en betrouwbare detectie van een grote verscheidenheid aan micro-organismen waaronder zeldzame pathogenen 11,48,51. Tot op heden zijn slechts een paar directe vergelijkingen zijn beschikbaar tussen de in deze studie gebruikte MMIS en zijn concurrent 19,33. Volgens Dæk et al. Beide systemen een soortgelijk hoge nauwkeurigheid van identificatie, maar de in deze studie MMIS lijkt betrouwbaarder soortenidentificatie 19 zijn. Op dezelfde manier, het aanpakken van moleculaire technieken goed geconserveerd, maar ook verschillende genen ( <em&gt; bijvoorbeeld 16S rDNA of rpoB) laten een duidelijke soortidentificatie 3,22,61. Van deze, het 16S rDNA is de meest gebruikte housekeeping gen vanwege zijn aanwezigheid in alle bacteriën 34. Zijn functie blijft ongewijzigd en tenslotte, met ongeveer 1500 bp, het is lang genoeg is geschikt voor bio-informatica 14,34 te zijn. Veel onderzoekers beschouwen 16S rRNA-gen-analyse als de &quot;gouden standaard&quot; voor bacteriële identificatie 21. Dit komt door het feit dat weinig laboratoria DNA-DNA-hybridisatie technieken datum voor identificatie van zeldzame of nieuwe bacteriën 14,34. Bovendien, steeds meer databases beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor het 16S rRNA gen analyse 50. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat 16S rDNA gebaseerde detectiesystemen hebben een beperkte gevoeligheid dan standaard PCR-protocollen. Bovendien is de moleculaire benadering is verfijnd, tijdrovend en vereist goed opgeleid personeel engespecialiseerde laboratoria en is daarom niet gemakkelijk geïmplementeerd in routine diagnostische 55. Verder is aangetoond dat de combinatie van ten minste twee verschillende methoden voor bacteriële identificatie leidt tot zeer nauwkeurige stamidentificatienummer. De combinatie van MALDI-TOF MS en 16S rDNA sequentie maakt de identificatie van grote aantallen verschillende bacteriële soorten met hoge nauwkeurigheid. Onlangs heeft de combinatie van MALDI-TOF MS en 16S rRNA gen-analyse werd gepresenteerd voor bacteriële identificatie bestuderen epidemiologische vragen en zeldzame ziekteverwekkers 56.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Lyser LT</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>85600</td><td>Oscillerende homogenisator</td></tr><tr><td>Glass-beads 1.0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Taq PCR Core Kit (1.000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer TPU1 (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)</td><td>biomers.net, Ulm, Germany </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer RTU4 (5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3’)</td><td>biomers.net, Ulm, Germany </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler </td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>- </td><td>Thermocylcer</td></tr><tr><td>Reactiebuis 1,5 ml</td><td>SARSTEDT, Nümbrecht, Germany</td><td>72.692</td><td></td></tr><tr><td>Reactiebuis 2 ml</td><td>SARSTEDT, Nümbrecht, Germany</td><td>72.693.005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11 </td><td>Sharp Electronics, Hamburg, Germany</td><td>-</td><td>Microgolfoven</td></tr><tr><td>Titriplex III (EDTA Na2-zout dehydraat; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 tot 1.000 bp</td><td>Eurogentec, Luik, België</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenolblau (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen cyanyl FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi </td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide oplossing 1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, München, Germany</td><td>-</td><td>Gel-documentatiesysteem </td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 reacties)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Verenigd Koninkrijk</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer (10x) met EDTA </td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di formamide (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>-</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>MicroAmp optische 96-well reactieplaat met barcode</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, plaatbasis 96-well</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, plaathouder 96-well</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, plaatplaatjes</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymeer, 7 ml</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Analysis Software 5.4</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>-</td><td>Onze mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioMérieux, Nürtingen, Germany </td><td></td><td>2de mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>-</td><td>Apparaatbesturingssoftware</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>-</td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>α-cyano-4-hydroxycinnaminezuur, HCCA, 1 g</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Peptide Calibration Standard II</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 doel gepolijst staal</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab </td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Galaxy </td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>Artikelnr. 1836007 </td><td>Geautomatiseerd monstervoorbereidingssysteem</td></tr><tr><td>Vitek 2 </td><td>bioMérieux, Nürtingen, Germany </td><td></td><td>Onze aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan </td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Germany</td><td></td><td>2de aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix™ Automated Microbiology System</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td></td><td>3de aMIS</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC&reg; 25923&trade;)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, Frankrijk</td><td></td><td>Positieve controle voor PCR </td></tr></tbody></table>

identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16s rrna gene sequencing en maldi-tof ms

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Er zijn een aantal zeldzame en derhalve onvoldoende beschreven bacteriële pathogenen die naar verluidt ernstige infecties name in immuungecompromitteerde patiënten. Meestal slechts weinig gegevens, meestal gepubliceerd als case reports, beschikbaar die de rol van dergelijke pathogenen als een infectieus agens onderzoeken. Teneinde het pathogene karakter van dergelijke micro-organismen te verduidelijken, moet worden epidemiologische studies waarbij grote aantallen van deze bacteriën omvatten voeren. De in dergelijke surveillance onderzoeksmethoden moeten de volgende criteria voldoen: de identificatie van de stammen moet nauwkeurig volgens de geldende nomenclatuur zijn, moeten ze gemakkelijk te hanteren (robuustheid), zuinig routine diagnostiek en zij vergelijkbaar moeten genereren resultaten tussen verschillende laboratoria. Over het algemeen zijn er drie strategieën voor het identificeren van bacteriële stammen in een routine instelling: 1) het karakteriseren van de fenotypische identificatie Biochemical en metabolische eigenschappen van de bacteriën, 2) moleculaire technieken zoals 16S rRNA gensequentie en 3) massaspectrometrie als nieuw proteoom benadering. Aangezien massaspectrometrie en moleculaire benaderingen zijn de meest veelbelovende hulpmiddelen voor het identificeren van een grote verscheidenheid aan bacteriën, zijn deze twee methoden beschreven. Vorderingen, beperkingen en mogelijke problemen bij het gebruik van deze technieken worden besproken.

MALDI-TOF MS is een nieuwe, snelle en goedkope methode voor het microbiologische routine diagnostiek. Bacteriesoorten identificatie door MALDI-TOF MS spectra produceert hoofdzakelijk uit ribosomale eiwitten maar ook andere &quot;zeer geconserveerde eiwitten met huishouding functies die voor een minimale mate door omgevingsfactoren&quot; 17 .De database dit MMIS bevat een groot aantal referentiespectra en zelfs bacteriën die zelden worden gevonden in klinische isolaten kan veil...

Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Het algemene doel van dit MALDI-TOF-massaspectrometrie-protocol is het verbeteren van de typering van zeldzame pathogenen via een snelle en kosteneffectieve procedure. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de diagnostische microbiologie en maakt een snelle identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen mogelijk. Vandaag bespreken we odoratimimus en bacteriën van het geslacht Myroides.Om de methode te demonstreren en de interpretatie van de resultaten te bespreken. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn aan deze methode dit lastig vinden, aangezien de overdracht van bacteriën, het overlayen met metrieken en de interpretatie van resultaten technische vaardigheden en microbiologische expertise vereisen. We kregen aanvankelijk het idee om MALDI-TOF MS te gebruiken voor het screenen op zeldzame bacteriën toen we een patiënt in ons ziekenhuis hadden met een diabetische voetinfectie veroorzaakt door Myroides odoratissimus.Begin dit protocol met de extractie van bacterieel DNA, 16S ribosomaal DNA PCR en Sanger-sequencing zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een houten tandenstoker om een enkele bacteriële kolonie over te brengen naar een putje van een stalen targetplaat met 96 putjes. Breng één microliter 70% mierenzuur aan op het organisme dat aan de lucht is gedroogd op het stalen target, en laat dit ongeveer twee tot drie minuten drogen.Bedek de spot met één µL matrixoplossing die 50 mg/ml CHCA bevat in een organisch oplosmiddel bestaande uit 50% acetonitril, 2,5% trifluorazijnzuur en 47,5% water. Laat het uitstrijkje en de aangebrachte matrix ongeveer vijf minuten aan de lucht drogen in een zuurkast. Om de monsters in te voeren, wordt de monsterlaadpoort van de massaspectrometer belucht door op de in/uit-knop van het instrument te drukken.Open de laadpoort en plaats de MALDI-TOF MS-targetplaat met het gedroogde bacteriële uitstrijkje en de matrix. Sluit de poort en vacumeer opnieuw. Houd het vacuüm in de gaten en start de meting zodra deze 4,5 miljoen millibar bereikt.Open de MMIS-analysesoftware en klik op het bestandmenu. Selecteer "New Classification"; er wordt een nieuw venster geopend genaamd "MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard". Typ de projectnaam in het veld "Project Name" en klik op "New". Controleer in het nieuwe dialoogvenster "New Project" de projectnaam en ga verder door op de knop "Okay" te klikken.Observe in de MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard het venster voor de plaatsing van analyten. Selecteer de doelposities, klik met de rechtermuisknop op een geselecteerde positie en selecteer Add samples. Typ in de automatisch geopende tabelweergave de naam van het monster, het monster-ID en optioneel een opmerking in.Klik op de knop "Next" om verder te gaan. Bekijk vervolgens het venster met de selectie van MALDI Biotyper-methoden. Selecteer "Bruker Taxonomy" bij MSPs from Taxonomy Trees en klik op "Next" om door te gaan.Observe vervolgens het venster met de projectsamenvatting. Controleer de hierboven ingevoerde vermeldingen voor het feitelijke classificatieproject. Start de classificatieronde door op de knop "Finish" te klikken.Metingen starten automatisch zodra het juiste vacuüm is bereikt. Volg de classificatieron tot de meting succesvol is voltooid. Zodra de meting is voltooid, opent u het menu "View" en klikt u op "Results" om de resultatentabel in de MALDI Biotyper Real Time Classification Project One te bekijken.Bekijk de classificatieresultaten van de Bruker-Daltonik MALDI Biotyper als een html-bestand in de standaard webbrowser. Print en bewaar de resultaten. Hier worden spectra getoond die zijn verkregen via MALDI-TOF MS en die in realtime zijn gemeten en geclassificeerd.Aan de spectra wordt een soortnaam en een scorewaarde toegekend die de kwaliteit van de meting weerspiegelen. Scores boven 2.300 vertegenwoordigen een zeer waarschijnlijke soortidentificatie. Een score tussen 2.000 en 2.300 duidt op een zekere soortidentificatie.Een score onder 1.700 en 2.000 duidt op een waarschijnlijke soortidentificatie. Een score onder 1.700 is onbetrouwbaar. De identificatie van bacteriële pathogenen die zijn gekweekt in een zuivere cultuur op een vast medium duurt twee tot drie minuten.Het is belangrijk om te onthouden dat zeldzame bacteriële pathogenen alleen met MALDI-TOF MS kunnen worden aangetroffen wanneer de instrumenten betrouwbaar over de juiste spectra beschikken. In andere gevallen moet dit worden opgelost door MaSDA-spectra van getypeerde stammen van hun gekarakteriseerde isolaten te integreren. In situaties waarin de score-resultaten niet leiden tot een eenduidige stamidentificatie, kunnen verdere methoden worden toegepast, zoals biochemische profilering of 16S rDNA-sequencing.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de detectie van bacteriën, kan deze ook worden toegepast op andere micro-organismen, zoals schimmels of anaeroben. Bovendien kan bacteriële resistentie worden gemeten. Vergeet niet dat er gewerkt wordt met een matrix die een gevaarlijke stof is; draag handschoenen, een veiligheidsbril en werk onder een afzuigkap.Bovendien is het absoluut noodzakelijk om de matrix en het uitstrijkpreparaat grondig te drogen om spatten in de analysekamer te voorkomen.

identification-rare-bacterial-pathogens-16s-rrna-gene-sequencing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De toepassing van matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF) massaspectrometrie (MS) rechtstreeks bloed kweekbouillon versnelt de identificatie van bacteriën. De onderhavige methode is een snelle en betrouwbare methode voor de identificatie van Gram-negatieve bacteriën direct uit bloed kweekbouillon.

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

Dit werk beschrijft procedures voor snelle identificatie van bacteriën met behulp van MALDI-TOF MS. De identificatieprocedures omvatten spectrumverwerving, databaseconstructie en vervolganalyses. Er worden twee identificatiemethoden gepresenteerd, gebaseerd op gelijkeniscoëfficiënt en biomarker-gebaseerde methoden.

Het gebruik van MALDI-TOF-massaspectrometrie en een aangepaste database te Bacteriën inheemse karakteriseren naar een unieke Cave Milieu (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Massa-spectrometrie gebaseerde phyloproteomics (MSPP) werd gebruikt om een verzameling van Campylobacter jejuni ssp typen. Doylei isoleert De stam in vergelijking met multilocus volgorde typen (MLST).

subtypering van<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde PhyloProteomics (MSPP)

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde gestandaardiseerde protocol voor high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. Het protocol introduceert een protocol van het geïntegreerde, geüniformeerde haalbaar en goedkoop vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Dit protocol maakt analyse van grote aantallen monsters met strenge normen en diverse besturingselementen.

Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

IDBac is een open-source massaspectrometrie gebaseerde bioinformatica pijpleiding die gegevens van zowel intact eiwit en gespecialiseerde metaboliet spectra, verzameld op celmateriaal geschuurd uit bacteriële kolonies integreert. De pijpleiding stelt onderzoekers in staat om snel honderden tot duizenden bacteriële kolonies in putatieve taxonomische groepen te organiseren en ze verder te differentiëren op basis van gespecialiseerde metaboliet productie.

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Dit protocol maakt een snelle, kosteneffectieve evaluatie van de microbiële samenstelling in zuivelproducten mogelijk door culturomics te combineren met MALDI-TOF MS. Het levert taxonomieresultaten die vergelijkbaar zijn met 16S rRNA-sequencing met een kortere doorlooptijd dan traditionele kweekmethoden.

Evaluatie van de microbiële veiligheid van zuivelfabrieken met behulp van bacteriële proteomische profilering via de MALDI-benadering

Een eenvoudige methode voor de identificatie van de prioritaire bacteriële pathogenen is het gebruik van genetisch gemanipuleerd reporter faag. Deze verslaggever faag, die specifiek zijn voor hun specifieke gastheer soorten, zijn in staat om snel transduceren een lichtgevend signaal naar aanleiding van gastheercellen. Hierin beschrijven we het gebruik van de reporter faag voor de detectie...

&#39;Bioluminescent&#39; Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

Transparante zebravis embryo's hebben hun nut bewezen model hosts te visualiseren en functioneel onderzoek naar interacties tussen aangeboren immuunsysteem cellen en intracellulaire bacteriële pathogenen,...

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

Leer MALDI-TOF MS en 16S rRNA-sequencing voor snelle identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen zoals Myroides odoratimimus. Deze methode verbetert diagnostische microbiologie in klinische settings.

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

Meer video's verkennen