Name: Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer labelvrije detectie van enkele moleculen met FLOWER-technologie en microtoroïde optische resonatoren. Deze methode maakt biochemisch onderzoek naar eiwitvouwing en bindingskinetiek mogelijk zonder labels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door een National Research Service Award (T32GM07616) van het National Institute of General Medical Sciences.

1. Experimentele Setup en Monstervoorbereiding <ol><li> Fabriceren microtoroids met de lithografie, etsen en smelten procedure zoals eerder beschreven 6. Fabriceer microtoroids op een siliciumwafel (chip) dat typisch een grote diameter van 80-100 urn en een kleinste diameter van 2 urn. </li><li> Ontspan ongeveer een meter van de single-mode glasvezel (125 micrometer bekleding, 4,3 micrometer modus veld diameter) van de vezels spoel. </li><li> In het midden van het afgewikkelde deel van de optische vezel, strippen een klein segment (2,5 cm) van de polymere coating rondom de optische vezel via wire strippers. Opmerking: Dit is het deel van de optische vezel die zal worden gebruikt om evanescently paar licht in de microtoroıde. </li><li> Reinig de gestripte vezel met isopropanol alcohol en een pluisvrije doek. </li><li> Houd dit gedeelte van de vezel vast met een vezelhouder van magnetisch klemmen. </li><li> Dun de gestripte vezel tot ~ 500 nm door Melting en het trekken middels een waterstofatoom toorts en twee stappenmotoren bewegen in tegengestelde richtingen met 60 um / min. Plaats de optische vezel binnen het bovenste gedeelte van de vlam, die moet worden ~ 10 mm lang. Stoppen met het trekken van de vezel als de transmissie door de vezel stopt fluctuerende, die ofwel visueel kan worden gecontroleerd (door te kijken naar het licht dat zijdelings wordt verspreid van de vezel knipperen aan en uit), of door het aansluiten van de vezel van een fotodiode, die op een oscilloscoop is aangesloten . </li><li> Aanhangen het ene uiteinde van de optische vezel en plaats deze in een kale vezel-adapter. Plaats dit uiteinde van de vezel in de ingang van de foto-ontvanger. </li><li> Fiber paar het andere uiteinde van de vezel spoel laser met een vezeloptische koppelaar. </li><li> Plaats de microtoroıde chip op een monsterhouder (roestvrij staal, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) met behulp van epoxy of dubbelzijdig plakband. </li><li> Monteer de monsterhouder op een positioneertafel, dat bestaat uit een 3-as nano-positionering (nanocube) stadium (zie apparatuur lijst) op de top van een 3-assige micrometer. Voer alle experimenten op een pneumatisch geïsoleerde optische tafel om trillingen te minimaliseren. </li><li> Grof positie het monster chip met behulp van de 3-assige micrometer. </li><li> Lijn de-microtoroıde met chip parallel aan de optische vezel met behulp van de nano-klepstandsteller. Opmerking: Lijn de microtoroıde binnen een afstand van één golflengte van de input licht (~ 633 nm). Voor weergave van deze werkwijze gebruik van twee kolommen imaging (buis met objectief en camera, zie inventarislijst) gepositioneerd aan de bovenkant en aan de zijkant van de chip. </li><li> Optimaliseren van de polarisatie van het laserlicht doorheen de optische vezel via een in-line polarisatie controller (zie inventarislijst) met een knop om de polarisatie te passen. Opmerking: optimale polarisatie wordt bereikt wanneer de gemeten dip in de transmissie van de optische vezel wordt het smalste. Observeer deze duik op een oscilloscoop (zie stap 2.2 voor meer informatie). </li><li> Construereneen monster kamer door epoxying een glazen dekglaasje over het monster podium met een glazen microscoopglaasje als afstandhouder. Opmerking: Een plexiglas behuizing die de hele setup kan nuttig zijn voor het minimaliseren van luchtstromen zijn. Een kleine opening moet worden overgelaten om de oplossing via leiding te pompen. </li><li> Thermisch evenwicht deeltjessuspensies of single-molecule waterige oplossingen ≥ 1 uur in een waterbad RT (~ 500 ml). Opmerking: De monsters worden verdund tot de gewenste concentratie in microcentrifuge buisjes met behulp van de bijbehorende buffers opgegeven door de fabrikant, bijvoorbeeld PBS of HEPES. Indien geen bindinggebeurtenissen gedetecteerd, verhoging van de zoutconcentratie van de buffer. </li><li> Vortex deeltje bevattende oplossingen (1 ml) kort voor ~ 2 sec. </li><li> Injecteer deeltjes bevattende oplossingen in de monsterkamer bij 1 ml / min onder toepassing van een 1 ml spuit pomp. </li><li> Nadat het monster kamer is gevuld, schakelt u de injectiepomp. </li><li> Wacht 30 seconden voordat het vastleggen van gegevens te minimaliserende effecten van mechanische trillingen gevolg van fluïdumstroom die de meting kunnen beïnvloeden. </li></ol> 2. Frequentie Locking <ol><li> Opnieuw koppelen de torus de optische vezel door het bewegen van de monsterhouder met nanopositioner, omdat de koppeling wordt verstoord als gevolg van de injectie van vloeistof. </li><li> Zoek de resonantiegolflengte van de microtoroıde door het scannen van de computergestuurde laser invoer via verschillende golflengtes. Voer deze stap voor het sturen van een driehoekige golfvorm spanningssignaal om een ​​piëzo-elektrisch element in de laserbesturing, dat de golflengte van de laser regelt. Voeren experimenten met zichtbaar licht (635 nm ± 2,5 nm) omdat er lage absorptie van licht in het water bij deze golflengte. </li><li> Meet de lichttransmissie door de optische vezel door de stekker van de uitvoer van de optische vezel in een automatische uitgebalanceerde foto-ontvanger. Sluit de output van de foto-ontvanger in een oscilloscoop met een BNC kabel. Observeren on de oscilloscoop dat op de resonantie golflengte van de microtoroıde, transmissie via de optische vezel daalt. </li><li> Bevestig de output van de foto-ontvanger de belangrijkste ingang van de frequentie vergrendeling terugkoppelregeleenheid (zie inventarislijst) via een kabel. </li><li> Voer de frequentie vergrendeling feedback controller in autolock modus met behulp van top-of-peak vergrendeling met een dither frequentie van 2 kHz en een amplitude van oscillatie golflengte van 19 fm. Empirisch set de proportionele-integrale-afgeleide instellingen in de software-venster met behulp van Ziegler-Nichols tuning regels 14. Opmerking: Deze waarden hoeven slechts eenmaal aan het begin van alle experimenten. </li><li> Auto-lock de golflengte van de laser om de resonantie golflengte van de microtoroıde. Voer deze stap na het vullen van de monsterkamer. Opmerking: Als de golflengteverschuiving te groot is, dan is de feedback controller slot verliezen en schakelt automatisch over naar de scanmodus om de resonantie golflengte locatie te vinden. Dit ocstraathonden voor golflengte verschuift groter dan ongeveer een lijnbreedte (ten minste 600 fm voor alle systemen hier onderzocht). </li><li> Noteer de uitvoer van de terugkoppelregelaar bij 20 kHz met een 24-bit data acquisitie kaart. De gegevens te exporteren als een tekstbestand via data-acquisitie software. </li></ol> 3. Data Processing &amp; Analysis <ol><li> Fourier de gegevens om te zetten in MATLAB. </li><li> Lage passeren de gegevens met behulp van een &quot;brick-wall&quot; filter met een cut-off bij 1 kHz tot de opgelegde dither frequentie van 2 kHz te verwijderen (zie Aanvullende Code File screenshot 1). </li><li> Computationeel notch de gegevens filteren met behulp van een raam grootte van 16 Hz. Let op: Dit wordt gedaan om bekende bronnen van ruis te verwijderen, in dit geval, 60 Hz elektronische ruis en zijn harmonischen, evenals 100 Hz (afkomstig van de laser driver) en de harmonischen (zie Aanvullende Code File screenshot 1). </li><li> Omgekeerde Fourier transformatie van de data terug naar het tijdsdomein. </li><li> Mediaanfilter de gegevens met behulp van een venstergrootte van 1001 monsters (zie Aanvullende Code File Screenshot 2). </li><li> Lokaliseren stap veranderingen in de resonantie golflengte met behulp van de stappen vinden algoritme van Kerssemakers et al. 15. </li><li> Genereren van histogrammen van de amplitude van elke binding stap. </li><li> Bereken deeltjesgrootte met Eq. (1) (zie Discussie). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
<li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Als deeltjes bindt, de resonantie golflengte (λ) van de torus toeneemt. Wanneer een deeltje unbinds de resonantiegolflengte dienovereenkomstig afneemt (een naar beneden event). De deeltjesdiameter (d) kan worden bepaald door middel van histogrammen van de amplitude van elke golflengte stap. De hoogte van elke golflengtestap varieert als gevolg van variaties omvang van de gebonden deeltjes en door de ligging van de microtoroıde waarbij het deeltje bindt. De maximale verandering in resonantiegolflengte (...

Single molecule detectie experimenten ingezet om de hoeveelheid analyt die in biosensoren voor vroege detectie van ziekten en het onderzoek van de fundamentele eigenschappen van moleculen 3. Dergelijke experimenten worden typisch uitgevoerd met behulp labels echter etiketten niet altijd mogelijk verkrijgen voor een bepaald eiwit, verhogen de kosten, kan verstoren de gebeurtenissen bestudeerd en kan onhandig zijn, met name voor real time-eigen experimenten of point-of- care diagnostiek. De huidige gouden standaard voor ongelabelde biosensoren is oppervlakteplasmonresonantie 4, maar de commerciële oppervlakte plasmon resonance systemen hebben typisch een typisch onderste detectielimiet in de orde van nM. Onlangs hebben optische resonatoren ontpopt als een veelbelovende technologie voor het label-free single molecule BioDetection 5. Optische resonatoren werk gebaseerd op de lange termijn (ns) opsluiting van licht 6,7. Licht is evanescentlygekoppeld in deze apparaten meestal via een optische vezel. Wanneer de golflengte van het licht dat door de vezel komt overeen met de resonantiegolflengte van de resonator, licht efficiënt paren aan de resonator. Deze gekoppelde licht totaal intern reflecteert binnen de holte resonator genereren van een verdwijnende veld in de nabijheid van de omtrek van de resonator. Aangezien deeltjes komen het verdwijnende veld en binden aan de resonator, de resonantiegolflengte van de resonator verandert evenredig met het volume van het deeltje 8. Op het gebied van detectie vermogen, hebben microsferen resonatoren eerder is gebruikt om enkele influenza A-virus detecteren deeltjes (100 nm) 9,10. Recent zijn plasmonically versterkte microbolletjes optische resonatoren gebruikt om één runderserum albumine te detecteren moleculen 11 en 8-mer oligonucleotiden 12, maar deze benadering beperkt het deeltje capture gebied 0,3 um per 2 deondeugd. Groter gebied vast te leggen biosensoren zijn ideaal voor het maximaliseren van de kans op een deeltje detectie. Huidige-oplossing op basis-label vrij biosensing technologieën met grote (&gt; 100 micrometer 2) capture gebieden zijn beperkt tot het opsporen van polystyreen deeltjes ≥ 25 nm. We hebben een ongelabelde biosensoren gebaseerd op optische resonator techniek bekend als frequentievergrendeling Optical Whispering Evanescent Resonator (bloem) 13 (figuur 1) die in staat is tijdsopgeloste detectie van individuele moleculen in oplossing ontwikkeld. FLOWER maakt gebruik van de lange levensduur van foton microtoroıde optische resonatoren gecombineerd met een frequentie vergrendeling feedback control, evenwichtig detectie, en computationele filtering om kleine deeltjes te detecteren enkel eiwit moleculen. Het gebruik van frequentievergrendeling kan het systeem altijd volgen van de verschuiving van de resonantie microtoroıde als deeltjes binden, zonder te vegen of scan de laser golflengte bovengrote reeksen. De principes van de bloem kunnen worden gebruikt om de detectiemogelijkheden van andere technieken zoals plasmon enhancement verbeteren. Hierna worden de procedures voor het uitvoeren BLOEM beschreven.

<table><tbody><tr><td>Afstembare diodelaser</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Lasercontroller</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Frequentie-locking feedbackcontroller</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Automatisch uitgebalanceerde foto-ontvanger</td><td>Newport</td><td>Model 2007</td><td></td></tr><tr><td>Inline polarisatiecontroller</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>24-bit data-acquisitiekaart</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan interleukin-2</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>20 nm polystyreenkralen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Optische tafel</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Objectieflens voor beeldvormingskolom</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvormingskolom (adapterbuis)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>High-Res CCD-camera voor beeldvormingskolom</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

label-free single molecule detectie met behulp microtoroıde optische resonatoren

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecteren kleine concentraties van moleculen tot aan de individuele moleculen limiet heeft invloed op gebieden zoals vroege detectie van ziekten en fundamentele studies over het gedrag van moleculen. Single molecule detectietechnieken gewoonlijk gebruik labels zoals fluorescerende labels of quantum dots echter etiketten niet altijd beschikbaar, vergroten de kosten en complexiteit, en kan verstoren gebeurtenissen onderzocht. Optische resonatoren ontstaan ​​als een veelbelovende manier om enkele moleculen te detecteren zonder het gebruik van labels. Momenteel de kleinste deeltje gedetecteerd door een niet-plasmonically versterkte bare optische resonator systeem oplossing een 25 nm polystyreen bol 1. We hebben een techniek die bekend staat als Frequency vergrendelen Optical Whispering Evanescent Resonator (bloem) dat deze limiet kunnen overtreffen en het bereiken van label-free single molecule detectie in waterige oplossing 2 ontwikkeld. Zoals signaalsterkte schalen met deeltje volume, ons werk is een&gt; 100x improvement in de signaal-ruisverhouding (SNR) over de huidige stand van de techniek. Hier de procedures achteren bloem zijn voorgesteld in een poging om zijn gebruik in het veld te vergroten.

Deeltje binding gebeurtenissen zijn duidelijk gezien als een stap-achtige veranderingen in de resonantie golflengte van het microtoroıde na verloop van tijd (Figuur 2A). De hoogte van deze stappen worden getoond als een histogram in figuur 2B. De figuren 2-4 tonen vertegenwoordiger sporen uit de binding van exosomes (nanovesicles), 5 nm silica kralen, en single humaan interleukine-2-moleculen, respectievelijk. Het feit dat de stapvormige events schaal met een deeltjesgr...

We hebben een labelvrij biosensing-systeem ontwikkeld op basis van optische resonatortechnologie, bekend als Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), dat in staat is om enkele moleculen in oplossing te detecteren. Hier worden de procedures achter dit werk beschreven en gepresenteerd.

Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van enkelvoudige moleculen en ultrasmall nanoparticles zonder gebruik van labels, middels een techniek gebaseerd op optische resonator-technologie en frequentievergrendeling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in biochemische vakgebieden, zoals eiwitvouwing en bindingskinetiek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het doelmolecuul niet gelabeld hoeft te worden om gedetecteerd te kunnen worden.De opstelling voor deze techniek omvat het koppelen van een micro-OID-chip aan een optische vezel. Verkrijg eerst een micro-OID-chip. Dit is een siliciumchip van ongeveer 6,5 millimeter bij 5,5 millimeter waarop een micro-OID is gefabriceerd.Zoals in deze afbeelding te zien is, heeft de micro OID een hoofddiameter van 80 tot 100 micrometers en een nevendiameter van twee micrometers. Leg de chip voorlopig opzij en bereid de vezel voor om deze aan de chip te koppelen. Werk met single mode fiber op een spoel en rol ongeveer een meter van de vezel af.Neem een striptang en plaats deze ongeveer in het midden van de afgewikkelde vezel. Gebruik de tang om een segment van 2,5 centimeter van de polymeercoating van de vezel te strippen. Dit gestripte gebied is de koppelregio van de vezel.Reinig na het strippen van de vezel het gestripte gedeelte met een pluisvrije doek en isopropanol. Gebruik vervolgens een vezelhouder met magnetische klemmen om het gereinigde deel op zijn plaats te fixeren. Voor de volgende stap moeten stappenmotoren zo worden geplaatst dat zij de vezel in tegenovergestelde richtingen kunnen trekken.Positioneer de vezelhouders zodat de stappenmotoren aan beide zijden van het gestripte gedeelte aan de vezel kunnen worden bevestigd. Bevestig daarnaast een laser aan één uiteinde van de vezel om als lichtbron te dienen. Laat de stappenmotoren in tegenovergestelde richtingen bewegen om de vezel uit te rekken en gebruik een waterstofbrander om het gestripte deel van de vezel te smelten.Houd het zijwaarts verstrooide licht van de vezel constant in de gaten. Knipperen geeft aan dat de lichttransmissie door de vezel fluctueert en dat er verdere versmalling nodig is. Wanneer het knipperen stopt, kan het verhitten en trekken van de vezel worden gestaakt; de vezel zal dan versmald zijn tot ongeveer 500 nanometers.Nadat de vezel is versmald, koppelt u de lichtbron los en verwijdert u de vezel en de magnetische klemhouder uit de stappenmotoren. Verplaats de vezel vervolgens naar een pneumatisch geïsoleerde tafel die is uitgerust met de positioneringstabel. Plaats de vezel in de magnetische klemhouder op een steunblok vóór de samplechip.De positioneringstrap is een nano-positioneringstrap met drie assen op een micrometer met drie assen. Naast de nano-positioneringstrap zijn er beeldkolommen voor bovenaanzicht en zijaanzicht om bij de uitlijning te helpen. Werk verder met de vezel door ervoor te zorgen dat het gestripte gedeelte zich nabij de positioneringstrap bevindt.Bereid de invoering van het vrije uiteinde van de vezel in het meetsysteem voor. Nadat het vrije uiteinde is gekliefd, wordt dit in een adapter voor blote vezels geplaatst. Gebruik de adapter om de vezel aan te sluiten op de ingang van een automatisch gebalanceerde fotontvanger die is aangesloten op een oscilloscoop.Richt u nu op het andere uiteinde van de vezel. Bevestig dit uiteinde eerst aan een optische koppelaar. Koppel de vezel vervolgens aan de uitgang van een inline polarisator, die input ontvangt van een 50 50 beamsplitter en een ATT instelbare diodelaser.Hier is een schema van de verbindingen die tot dit punt zijn gemaakt. Let op dat de tweede uitgang van de bundelsplitser door een inline polarisator gaat en wordt gebruikt als referentie voor de automatisch gebalanceerde fotontvanger. De volgende stap is de voorbereiding om de micro-OID-chip te monteren met behulp van een monsterhouder van roestvrij staal.Gebruik dubbelzijdige tape om de chip op de monsterhouder te bevestigen. Plaats vervolgens de microchip bovenop de monsterhouder. Monteer nu de monsterhouder met de chip erop op de nanopositioneringstabel.Hier zijn de houder en chip geplaatst op de positioneringstabel met de drie X-micrometers. Positioneer de monsterchip grof ten opzichte van de vezel. Hier zijn de chip en vezel nadat de grove positionering is voltooid.Pas vervolgens de positioneerder verder aan en gebruik de beeldvormingskolommen om de chip parallel aan de optische vezel uit te lijnen. Met een micro OID met een lasergolflengte van de vezel is deze afbeelding die van een vezel en microt. Na de fijne positioneringsstap dient de ronde sticker nabij het centrum van het gezichtsveld als positioneringshulp. Ga nu over tot het zoeken naar de resonantiegolflengte van de micro.Genereer een driehoekig golfvorm-voltagesignaal om de lasergolflengte te regelen op ongeveer 635 nanometers plus of min 2,5 nanometers. Scan nu de golflengten om naar resonantie te zoeken. Observeer de transmissie door de vezel op de oscilloscoop.Let op dat de transmissie afneemt bij de resonantiegolflengte. Pas op dit punt de polarisatie van het laserlicht aan. Stel de inline polarisatiecontrollers in om de polarisatie van het laserlicht in de optische vezel te optimaliseren.Bekijk de output van de fotontvanger met de oscilloscoop en pas de polarisatie aan totdat de gemeten transmissiedip op zijn smalst is. Nadat de polarisatie is geoptimaliseerd, wordt er een monsterkamer geconstrueerd op de monstertafel.De kamer bestaat uit een glazen dekglas dat met epoxy is bevestigd aan een microscoopglasplaatje. Het glasplaatje fungeert als afstandhouder waardoor het dekglas over de chip en de vezel kan oversteken. Richt een spuitpomp van 1 mL en slang aan om experimentele monsters met een snelheid van 1 mL per minuut in de kamer te brengen.Neem vervolgens een monster van één milliliter op kamertemperatuur om in de pomp te laden. In dit geval is dit een oplossing met silica-beads van vijf nanometer. Observeer na het laden de monsterkamer en injecteer het monster. Stop wanneer de kamer gevuld is; de monsterinjectie is gestopt in deze kamer, die is gevuld met een oplossing die silica-beads van vijf nanometer bevat.Wacht 30 seconden om het effect van trillingen te minimaliseren en zoek vervolgens naar de resonantiegolflengte van de micro. Observeer opnieuw de dip en de transmissie door de vezel bij resonantie met behulp van de oscilloscoop. Dit is een schema van de experimentele opstelling op dit punt, inclusief de proportionele-integrale-afgeleide-controller of PID-controller.De integrator en de dither. Bedien de controller in de auto lock-modus met locking op de piektop. Stel de ditherfrequentie in op 2 kHz en stel de amplitude van de golflengteoscillatie in op 19 fm.Nadat de PID-instellingen empirisch zijn bepaald, wordt de golflengte van de laser automatisch vergrendeld op de resonantiegolflengte van de micro-oid. Verzamel gegevens door de output van de feedbackcontroller te registreren. Hier volgen representatieve sporen van de resonantieverschuiving in femtometers versus de tijd in seconden, gegenereerd met een protocol waarin drie verschillende bindende deeltjes in volgorde van grootte zijn gebruikt.De deeltjes zijn exosomen of nanovesikels. Silica-beads van vijf nanometer en humane interleukine-twee-moleculen. Let op de verschillende schalen van zowel de verticale als de horizontale assen in elke dataset.Het waarnemen van verschillende schalen in de data voor verschillende partikelgroottes is een indicatie dat de techniek correct is uitgevoerd. Wanneer een partikel bindt aan de oid, neemt de resonantiegolflengte van de OID toe, wat een stijging in het spoor veroorzaakt. Wanneer een partikel loslaat, neemt de resonantiegolflengte af, wat leidt tot een daling.De hoogte van elke golflengtestap wordt bepaald door de grootte van het deeltje en de positie ervan op de micro-OID. De tijdschalen worden bepaald door de OID-dynamiek van het deeltje. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer drie uur worden uitgevoerd als dit correct gebeurt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden alles zo schoon en stofvrij mogelijk te houden.

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Biosensoren-interface met complexe, biologische omgevingen en het uitvoeren van gerichte opsporing door het combineren van zeer gevoelige sensoren met zeer specifieke probes verbonden aan de sensor via oppervlakte modificatie. Hier tonen we het oppervlak functionalisering van silica optische sensoren met biotine met silaan koppelingsmiddelen aan de sensor en de biologische omgeving overbruggen.

Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

Wij beschrijven het gebruik van een kooldioxide laser reflow techniek silica trilholten, zoals vrijstaande microsferen en on-chip microtoroids fabriceren. De reflow-methode verwijdert oneffenheden, waardoor lange levensduur foton in beide apparaten. De resulterende apparaten hebben een zeer hoge kwaliteit factoren, waardoor toepassingen, variërend van telecommunicatie tot biodetection.

Fabricage van Silica Ultra High Quality Factor microresonators

This video demonstrates localized surface plasmon resonance imaging to detect protein secretions from a single cell. Using a microfluidic setup and a peptide-bound plasmonic nanostructure chip, changes in reflected light intensity at the resonance angle reveal interactions with secreted proteins from a single cell.

Localized Surface Plasmon Resonance Imaging to Detect Protein Secretions from a Single Cell

Fluorescent-core microcavity sensoren gebruiken een hoge-index quantum dot-coating in het kanaal van silica microcapillaries. Veranderingen in de brekingsindex van vloeistoffen gepompt capillaire kanalen leiden tot verschuivingen in de microcavity fluorescentie spectrum die kunnen worden gebruikt om het kanaal medium analyseren.

Synthese en Werking van TL-core microcavities voor Refractometermethode Sensing

Een verwijzing interferometer techniek, die is ontworpen om ongewenste laser jitterruis voor NanoDetection verwijderen, wordt gebruikt voor het sonderen van een ultra-hoge kwaliteit factor microcavity. Aanwijzingen voor de montage, installatie, en data-acquisitie worden verstrekt, naast het meetproces voor het opgeven van de holte kwaliteitsfactor.

Implementatie van een Reference Interferometer voor NanoDetection

Parametrische optomechanische excitaties zijn onlangs experimenteel aangetoond in microfluïdische optomechanische resonatoren door middel van optische stralingsdruk en gestimuleerde Brillouin-verstrooiing. Dit artikel beschrijft de fabricage van deze microfluïdische resonatoren samen met methodologieën voor het genereren en verifiëren van optomechanische oscillaties.

Fabricage en testen van Microfluidic Optomechanische oscillators

De schaalbaarheid en resolutie van conventionele optische manipulatietechnieken worden beperkt door diffractie. We omzeilen de diffractielimiet en beschrijven een methode om nanodeeltjes optisch over een chip te transporteren met behulp van een gouden oppervlak voorzien van een pad van nauw geplaatste C-vormige plasmonische resonantors.

Fabricage en exploitatie van een Nano-Optical transportband

Meerkleurige fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica omvat doorgaans omvangrijke en complexe detectiesystemen op basis van epifluorescentiemicroscopen. Hier beschrijven we een compact en modulair meerkleurig detectieschema dat gebruikmaakt van een reeks optische vezels om meerkleurige gegevens die door een enkele fotodetector worden verzameld, tijdelijk te coderen.

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Dit artikel volgt de levenscyclus van een siliciumnitridemembraanresonator, van ontwerp via fabricage tot karakterisering.

Fabricage en karakterisering van high-Q siliciumnitride-membraanresonatoren

Leer labelvrije detectie van enkele moleculen met FLOWER-technologie en microtoroïde optische resonatoren. Deze methode maakt biochemisch onderzoek naar eiwitvouwing en bindingskinetiek mogelijk zonder labels.

Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren

Meer video's verkennen