Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren
December 29th, 2015
We hebben een labelvrij biosensing-systeem ontwikkeld op basis van optische resonatortechnologie, bekend als Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), dat in staat is om enkele moleculen in oplossing te detecteren. Hier worden de procedures achter dit werk beschreven en gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om enkele moleculen en ultra kleine nanodeeltjes te detecteren zonder het gebruik van labels, met behulp van een techniek gebaseerd op optische resonatortechnologie en frequentie-locking. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in biochemische gebieden zoals eiwitvouwing en bindingskinetiek. Het grote voordeel van deze techniek is dat de doelmolecule niet gelabeld hoeft te worden om hem te detecteren.
De opzet voor deze techniek omvat het koppelen van een micro OID-chip aan een optische vezel. Verkrijg eerst een micro OID-chip. Dit is een ongeveer 6,5 millimeter bij 5,5 millimeter siliconenchip met een micro OID die erop is vervaardigd.
Zoals in deze afbeelding, heeft de micro OID een grote diameter van 80 tot 100 micrometer en een kleine diameter van twee micrometer. Leg de chip voorlopig opzij en bereid de vezel voor om de chip te koppelen. Werk met single mode vezel op een spoel en verwijder ongeveer een meter van de vezel.
Verkrijg draadstrippers en ongeveer in het midden van de afgerolde vezel. Gebruik ze om een segment van 2,5 centimeter van de polymeercoating van de vezel te strippen. Dit gestripte gebied is het koppelgebied van de vezel.
Na het strippen van de vezel, gebruik een pluisvrije doek en isopropanol alcohol om het gestripte gebied te reinigen. Gebruik vervolgens een vezelhouder met magnetische klemmen om het gereinigde gedeelte op zijn plaats te houden. Zorg voor de volgende stap dat stapmotoren zijn gerangschikt om de vezel in tegengestelde richtingen te trekken.
Positioneer de vezelhouder zodat de stapmotoren aan beide zijden van het gestripte gebied aan de vezel kunnen worden bevestigd. Bevestig bovendien een laser aan één uiteinde van de vezel om als lichtbron te dienen. Laat de stapmotoren in tegengestelde richtingen bewegen om de vezel te strekken en gebruik een waterstofbrander om het gestripte gedeelte van de vezel te smelten.
Controleer constant het licht dat lateraal vanuit de vezel wordt verstrooid. Knipperen geeft aan dat de lichttransmissie door de vezel fluctueert en er meer verdunning nodig is. Wanneer het knipperen ophoudt, stop met het verwarmen en trekken van de vezel, die zal zijn verdund tot ongeveer 500 nanometer.
Nadat de vezel is verdund, koppel de lichtbron los en verwijder de vezel en de magneetzaakhouders van de hardnekkige motoren. Vervolgens verplaats de vezel naar een pneumatisch geïsoleerde werktafel die is uitgerust met de positioneringsfase. Plaats de vezel in zijn magnetische klemmenhouder op een steunblok voor de monsterchip.
De positioneringsfase is een drie-assige nanopositioneringsfase bovenop een drie-assige micrometer. Naast de nanopositioneringsfase zijn er boven- en zijbeeldkolommen om te helpen met de uitlijning. Ga verder met de vezel door ervoor te zorgen dat het gestripte gedeelte dicht bij de positioneringsfase is.
Bereid u voor om het vrije uiteinde van de vezel in het meetsysteem te introduceren. Na het splijten van het vrije uiteinde, plaatst u het in een adapter voor een kale vezel. Gebruik de adapter om de vezel aan te sluiten op de ingang van een automatisch uitgebalanceerde foto-ontvanger die is aangesloten op een oscilloscoop.
Concentreer u nu op het andere uiteinde van de vezel. Bevestig eerst dit uiteinde aan een optische koppeling. Vervolgens koppelt u de vezel aan de uitgang van een inline polarisator, die invoer heeft van een 50 50 straalsplitser en ATT afstembare diodelaser.
Hier is een schematische weergave van de verbindingen die tot nu toe zijn gemaakt. Merk op dat de tweede uitgang van de straalsplitser door een inline polarisator gaat en wordt gebruikt als referentie voor de automatisch uitgebalanceerde foto-ontvanger. De volgende stap is om de micro OID-chip voor te bereiden om te monteren met behulp van een stalen monsterhouder.
Gebruik dubbelzijdig plakband om de chip aan de monsterhouder te bevestigen. Plaats vervolgens de microchip bovenop de monsterhouder. Monteer nu de monsterhouder met de chip bovenop de nanopositioneringsfase.
Hier staan de houder en chip op hun plaats op de positioneringsfase met de drie X's micrometer. Positioneer grof de monsterchip ten opzichte van de vezel. Hier zijn de chip en vezel nadat de grove positionering is voltooid.
Pas vervolgens de positioneerder verder aan en gebruik de beeldkolommen om de chip parallel aan de optische vezel uit te lijnen. Met een micro OID met een lasergolflengte van de vezel is deze afbeelding van een vezel en microt. Na de fijne positioneringsstap is de ronde sticker nabij het centrum van het gezichtsveld een positiehulpmiddel. Ga nu verder met het zoeken naar de resonantiegolflengte van de micro.
Genereer een driehoekige golfvormspanningssignaal om de lasergolflengte te regelen op ongeveer 635 nanometer plus of minus 2,5 nanometer. Scan nu de golflengtes om resonantie te zoeken. Observeer de transmissie door de vezel op de oscilloscoop.
Merk op dat bij de resonantiegolflengte de transmissie daalt. Werk nu aan het aanpassen van de polarisatie van het laserlicht. Pas de inline polarisatiecontrollers aan om de polarisatie van het laserlicht in de optische vezel te optimaliseren.
Bekijk de uitvoer van de foto-ontvanger met de oscilloscoop en pas de polarisatie aan totdat de gemeten transmissiedip het smalst lijkt. Na het optimaliseren van de polarisatie, bouwt u een monsterkamer. Op de monsterstap.
De kamer bestaat uit een glazen dekglas epoxy op een stuk microscoop.Slide. De slide dient als afstandhouder waardoor het dekglas over de chip en vezel kan overhangen. Regel een spuitpomp van één milliliter en slangen om experimentmonsters in de kamer te introduceren met één milliliter per minuut.
Verkrijg vervolgens een monster van één milliliter bij kamertemperatuur om in de pomp te laden. In dit geval is het een oplossing met silicabeadjes van vijf nanometer. Eenmaal geladen, observeert u de monsterkamer en injecteert u het monster. Stoppen wanneer de kamer gevuld is, is de monsterinjectie in deze kamer gestopt, die is gevuld met een oplossing die silicabeadjes van vijf nanometer bevat.
Na 30 seconden te hebben gewacht om het effect van trillingen te minimaliseren, zoekt u naar de resonantiegolflengte van de micro. Observeer opnieuw de dip en transmis
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een label-vrij biosensing-systeem dat gebruikmaakt van Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) technologie voor de detectie van enkele moleculen in oplossing. De beschreven methode maakt de detectie van ultrakleine nanodeeltjes mogelijk zonder de noodzaak van labeling, en beantwoordt belangrijke vragen in biochemisch onderzoek.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Nanotechnologie
- Optisch sensing
Achtergrond
- De detectie van enkele moleculen is cruciaal voor het begrijpen van biochemische processen.
- Traditionele methoden vereisen vaak labeling, wat het gedrag van moleculen kan veranderen.
- Optische resonatortechnologie biedt een nieuwe benadering van biosensing.
- Frequency locking verbetert de gevoeligheid en specificiteit bij detectie.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het detecteren van enkele moleculen zonder labels.
- Om het begrip van eiwitvouwing en bindingskinetiek te verbeteren.
- Om een betrouwbare techniek te bieden voor biochemische analyse.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een micro OID chip gekoppeld aan een optische vezel.
- Frequency locking om de detectiecapaciteiten te verbeteren.
- Label-vrije detectie van doelmoleculen.
- Experimentele opstelling waarbij fabricage van siliconen micro OID betrokken is.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van enkele moleculen in oplossing.
- Demonstratie van de voordelen van label-vrij biosensing.
- Inzichten in het gedrag van ultrakleine nanodeeltjes.
- Mogelijke toepassingen in verschillende biochemische velden.
Conclusies
- Het FLOWER-systeem vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in biosensing-technologie.
- Label-vrije detectie opent nieuwe wegen voor onderzoek in de biochemie.
- Deze methode kan verdere studies over moleculaire interacties faciliteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators addresses a critical bottleneck in early discovery by enabling direct, non-perturbative measurement of molecular interactions. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic studies, supporting risk-adjusted portfolio decisions. The FLOWER technique's sensitivity and label-free operation position it as a reusable platform for high-value R&D inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular binding and folding without label-induced artifacts.
- Supports mechanistic de-risking by providing real-time, quantitative detection of single molecule events.
- Improves predictive confidence in target engagement and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, label-free assay systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, reproducible readouts suitable for standardization across discovery teams.
- Enables rapid assessment of molecular interactions for screening readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting detection of disease-relevant biomolecules.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling sensitive, label-free detection in complex matrices.
- Reduces biological risk in preclinical advancement through robust, artifact-free measurement.
Pipeline & Workflow Integration
The FLOWER method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis testing and mechanistic validation before preclinical transition.
- Discovery Biology: Advances hypothesis-driven research by enabling direct measurement of molecular events.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates high signal-to-noise resonance shift data for comparative analysis of binding events.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity across discovery and preclinical phases.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, label-free detection platform adaptable to diverse molecular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes detection workflows and enhances reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical resonator setup and precision alignment.
- Demands access to specialized instrumentation, including microtoroid chips and frequency locking controllers.
- Necessitates rigorous cleanliness and dust control to maintain sensitivity.
- May require adaptation for different molecular targets or sample matrices.
- Operational throughput and scalability depend on technical proficiency and infrastructure.
