Name: In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het genereren van plasmacytoïde dendritische cellen uit gemeenschappelijke lymfoïde voorlopers met behulp van het AC-6 feeder-systeem. Deze techniek maakt grootschalige productie mogelijk voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor Drs. Markus Manz en Irving Weissman voor het verschaffen van reagentia. Wij erkennen ook de dienstverlening van de Flow cytometrische analyse en celsortering Core Facility van de Eerste en Tweede Core Laboratory bij National Taiwan University College of Medicine en NTU ziekenhuis, respectievelijk. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-my3) en de National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI en NHRI-EX103-10256SI).

C57BL / 6 wild-type muizen werden gekocht van de National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Alle muizen werden gefokt en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. Protocollen en het gebruik van dieren procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de National Taiwan University College of Medicine (Permit nummer: 20.120.075) goedgekeurd. Daarnaast onderzoekers er alles aan gedaan om het potentieel voor pijn, lijden of angst te verminderen in de dieren tijdens het uitvoeren van experimenten. Alle beschreven procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur uitgevoerd terwijl het dragen van handschoenen. 1. Bereiding van AC-6 voedingscellen Opmerking: De AC-6.21 (AC-6 in het kort) stromale cellijn 18 (geleverd door I. Weissman, Stanford University) moet in RPMI worden gehandhaafd, aangevuld met 15% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS). Om te dienen als feeder-cellen, AC-6 cellen zijn γ-bestraald met 3.000 rad (30Gy) een dag voor de co-cultuur om hun verspreiding te voorkomen. Note thbij AC-6 cellen hebben de neiging om hun differentiatie ondersteunende capaciteit verliezen als ze overvol tijdens het onderhoud, of als hun passage nummer is dan 20. <ol><li> Wash AC-6 cellen eenmaal met 1 ml Dulbecco&#39;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) en DPBS verwijderen door aspiratie. Behandel AC-6 cellen met 0,8 ml trypsine-oplossing (0,05% trypsine en 0,5 mM EDTA in DPBS) voor 3-5 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2 en dan stoppen de reactie door verdunning met 10 volumes kweekmedium maken enkele celsuspensie. </li><li> Seed AC-6 cellen bij 5.9x10 4 cellen / putje in 12-putjes en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N. Opmerking: De dichtheid van AC-6 cellen is zeer belangrijk omdat een lagere dichtheid zullen cdc generatie bevoordelen. Enten bij een dichtheid van 5.9x10 4 cellen / putje zal AC-6 tot confluentie bereiken de volgende dag, die optimaal is voor het afleiden van pDCs van CLPs. </li><li> Bestralen AC-6 cellen bij 3000 rad (30 Gy) met behulp γ-bestraler. AantekeningDe gebruikte dosis bestralen AC-6 is geoptimaliseerd om te voorkomen dat cellen uit prolifererende en toch levensvatbaar houden lang genoeg om de cytokinen en cel-cel-contact nodig is voor differentiatie van DC van CLPs verschaffen. </li><li> Zuig medium en vervangen door 1 ml compleet RPMI (RPMI met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 50 ug / ml gentamycine en 50 uM β-mercaptoethanol). </li></ol> 2. Isoleer BM cellen van muizen <ol><li> Offer muizen door CO 2 stikken en cervicale dislocatie. Plaats de muizen op een dissectie lade en steriliseren met 70% ethanol. Maak een insnijding in het midden van de buik en verwijder het vel van het distale deel van de muis met inbegrip van de huid die de onderste ledematen. </li><li> Ontleden muizen in een semi-steriele kap. Om het femur en tibiae los klem de femur boven en tibiae onder het kniegewricht. Maak de spieren van de botten met een schaar en plaats de botten in een 6 cm petrischaal met 5 ml compleet RPMI. </li><li> Verhuizen naar een steriele cultuur kap. Vul een 3 ml spuit verbonden met een 27G naald met volledig RPMI. Snijd de uiteinden van de botten met een schaar, en breng de 27G naald om het merg spoelen van de botten door zachtjes te injecteren volledig RPMI keer van elk eind. </li><li> Bereid een enkele celsuspensie door voorzichtig pipetteren de cellen en neer 3-5 keer in de kweekschaal met de spuit zonder naald. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 500 xg en decanteer het supernatant. </li><li> Lyse rode bloedcellen met 1 ml ACK buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) incuberen 1 min en stoppen van de reactie door verdunning met 10 volumina volledig RPMI. Sta cellen gedurende 5 minuten om pellet dood neer celklonten en weefsel puin door de zwaartekracht staan. Opmerking: Ga niet meer dan 5 minuten, omdat dit zal resulteren in cel verlies als gevolg van de afwikkeling van levensvatbare cellen. </li><li> Langzaam decanteer-cel supernatant naar een nieuwe buis verlaat puinachter in de originele buis. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 xg om de cellen te pelleteren, verwijder de bovenstaande vloeistof. </li><li> Resuspendeer totale BM cellen (gewoonlijk 4-6 x 10 7 BM cellen zijn uit een muis) in 100 ui FACS-buffer (1x PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA). </li></ol> 3. FACS Analyse en sorteren van CLPs <ol><li> Add anti-CD16 / 32 (hybridoma supernatant kloon 2.4G2, 50 ul / reactie of 1-2 ug / reactie) in cellen in FACS-buffer (stap 2,9) gedurende 1-2 min om Fc-receptoren te blokkeren. Opmerking: Anti-CD16 / 32 wordt ook genoemd Fc blok, dat wordt toegevoegd aspecifieke binding van antilichamen te voorkomen dat cellen die Fc-receptoren zoals granulocyten, monocyten en B-lymfocyten. </li><li> Gelijktijdig vlek cellen met de volgende fluorescerende kleurstof gemerkte antilichamen (voor 4x10 7 cellen) gedurende 15 min op ijs, het vermijden van omgevingslicht. Antibodies: PE-geconjugeerde lineage markers (0,2 ug elk) waaronder anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD 11 b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), en anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 ug anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 ug anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 ug anti-M-CSFR-APC (AFS98) en 0,2 ug anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li> Was de cellen met 3 ml FACS buffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g. </li><li> Resuspendeer de cellen in 300 ui FACS-buffer en filtercellen door een 40 uM cel zeef. </li><li> Was de buis met een extra 100 ui FACS buffer om eventuele resterende cellen te herstellen en filter in een steriele FACS sortering buis met behulp van dezelfde cel zeef. </li><li> Voeren flowcytometrische analyse direct na de kleuring met behulp van geschikte filters en spanningen voor detectie. Gebruik 488 nm laser om de FITC, PerCP-Cy5.5 gemerkte antilichamen, 561 nm laser om de PE- en de PE-Cy7-labelded antilichamen en 633 nm las detecteerter de APC-gemerkte antilichaam te detecteren. </li><li> Sorteren CLPs volgens de volgende markers lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (zoals lood in stap 3,2) met een cell sorter. Verzamel de cellen gesorteerd in een 15 ml buisje met 8 ml compleet RPMI als kussen. </li><li> Noteer het absolute aantal gesorteerde cellen zoals getoond door de cel sorteerder aan het eind van de run. Meestal kan 5x10 4 CLPs worden verkregen uit het BM van een muis. </li></ol> 4. Coculture CLPs en AC-6 <ol><li> Centrifugeer de cellen gesorteerd uit stap 3,7 gedurende 10 min bij 500 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet met voldoende compleet RPMI tot een celdichtheid te verkrijgen ongeveer 5x10 4 cellen / ml. Seed 500 cellen / putje in de 12-wells plaat met voedingscellen bereid in stap 1,4. </li><li> Voeg 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig gegenereerde interne toepassing van een expressiesysteem door M. Manz, University Hospital Zürich, Zwitserland) en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 periodieke visuele controle van DC ontwikkeling onder een microscoop. Opmerking: In de handel verkrijgbare recombinant humaan of muizen FL FL kan worden gebruikt als vervanging voor hu-Flt3L-Ig DC ontwikkeling. </li><li> Verzamel de cellen in de supernatant op dag 12 en spoel de wells eenmaal met 0,5 ml compleet RPMI-medium combineren van de resulterende supernatanten. Voeg 0,5 ml vers medium en schroot van de hechtende cellen met een cel schraper. </li><li> Combineer het celbevattende medium uit beide delen en centrifugeer 5 min bij 500 x g. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer cellen in 50 ul FACS buffer. Voeg 50 ul anti-CD16 / 32 hybridoma supernatant en incubeer gedurende 1-2 min aan Fc-receptoren te blokkeren. </li><li> Sommen en vlekken alle cellen met de volgende antilichamen (0,05 ug elk) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD 11 b-FITC en anti-B220-PE. </li><li> Was en centrifuge de cellen zo te beschrijvend in stap 3.3. </li><li> Resuspendeer de cellen in 100 ui FACS-buffer, hek aan CD 11 c + en analyseren CDC (CD 11 c + CD11b + B220 -) en pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17. </li></ol>

<ol><li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li>
<li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell+lineage%3A+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li>
<li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li>
<li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li>
<li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li>
<li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li>
<li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li>
<li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+differentiation%3A+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li>
<li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li>
<li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+recent+progress+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li>
<li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li>
<li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li>
<li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines%3A+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li>
<li>Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een in vitro kweeksysteem voor de robuuste genereren van DCs en pDCs name uit een klein aantal CLPs. Het unieke van deze cultuur systeem door het gebruik van AC-6 cellen, een stromale cellijn, zoals feeders. Deze benadering is aangetoond dat niet alleen de cytokinen, zoals IL-7, SCF, M-CSF en FL 20 geven, maar ook de cel-cel contact 21 noodzakelijk DC ontwikkeling. AC-6 cellen zijn eerder gebruikt voor de studie van de in vitro DC ontwikkeling van verscheidene ...

Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigeenpresenterende cellen die een belangrijke rol spelen bij het ​​regelen immuunreacties 1. Hoewel DCs zijn heterogeen, kunnen zij in grote lijnen worden ingedeeld in twee populaties, conventionele DC (CDC) en plasmacytoïde DCs (pDCs) 2,3. Naast lymfoïde organen, zijn CDCs en pDCs ook gevonden in weefsels waaronder longen, darmen en huid 2. De morfologie van CDCs en pDCs verschilt met CDCs vertonen dendriet uitsteeksels en de vorm van pDCs die meer plasma celachtige. Verder wordt een gemeenschappelijke muis DC marker, CD 11 c, sterker uitgedrukt op CDCs dan op pDCs. Bovendien kan CDCs verder worden onderverdeeld in CD11b + CD24 - CDCs en CD11b - CD24 + CDCs, die beide tot expressie hogere niveaus van MHC klasse II en costimulatoire moleculen doen dan pDCs 2. Oudere pDCs, anderzijds, bleken selectieve expressie Siglec-H en BST2 4. Functionally, CDCs beter antigeenpresenterende cellen dan zijn pDCs; kan echter pDCs een grote hoeveelheid type I interferon na virusinfectie of inflammatoire stimulatie 5 produceren. Zowel CDC en pDCs zijn van korte duur, en daarom moet voortdurend worden aangevuld uit voorlopercellen in het beenmerg (BM) 6,7. Adoptieve overdracht van gewone myeloïde voorlopercellen (CMP) en gebruikelijke lymfoïde voorlopers (CLPs) in lethaal bestraalde muizen toont aan dat CDCs en pDCs kunnen uit beide geslachten 8-10. Er is echter een subset van pDCs die RAG1 / 2 tot expressie en bezitten DJ geherrangschikte segmenten op de IgH locus 11,12. Deze cellen delen ook moleculaire gelijkenissen met B-lymfocyten, met inbegrip van de expressie van de B220 marker, nucleïnezuur sensing receptoren (TLR7 / TLR9), en transcriptiefactoren (SPIB en Bcl11a) 13, voorzien van alle verondersteld om handtekeningen van de lymfoïde afkomst zijn. Daarom CLPs kunnen goede keuzes voor de in vitro generatie van pDCs vanwege afstamming gelijkenis. Terwijl de frequentie van zowel CDC en pDCs bij mensen en muizen is zeer laag 6, DCs, met name CDCs kan worden gegenereerd in vitro van BM of progenitoren in aanwezigheid van cytokinen, zoals GM-CSF of 11,14 Flt3 ligand (FL ) met behulp van-feeder vrije systemen 11,15,16. Helaas is het niet mogelijk grote aantallen pDCs in vitro gebruik van FL 11,15,16 produceren. Eerder hebben we aangetoond dat pDCs efficiënt kunnen worden gegenereerd in vitro uit CLPs met behulp van de AC-6 feeder-systeem 17. Het voordeel van de AC-6 stromale cellijn in het kweeksysteem is dat het cel-cel contact en uitscheiding van cytokinen die het genereren van grote aantallen pDCs steun van CLPs. Hoewel de productie met dit systeem is zeer robuust, is een zorgvuldige replicatie van de procedures hieronder beschreven vereiste in het oog op een efficiënte opwekking van pDCs garanderen.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse&nbsp; CD11b (PE), clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>afstammingsmarker/FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>afstammingsmarker</td></tr><tr><td>Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Celsorteerder</td></tr><tr><td>FACS sorting tube&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Flow analyse software</td></tr></tbody></table>

in vitro generatie van muriene plasmacytoïde dendritische cellen van common lymfoïde progenitors met behulp van de ac-6 feeder system

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs) zijn krachtige type I interferon (IFN-I) producerende cellen die geactiveerd worden in reactie op infectie of tijdens ontstekingsreacties. Helaas is studie van PDC-functie gehinderd door hun lage frequentie in lymfoïde organen, en de bestaande methodes voor in vitro DC generatie overwegend voorstander van de productie van CDCS dan pDCs. Hier presenteren we een unieke benadering om efficiënt genereren pDCs van zachte lymfoïde voorlopers (CLPs) in vitro. Specifiek, het protocol beschreven hoe zuiveren CLPs uit beenmerg en pDCs genereren door coculturing met γ bestraalde AC-6 voedingscellen in de aanwezigheid van Flt3 ligand. Een uniek kenmerk van dit kweeksysteem dat de CLPs migreren onder de AC-6 cellen en wordt geplaveide-gebied vormende cellen, een kritische stap voor de uitbreiding pDCs. Morfologisch onderscheiden DCs, namelijk pDCs en CDCs werden gegenereerd na ongeveer 2 weken met een samenstelling van 70-90% pDCs onder optimale omstandigheden. Kenmerkend het aantal pDCs gegenereerd door deze methode is ongeveer 100-voudig van het aantal geënte CLPs. Dit is dus een nieuw systeem waarmee robuust genereren grote aantallen pDCs vereist verder onderzoek naar de ontwikkeling en functie van deze cellen vergemakkelijkt.

Een totaal van 7 4-6x10 BM cellen worden gewoonlijk geïsoleerd uit dijbenen en scheenbenen van een 6-8 weken oude wildtype C57BL / 6 muis. Uitzoeken CLPs, zijn totale BM cellen gekleurd met PE-geconjugeerde antilichamen tegen lineage markers (CD3, CD8, B220, CD19, CD 11 b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 en MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC en anti-IL-7Rα-PE / Cy7, geanalyseerd en gesorteerd met een cell sorter. De sortering strategie CLP is weergegeven in figuur 1.</str...

In deze studie presenteren we een in vitro kweeksysteem dat efficiënt pDC's kan genereren door co-cultiveren van gemeenschappelijke lymfoïde progenitorcellen met AC-6 feedercellen in aanwezigheid van Flt3-ligand.

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een efficiënte methode voor het genereren van plasmacytoïde dendritische cellen of PDCs voor de studie naar hun ontwikkeling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals: hoe wordt de ontwikkeling van PDCs gereguleerd? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het mogelijk maakt om met een klein aantal progenitorcellen efficiënt grote hoeveelheden PDCs te genereren.De implicaties van deze techniek zijn relevant voor de therapie van PDC-geassocieerde auto-immuunziekten zoals systemische lupus, athetose en psoriasis. Het demonstreren van de procedure vandaag zal een grote student uit het laboratorium zijn. Zaai op de dag vóór de oogst van beenmergcellen AC six stromale cellijncellen in een dichtheid van 5,9 × 10⁴ cellen per well in individuele wells van 12-wells platen en incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. De volgende ochtend worden de AC six cellen bestraald met gamma-straling bij 3000 rad en wordt het cultuurmedium vervangen door 1 mL compleet medium.Plaats vervolgens het juiste aantal volwassen wild-type C 57 black six muizen in een dissectieschaal en steriliseer de dieren met 70% ethanol. Verplaats de schaal daarna naar een semi-steriele zuurkast en maak incisies in de middenbuik van elk dier. Verwijder de huid van de distale delen, inclusief de onderste extremiteiten om de femurs en tibiae vrij te maken; knip de femur boven en de tibiae onder de kniegewrichten door en gebruik een schaar om de spieren van de botten te scheiden terwijl deze worden verzameld. Plaats de botten in een Petri-schaal van 6 cm die 5 mL compleet RPMI bevat en breng de Petri-schaal over naar een steriele kweekkast.Vul nu een spuit van 3 ml, voorzien van een naald met gauge 27, met compleet RPMI en gebruik een schaar om beide uiteinden van elk bot af te knippen. Steek de naald in elk bot en spoel het merg schoon door aan elk uiteinde één keer voorzichtig compleet RPMI in te spuiten. Aspireer en doseer de cellen vervolgens, zonder de naald, drie tot vijf keer voorzichtig in de kweekschaal om een enkelcel-suspensie te verkrijgen.Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, worden de rode bloedcellen gelyseerd met één milliliter CK-buffer, waarna de reactie wordt gestopt met 10 volumes compleet RPMI. Laat na één minuut de klonten dode cellen en het debris vijf minuten bezinken en schenk vervolgens voorzichtig het supernatant af in een nieuwe buis. Na het opnieuw centrifugeren van de cellen suspenderen we de totale beenmergcellen in 100 microliters FACS-buffer om de common lymphoid progenitors of CLP's te analyseren middels flowcytometrie.Voer vervolgens een FC-blokkering van de cellen uit met anti-CD 16 tot 32 gedurende één tot twee minuten, gevolgd door gelijktijdige kleuring van de cellen met de juiste antilichaamcocktail. Was de cellen na 15 minuten op ijs in drie milliliter fax-buffer en resuspendeer het pellet in 300 µL verse fax-buffer. Filtreer vervolgens de celsuspensie door een 40 µm zeef en sorteer de cellen onmiddellijk op een flowcytometer met behulp van de juiste filters en voltages.Verzamel de cellen van belang in een buis van 15 milliliter, met daarin acht milliliter volledig RPMI. Om een sterk verrijkte PDCM-populatie te genereren, is het cruciaal om de juiste populatie CLP's uit het geoogste beenmergcelmateriaal te sorteren voor hun in vitro kweek met een Z six-feedersysteem. Centrifugeer aan het einde van de sortering de cellen en resuspendeer het CLP-celpellet met voldoende volledig RPMI om een celdichtheid van ongeveer 5 × 10⁴ cellen per milliliter te verkrijgen.Zaai vervolgens 500 cellen per putje in de 12-wells plaat die de AC zes feeder-cellen bevat en vul de co-culturen aan met 100 ng/mL FL drie ligand, incubeer de cellen vervolgens bij 37 °C en 5% CO2 met periodieke visuele monitoring van de ontwikkeling van de dendritische cellen of DC onder een microscoop. Oogst op dag 12 de cellen in het supernatant van de co-cultuur en was elk putje eenmaal met 0,5 mL compleet RPMI-medium, waarbij het resulterende supernatant en de wasbeurten worden samengevoegd. Voeg vervolgens 0,5 mL vers medium toe aan elk putje en gebruik een celschraper om de adherente cellen los te maken.Combineer de losgekoppelde cellen met de drijvende cellen en centrifugeer de resulterende celсусpensie. Resuspendeer het pellet in 50 µL Fc-buffer. Tel vervolgens de cellen en kleur ze voor de expressie van CD11c, CD11b en B220 na Fc-blocking.Zoals zojuist gedemonstreerd, kunnen de co-cultuurcellen vervolgens worden geanalyseerd op de aanwezigheid van conventionele CD11c-positieve, CD11b-positieve, B220-negatieve en plasmacytoïde CD11c-positieve, CD11b-negatieve, B220-positieve DC-populaties, met een totaal van 4 tot 6 × 10⁷ beenmergcellen. Beenmergcellen worden doorgaans geïsoleerd uit de femuren en tibia van een 6 tot 8 weken oude wild-type C57BL/6 muis, waarbij gewoonlijk 5 × 10⁴ CLP's uit één C57BL/6 muis worden verkregen. Na sortering via flowcytometrie, zoals zojuist gedemonstreerd, beginnen op dag 3 tot 4 van de co-cultuur met AC6-feeder-cellen cobblestone area-forming cells te verschijnen, waarbij rondvormige plasmacytoïde DC's gesuspendeerd bovenop de cobblestone area-forming cells verschijnen.Tegen dag acht bereikt het aantal plasmacytoïde DC's een piek rond dag 12 tot 14, waarna de cellen na hun volledige ontwikkeling apoptose ondergaan en hun aantallen geleidelijk beginnen af te nemen. Conventionele DC-kolonies verschijnen later, op dag zes tot acht, en zijn adherent met een grotere spoelvormige morfologie. Flowcytometrische analyse laat zien dat de cocultures bestaan uit 91% CD11c-positieve, CD11b-negatieve, B220-positieve plasmacytoïde DC's en 6% CD11c-positieve, CD11b-positieve, B220-negatieve conventionele DC's, wat duidt op een 100-voudige expansie van het aantal plasmacytoïde DC's ten opzichte van de oorspronkelijke CLP-populatie middels deze methode.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er zeker van te zijn dat de C6-cel in goede conditie is en dat de C-dichtheid correct is voordat de CLP na een ontwikkeling wordt toegevoegd. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de DC-biologie om de beperking van het gebruik van een klein aantal projectoren te overwinnen bij het bestuderen van DC-ontwikkeling vanuit verschillende projectoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u PC's in vitro kunt genereren uit CLP met behulp van een C6 BEAT-systeem.

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Antigeen presentatie in secundaire lymfoïde organen door de dendritische cellen is cruciaal voor de opening van het T-cel gemedieerde adaptieve immuunrespons. Hier laten we zien de cultuur van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, activering, en de etikettering voor 2-photon imaging.

Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

This video describes a protocol for the generation of dendritic cells--key antigen-presenting cells that activate T cells--from the bone marrow of an adult mouse.

Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Generation: A Method to Generate Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow

Source: Cruz-Adalia, A., et al. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates bacterial transinfection through antigen-specific T cell–dendritic cell interactions. Bacteria-infected dendritic cells presenting ovalbumin peptide are incubated with T cells, either directly or separated by a membrane. Direct contact allows immunological synapse formation, enabling bacterial transfer, while the membrane prevents interaction. Gentamicin...

In Vitro Bacterial Transinfection of T Cells via Immunological Synapse Formation

This video demonstrates an in vitro assay to generate plasmacytoid dendritic cells (pDCs) from common lymphoid progenitor cells (CLPs). Upon co-culturing purified CLPs with γ-irradiated feeder cells in the presence of Fms-like tyrosine kinase-3 ligand (FL), the CLPs differentiate into non-adherent pDCs, the presence of which is confirmed using flow cytometry.

In Vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors

Dit protocol beschrijft experimentele procedures om de differentiatie van plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer's patch van zachte dendritische celvoorlopers nagegaan met behulp van technieken met FACS-gemedieerde isolatie hydrodynamische gentransfer en flow-analyse van immune subsets in Peyer's patch.

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Immature dendritische cellen kunnen selectief worden gedifferentieerd in tolerogeen of rijpe dendritische cellen om het evenwicht tussen immuniteit en tolerantie te reguleren. Dit werk presenteert een manier om vanuit onrijpe, uit monocyten afgeleide dendritische cellen (moDC's) in vitro tolerogeen en rijpe moDC's te genereren die verschillen in metabolische fenotypen.

Generatie van onrijpe, Ouder en tolerogene dendritische cellen met verschillende Metabolic Phenotypes

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Hier presenteren we een protocol voor in vivo vergroting van gut-homing regulatoire T Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen om lokaal hoge concentraties van de actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2d) en de actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA) de Novo te produceren.

In vivo augmentatie van gut-homing regulatoire T Cell inductie

Leer een efficiënte methode voor het genereren van plasmacytoïde dendritische cellen uit gemeenschappelijke lymfoïde voorlopers met behulp van het AC-6 feeder-systeem. Deze techniek maakt grootschalige productie mogelijk voor immunologisch onderzoek.

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System (Video) | JoVE Journal

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Meer video's verkennen