In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een efficiënte methode voor het genereren van plasmacytoïde dendritische cellen of PDCs voor de studie naar hun ontwikkeling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals: hoe wordt de ontwikkeling van PDCs gereguleerd? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het mogelijk maakt om met een klein aantal progenitorcellen efficiënt grote hoeveelheden PDCs te genereren.

De implicaties van deze techniek zijn relevant voor de therapie van PDC-geassocieerde auto-immuunziekten zoals systemische lupus, athetose en psoriasis. Het demonstreren van de procedure vandaag zal een grote student uit het laboratorium zijn. Zaai op de dag vóór de oogst van beenmergcellen AC six stromale cellijncellen in een dichtheid van 5,9 × 10⁴ cellen per well in individuele wells van 12-wells platen en incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. De volgende ochtend worden de AC six cellen bestraald met gamma-straling bij 3000 rad en wordt het cultuurmedium vervangen door 1 mL compleet medium.

Plaats vervolgens het juiste aantal volwassen wild-type C 57 black six muizen in een dissectieschaal en steriliseer de dieren met 70% ethanol. Verplaats de schaal daarna naar een semi-steriele zuurkast en maak incisies in de middenbuik van elk dier. Verwijder de huid van de distale delen, inclusief de onderste extremiteiten om de femurs en tibiae vrij te maken; knip de femur boven en de tibiae onder de kniegewrichten door en gebruik een schaar om de spieren van de botten te scheiden terwijl deze worden verzameld. Plaats de botten in een Petri-schaal van 6 cm die 5 mL compleet RPMI bevat en breng de Petri-schaal over naar een steriele kweekkast.

Vul nu een spuit van 3 ml, voorzien van een naald met gauge 27, met compleet RPMI en gebruik een schaar om beide uiteinden van elk bot af te knippen. Steek de naald in elk bot en spoel het merg schoon door aan elk uiteinde één keer voorzichtig compleet RPMI in te spuiten. Aspireer en doseer de cellen vervolgens, zonder de naald, drie tot vijf keer voorzichtig in de kweekschaal om een enkelcel-suspensie te verkrijgen.

Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, worden de rode bloedcellen gelyseerd met één milliliter CK-buffer, waarna de reactie wordt gestopt met 10 volumes compleet RPMI. Laat na één minuut de klonten dode cellen en het debris vijf minuten bezinken en schenk vervolgens voorzichtig het supernatant af in een nieuwe buis. Na het opnieuw centrifugeren van de cellen suspenderen we de totale beenmergcellen in 100 microliters FACS-buffer om de common lymphoid progenitors of CLP's te analyseren middels flowcytometrie.

Voer vervolgens een FC-blokkering van de cellen uit met anti-CD 16 tot 32 gedurende één tot twee minuten, gevolgd door gelijktijdige kleuring van de cellen met de juiste antilichaamcocktail. Was de cellen na 15 minuten op ijs in drie milliliter fax-buffer en resuspendeer het pellet in 300 µL verse fax-buffer. Filtreer vervolgens de celsuspensie door een 40 µm zeef en sorteer de cellen onmiddellijk op een flowcytometer met behulp van de juiste filters en voltages.

Verzamel de cellen van belang in een buis van 15 milliliter, met daarin acht milliliter volledig RPMI. Om een sterk verrijkte PDCM-populatie te genereren, is het cruciaal om de juiste populatie CLP's uit het geoogste beenmergcelmateriaal te sorteren voor hun in vitro kweek met een Z six-feedersysteem. Centrifugeer aan het einde van de sortering de cellen en resuspendeer het CLP-celpellet met voldoende volledig RPMI om een celdichtheid van ongeveer 5 × 10⁴ cellen per milliliter te verkrijgen.

Zaai vervolgens 500 cellen per putje in de 12-wells plaat die de AC zes feeder-cellen bevat en vul de co-culturen aan met 100 ng/mL FL drie ligand, incubeer de cellen vervolgens bij 37 °C en 5% CO2 met periodieke visuele monitoring van de ontwikkeling van de dendritische cellen of DC onder een microscoop. Oogst op dag 12 de cellen in het supernatant van de co-cultuur en was elk putje eenmaal met 0,5 mL compleet RPMI-medium, waarbij het resulterende supernatant en de wasbeurten worden samengevoegd. Voeg vervolgens 0,5 mL vers medium toe aan elk putje en gebruik een celschraper om de adherente cellen los te maken.

Combineer de losgekoppelde cellen met de drijvende cellen en centrifugeer de resulterende celсусpensie. Resuspendeer het pellet in 50 µL Fc-buffer. Tel vervolgens de cellen en kleur ze voor de expressie van CD11c, CD11b en B220 na Fc-blocking.

Zoals zojuist gedemonstreerd, kunnen de co-cultuurcellen vervolgens worden geanalyseerd op de aanwezigheid van conventionele CD11c-positieve, CD11b-positieve, B220-negatieve en plasmacytoïde CD11c-positieve, CD11b-negatieve, B220-positieve DC-populaties, met een totaal van 4 tot 6 × 10⁷ beenmergcellen. Beenmergcellen worden doorgaans geïsoleerd uit de femuren en tibia van een 6 tot 8 weken oude wild-type C57BL/6 muis, waarbij gewoonlijk 5 × 10⁴ CLP's uit één C57BL/6 muis worden verkregen. Na sortering via flowcytometrie, zoals zojuist gedemonstreerd, beginnen op dag 3 tot 4 van de co-cultuur met AC6-feeder-cellen cobblestone area-forming cells te verschijnen, waarbij rondvormige plasmacytoïde DC's gesuspendeerd bovenop de cobblestone area-forming cells verschijnen.

Tegen dag acht bereikt het aantal plasmacytoïde DC's een piek rond dag 12 tot 14, waarna de cellen na hun volledige ontwikkeling apoptose ondergaan en hun aantallen geleidelijk beginnen af te nemen. Conventionele DC-kolonies verschijnen later, op dag zes tot acht, en zijn adherent met een grotere spoelvormige morfologie. Flowcytometrische analyse laat zien dat de cocultures bestaan uit 91% CD11c-positieve, CD11b-negatieve, B220-positieve plasmacytoïde DC's en 6% CD11c-positieve, CD11b-positieve, B220-negatieve conventionele DC's, wat duidt op een 100-voudige expansie van het aantal plasmacytoïde DC's ten opzichte van de oorspronkelijke CLP-populatie middels deze methode.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er zeker van te zijn dat de C6-cel in goede conditie is en dat de C-dichtheid correct is voordat de CLP na een ontwikkeling wordt toegevoegd. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de DC-biologie om de beperking van het gebruik van een klein aantal projectoren te overwinnen bij het bestuderen van DC-ontwikkeling vanuit verschillende projectoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u PC's in vitro kunt genereren uit CLP met behulp van een C6 BEAT-systeem.