Name: Bestuderen van microbiële gemeenschappen In Vivo: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen Candida albicans En Pseudomonas aeruginosa In het Airways (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Leer een muizenmodel bouwen voor microbiële interacties tussen Candida albicans en Pseudomonas aeruginosa in de luchtwegen. Deze methode genereert klinisch relevante data over pathogeencommunicatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de Universiteit van Lille en het Pasteur Instituut van Lille graag danken, met name Thierry Chassat en Jean-Pierre Decavel, verantwoordelijk voor de veiligheid en het beheer van de huisvesting en fok van dieren. Dit werk werd ondersteund door de "Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française" (SPILF).

De regionale ethische regionale commissie voor dierproeven heeft deze methode goedgekeurd, in overeenstemming met de nationale en internationale dierlijke zorg en gebruik in onderzoek richtlijnen onderzoek. 1. Sample Collection <ol><li> Monster opslag <ol><li> Verzamel alle monsters en onmiddellijk op te slaan bij - 20 ° C of op ijs tot diepvries opslag verslechtering te voorkomen. Plaats steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs bronchoalveolaire spoelingen (BAL) te verbeteren. </li></ol></li><li> Chirurgie <ol><li> Steriliseren alle chirurgische apparatuur met behulp van een autoclaaf. LET OP: Als het mogelijk is, is het raadzaam om twee verschillende sets van instrumenten te gebruiken voor abdominale en thoracale stappen om kruisbesmetting te voorkomen. Dissectie benodigde apparatuur is beschreven in Figuur 4A </li></ol></li></ol> 2. Muizen, Bacteriële en giststammen <ol><li> Huis muizen in overeenstemming met de plaatselijke gebruik van dieren in rerichtlijnen zoekopdracht commissie in een geventileerde rack zonder overschrijding van 5 muizen per kooi, met voedsel en water ad lib, in een bioveiligheidsniveau 2 woningen faciliteit te wijten aan het gebruik van bioveiligheidsniveau 2 micro-organismen: P. aeruginosa en C. albicans. </li><li> Houd de bacteriestammen bij -80 ° C in 40% glycerol medium. <ol><li> Voeg bacteriën direct uit ingevroren voorraad in kweekbuis met 3 ml steriel Luria-Bertani bouillon met een 10 pl entoog. Laat O / N bij 37 ° C met orbitaal schudden (400 rpm) de dag vóór instillatie. </li><li> Harvest bacteriën door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 min. </li><li> Zuig het supernatant in een geschikt gesloten biologisch gevaarlijk afval. Observeren witte aanhangend pellet op de bodem van de cultuur buis. </li><li> Was de pellet met behulp 5 ml PBS opschorten. </li><li> Herhaal de stappen 2.2.2 tot een tweede keer om een ​​tweede wasbeurt te voeren 2.2.3. </li><li> Resuspendeer de gepelleteerde bacteriën via 1 ml PBSen kort vortexen. </li><li> Bepaal de inoculumdichtheid met optische densitometer bij 600 nm met behulp van een optische dichtheid meter. Een dichtheid van 0,9 komt overeen met 10 9 CFU / ml voor PAO1 dienovereenkomstig verdund. Opmerking: Dit resultaat voor elke gebruikte stam worden verkregen door bepalen van de dichtheid van opeenvolgende verdunningen van een gekalibreerde inoculum. </li><li> Controleer de entstof door seriële logaritmische verdunningen en de plaat 100 ul van elke verdunning op broomkresolpurper agar (BCP) platen en O / N cultuur. Dien elke muis intranasaal 50 pl van de oplossing met 1 x 10 8 om 2 x 10 8 CFU per ml (5 x 10 6 om 1 x10 7 CFU per muis). </li></ol></li><li> Gebruik C. albicans SC5314 als referentiestam. Behoud van de stam in 40% glycerol medium bij -80 ° C. <ol><li> Supplement Gist-pepton-dextrose bouillon met 0,015% amikacine om bacteriële besmetting te voorkomen en verder tellen vergemakkelijken. </li><li> Gist toe te voegen met behulp van 10 &amp;# 181; l enting lus in de voorbereide YPD-bouillon aangevuld met amikacine O / N bij 37 ° C. </li><li> Gist oogsten door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 min. </li><li> Verwijder supernatant in een geschikt bioharzard afvalverwijdering. Witte aanhangend pellet moeten worden waargenomen in de bodem van de cultuur buis. </li><li> Was en schorten de gepelleteerde bacteriën met behulp van 5 ml PBS en kort vortexen. </li><li> Herhaal de stappen 2.2.2 tot een tweede keer om een ​​tweede wasbeurt te voeren 2.2.3. </li><li> Resuspendeer de pellet met behulp van 1 ml PBS en kort vortexen. </li><li> Bepaal de grootte van het inoculum door telling op een Mallassez hematocytometer met een standaard microscoop bij een vergroting van 40x. OPMERKING: Concentratie (in CFU / ml) verkregen met de volgende formule: (aantal gist 5 x 10) / (aantal getelde raster rechthoeken op de Mallassez hematocytometer). </li><li> Controleren door logaritmische seriële verdunning tot 10 -5 en 10 -6 om te bevestigen dat de oplossing bevat 2 x 10 6 CFU / ml. </li><li> Plaat op YPD-agar-platen, aangevuld met 0,015% amikacine. </li></ol></li></ol> 3. Airways kolonisatie door C. albicans OPMERKING: Na het milieu aanpassing worden muizen twee keer per dag gewogen. <ol><li> Onder een zuurkast, borg 500 pi van sevofluraan op een 4 cm x 4 cm gaas (open-drop techniek) 14. <ol><li> Onmiddellijk het gaas op de vloer van een ongeveer 750 ml inductie kamer. Plaats onmiddellijk een mesh verhoogd platform boven het gaas om direct contact tussen het dier en het gaas te voorkomen. </li><li> Sluit luchtdicht deksel en wacht 1-2 min tot diffusie van Sevofluraan laten in de kamer. </li><li> Breng de muis van kooi naar platform en sluit het deksel mesh. Lichte anesthesie met geconserveerde spontane ademhaling moet worden bereikt om 30 45 sec. </li><li> Monitor voor hypotonie door het waarnemen van het verlies van oprichtreflex waarna de muis f kan worden verwijderdROM De doos en ingeprent. </li></ol></li><li> Intranasale instillatie (kan in 10 seconden worden uitgevoerd door een getrainde operator). <ol><li> Houd de muis een hand genesteld op zijn rug overeind gehouden (Figuur 4B). </li><li> Met behulp van de wijsvinger, ondersteunen het hoofd en gebruik de duim aan de kaak gesloten te houden om te voorkomen dat slijm (Figuur 4C). </li><li> Zoals beschreven in stap 2.3.8, ervoor te zorgen dat de voorbereide C. albicans oplossing bevat 2 x10 6 CFU per ml van een 50 pl volume ingeprent. OPMERKING: De tweede kritische punt is de bijgebracht volume. Een volume van minder dan 50 ul kan leiden tot een onvoldoende kolonisatie of inhomogene instillatie van de luchtwegen, kan een groter volume verdrinking / verstikking en dood veroorzaken. </li><li> Boezemen de muis intra-nasaal door het naderen van de pipet om de neusgaten. </li><li> Pipetteer 50 ul druppel vormen van een bel die de oplossing op de neus vervolgens ingeademd door de spontaneously ademhaling muis. </li><li> Plaats muis in een herstel gebied (bijvoorbeeld een grote, goed belucht kale kooi met een overhead verwarming lamp). Muizen moeten worden gecontroleerd tot volledig ontwaken. Heeft een dier niet onbeheerd verlaten totdat het voldoende bewustzijn borstligging en oprichtende reflex behouden heeft herwonnen. Op dit punt kan de muis worden teruggebracht naar normale behuizing kooi. </li></ol></li></ol> 4. P. aeruginosa geïnduceerde Acute Lung Infectie LET OP: De muizen worden gewogen tijdens de volgende vier dagen. Normaal, muizen gewichtstoename tijdens C. albicans-gemedieerde luchtwegkolonisatie (Figuur 2A). <ol><li> Bereid de suspensie die P. aeruginosa de dag van de instillatie na O / N groei (paragraaf 2.2). </li><li> Verdoven kort met behulp ingeademd Sevoflurane zoals hierboven (punt 3.1) beschreven. OPMERKING: acute longontsteking uit te voeren, raden bacteriële last worden voorgesteld inTabel 1. </li><li> Boezemen de muis, zoals hierboven (punt 3.2) beschreven met bijzondere aandacht voor de post-instillatie herstel. </li></ol> 5. Meet van Lung Injury Index <ol><li> Bereid een oplossing van FITC-gemerkte albumine. Injecteer deze oplossing 2 uur voor dieren euthanasie. <ol><li> Weeg 0,2 mg albumine-FITC met de juiste apparatuur. </li><li> Voeg 0,2 mg in 1 ml PBS. Kort vortex. Indien niet onmiddellijk gebruikt, plaatst u de oplossing in folie om de blootstelling aan omgevingslicht te voorkomen. </li><li> Injecteer intraperitoneaal 200 ul FITC-gelabelde albumine oplossing voor elke muis. </li></ol></li><li> Euthanasia <ol><li> Weeg de muizen voor de laatste gegevens over het gewicht. </li><li> Euthanaseren een enkele muis in overeenstemming met lokale gebruik van dieren in het onderzoek de commissie richtlijnen met behulp van een intra-peritoneale injectie van een dodelijke overdosis van pentobarbital: 300 ul van 5,47% pentobarbital. </li><li> Verwijder muis van de kooi en ontvangt lEthal injectie door de operator. </li><li> Na injectie, overdracht van de muis alleen een andere kooi, verborgen voor andere dieren. Let op de muis totdat er geen beweging. Bevestig de dood is door de afwezigheid van beweging, met name respiratoire beweging, gebrek aan impuls. </li><li> Het uitvoeren van chirurgische verzamelen van monsters op dode dieren, dus zonder verdoving of pijnstillers. </li></ol></li><li> Chirurgische monstername: Thoracic podium. OPMERKING: Om steriele omstandigheden te handhaven, wordt al een operatie uitgevoerd met behulp van steriele apparatuur in een bioveiligheidsniveau 2 omgeving. <ol><li> Breng ethanol op de huid. Voer een middellijn incisie in de huid van het borstbeen tot medio buik met een schaar. Van middellijn insnijden langs de ribbenkast aan beide zijden. Vouw de huid aan beide zijden van de thorax aan de ribbenkast visualiseren. </li><li> Voer een verticale insnijding van de ribbenkast aan weerszijden gaand naar de sleutelbeenderen om te kunnen het gehele voorste borstwand aanliggen met de achterstevenum waardoor de perfecte visualisatie van het hart en de longen (figuur 5A, 5B). </li><li> Verzamel bloed met behulp van een pre-heparined spuit door aanprikken van het hart naast de interventriculaire slagader. Trek minimaal 500 ul minstens 100 pl plasma te verkrijgen. Leg het bloedmonster op het ijs. </li><li> Voer een middenlijn cervicale insnijding aan de luchtpijp (figuur 5B en 5C) te visualiseren. Ontleden de fascia rond de luchtpijp zorgvuldig. Plaats een hechting achter de luchtpijp (figuur 5C en 5D). Vervolgens wordt de hechtdraad gesloten rond de canule naald om goede lavage waarborgen. </li><li> Katheteriseren de luchtpijp met behulp van de 20-G gemodificeerd maagsonde naald (Figuur 5D en 4A). Bind een chirurgische knoop rond de gecanuleerde luchtpijp met de eerder geplaatste hechtdraad. </li><li> Om bronchoalveolaire spoelingen (BAL) uit te voeren, voorzichtig en geleidelijk te injecteren en trekken 500 ul ijskoude PBS in / uit de long. Plaats het monster op de ice cellulaire lyse voorkomen. </li><li> Herhaal stap 5.3.6, 3 keer in totaal 1500 pl BAS vloeistof en pool lavage monsters krijgen in een 2 ml centrifugebuis (figuur 5E). </li><li> Verwijder de longen uit de borst. Plaats een long-segment (grootte moet overeenkomen met de helft van een long of een kwab) in 1,5 ml centrifugebuis en opslaan snel bij - 80 ° C. </li><li> Plaats een long-segment in een vooraf gewogen hemolyse buis met PBS om bacteriële last te bepalen en plaats het op het ijs. </li></ol></li><li> Chirurgische monstername: abdominale podium. <ol><li> Voer een incisie aan de linkerkant van de buik. Let op de milt door het buikvlies. </li><li> Verwijder de milt en plaats in een tweede hémolyse buis met 1 ml PBS en plaats op ijs. </li></ol></li><li> Longbeschadiging index OPMERKING: alveolaire capillaire membraan-permeabiliteit wordt bepaald door het meten FITC-gelabelde albumine lekkage uit het vasculaire compartiment naar de alveolaire-interstvrijwaart de oorspronkelijke compartiment. <ol><li> Centrifuge bloedmonster en BAL vloeistof voor 10 min bij 1500 x g. Verzamel supernatanten in nieuwe centrifugebuisjes. De pellets overeen met aangeworven plasma of BAL cellen en moeten op ijs geplaatst. </li><li> Voeg 100 ul van elk supernatant bloed (plasma, geel) of BAL supernatant van een 96-well ruit (300 ui putjes). Plaats een folie op de plaat als het niet onmiddellijk wordt gebruikt. </li><li> Meet fluorescentie niveaus in plasma en BAL supernatanten met behulp van een fluorescentie microplaat lezer (excitatie 487 nm, emissie 520 nm). </li><li> Bepaal de longbeschadiging index door het berekenen van de fluorescentieverhouding [(BAL supernatant / bloed supernatans) x 100]. </li></ol></li><li> Bronchoalveolaire lavage (BAL) differentiële celtelling. OPMERKING: Gebruik de cel pellet verkregen uit centrifugeren van BAL vloeistof in stap 5.5.1. <ol><li> Indien nodig, gebruik van rode cellysisbuffer. Voeg 500 ul van rode cellen lysis buffer in de centrifugebuis die de CELl pellet. Kort vortex en laat 10 min op ijs. Voeg 500 ul PBS rode-cellysis stoppen. </li><li> Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1500 x g. Verwijder supernatant en schorten de cel pellet in 1 ml steriele PBS. Inventariseer cellen op een Mallassez hematocytometer. Met behulp van een hemacytometer om Cells Count. Concentreer cellen op een dia met een cytospin. </li><li> Vlek cellen met behulp van kleuring kit voor de identificatie en telling (macrofagen, lymfocyten, neutrofielen) cel. </li></ol></li><li> Long bacteriële belasting en bacteriële verspreiding OPMERKING: long bacteriële belasting en bacteriële verspreiding, longen en milt beoordelen respectievelijk verzameld en opgeslagen in vooraf gewogen hemolyse buizen met 1 ml PBS (stap 5.3.9). <ol><li> Weeg hemolyse buisjes met 1 ml PBS en hetzij longen en milt. Homogeniseer de monsters met een weefselhomogenisator long homogenaten en milt homogenaten verkrijgen. </li><li> Stort 100 pl weefsel homogenates in centrifuge buisjes die 900 ul steriel PBS tot seriële logaritmische verdunningen te verkrijgen. </li><li> Plaat de laatste twee geschikte verdunde monsters (10 -3 en 10 -2) aan beide BCP-agar voor P. aeruginosa of YPD-amikacine-aangevuld agar voor C. albicans long en milt last bepalen. </li><li> Incubeer de platen O / N bij 37 ° C. De volgende dag opsommen de kolonies op platen. </li><li> Index het resultaat longgewicht een CFU per gram long verkrijgen. Lung steekproefomvang niet hetzelfde, de resultaten worden uitgedrukt in CFU per gram long. Formule voor de index is: [CFU] x [gewicht van hemolyse buis en longen] - [gewicht van hemolyse buis]. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Casadevall, A., Pirofski, L. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+damage-response+framework+of+microbial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">The damage-response framework of microbial pathogenesis.</a> Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).</li>
<li>Eddens, T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defenses+against+bacterial+lower+respiratory+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opi.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection.</a> Curr. Opi. Immunol. , (2012).</li>
<li>Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+research+%3A+J.+Lab.+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the lung.</a> Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).</li>
<li>Hogan, D. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Candida+interactions%3A+an+ecological+role+for+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors.</a> Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).</li>
<li>Nseir, S., Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+Candida+albicans%3A+do+they+really+need+to+stick+together%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Gibbons, D. L., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+intestinal+immunity%3A+same+ballpark%2C+different+players%3B+different+rules%2C+same+score%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score.</a> Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).</li>
<li>Ariffin, J. K., Sweet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+repertoire%2C+regulation+and+function+of+Toll-like+Receptors+and+inflammasome-forming+Nod-like+Receptors+between+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opi.+Micro.%22%5BJournal%5D)">Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse.</a> Curr. Opi. Micro.. , (2013).</li>
<li>Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilator-Induced+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22NEJM%22%5BJournal%5D)">Ventilator-Induced Lung Injury.</a> NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).</li>
<li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medically+important+bacterial-fungal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li>
<li>Roux, D., Gaudry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+impairs+macrophage+function+and+facilitates+Pseudomonas+aeruginosa+pneumonia+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).</li>
<li>Mear, J. B., Gosset, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).</li>
<li>Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+Candida+albicans+colonization+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+load+and+lung+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+care%22%5BJournal%5D)">Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model.</a> Crit. care. , 1-33 (2009).</li>
<li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).</li>
<li>Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice%3A+comparison+with+125I-albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).</li>
<li>Faure, E., Mear, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+type-3+secretion+system+dampens+host+defense+by+exploiting+the+NLRC4-coupled+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).</li>
<li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medically+important+bacterial-fungal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Diermodellen, in het bijzonder zoogdieren, bruikbaar complexe mechanismen van gastheer-pathogeen interactie helderen op het gebied van immuniteit. Natuurlijk, de behoefte aan informatie verkregen uitsluitend uit dierlijke modellen moeten onontbeerlijk zijn; Anders moet gebruik van dieren worden vervangen door in vitro modellen. Dit diermodel illustreert het inzicht dat alleen kan worden verschaft door een diermodel aangezien de interactie tussen pathogenen wordt gemedieerd door een multi-component gastheerrespo...

Diermodellen, in het bijzonder muizen, zijn uitgebreid gebruikt om immuunresponsen tegen ziekteverwekkers te ontdekken. Hoewel aangeboren en verworven immuniteit verschillen tussen knaagdieren en mensen 7, het gemak in kweek en de ontwikkeling van knockouts voor tal van genen maakt muizen een uitstekend model om immune responsen 8 bestuderen. De immuunrespons is complex en voortvloeit uit de wisselwerking van een pathogeen, de bewoner microbiële flora en verschillende immune (lymfocyten, neutrofielen, macrofagen) en niet-immune (epitheelcellen, endotheelcellen) celtypes 2. In vitro studies niet toestaan ​​observeren deze complexe interacties en zich vooral richten op unieke cel-pathogeen interacties. Terwijl diermodellen moet met voorzichtigheid worden gebruikt en beperkt tot zeer specifieke en relevante vragen, muis modellen geven een goed inzicht in het zoogdier immuunrespons in vivo en kunnen delen van belangrijke klinische 7 vragen aan te pakken. 6. Terwijl wat een &quot;normale&quot; luchtwegen microbiome moet nog worden bepaald, inwoner gemeenschappen vaak polymicrobiële, en afkomstig van verschillende ecologische bronnen. Patiënten met een etterige chronische longziekte (cystic fibrosis, bronchectasis) of mechanisch geventileerde patiënten vertonen een bijzondere flora vanwege kolonisatie van de luchtwegen door milieuvriendelijke verworven micro-organismen 9. Pseudomonas aeruginosa en Candida albicans zijn beide probleem pathogenen 5, vaak samen geïsoleerd van tracheobronchiale monsters en verantwoordelijk voor ernstige opportunistische infectie bij deze patiënten, vooral in de intensive care unit (ICU) 4. Isolatie van deze micro-organismen tijdens acute longontsteking bij ICU resulteert in anti-microbiële behandeling tegen P. aeruginosa but gist worden gewoonlijk niet beschouwd als pathogeen op deze plaats 5. In vitro interactie tussen P. aeruginosa en C. albicans zijn op grote schaal gemeld en toonde dat deze micro-organismen groei en overleving van elkaar kunnen beïnvloeden maar studies konden concluderen of de aanwezigheid van C. albicans schadelijk hetzij gunstig voor de host 10. Muismodellen zijn ontwikkeld om dit relevant P. pakken aeruginosa en C. albicans in vivo, maar de interactie tussen micro-organismen niet het belangrijkste punt. Inderdaad, werd het model opgericht om de betrokkenheid van C. evalueren albicans in gastheer immuunrespons, en het resultaat. Een vorige model opgericht door Roux et al reeds een eerste kolonisatie met C. albicans gevolgd door een acute longinfectie veroorzaakt door P. aeruginosa. Met behulp van hun model, vonden de auteurs een schadelijke rol van prior C. albicans kolonisatie 11. Echter Roux et al gebruikten een hoge belasting van C. albicans in hun uitvoering met 2 x 10 6 CFU / muis gedurende 3 opeenvolgende dagen. We een 4-daagse model van C. albicans luchtwegkolonisatie, althans persistentie zonder longbeschadiging, In dit model C. albicans werd teruggewonnen tot 4 dagen na een enkele indruppeling van 10 5 CFU per muis (Figuur 2B) 12,13. Na 4 dagen werd geen bewijs van inflammatoire cel werving, inflammatoire cytokine productie noch epitheelbeschadiging waargenomen. Op 24 - 48 uur, op het hoogtepunt aanwezigheid van C. albicans, terwijl een cellulaire en cytokine aangeboren immuunrespons waargenomen, was er geen bewijs van longbeschadiging. Verrassenderwijs muizen aldus gekoloniseerd met C. albicans 48 uur voorafgaand aan de instillatie van P. intranasale aeruginosa infectie was verzwakt in vergelijking met muizen met P. aeruginosa infecties alleen. ikndeed, muizen vertoonden minder longbeschadiging en verminderde bacteriële last 12,13. Verschillende hypotheses kan dit gunstige effect van voorafgaande kolonisatie met C. verklaren albicans op P. aeruginosa gemedieerde acute longinfectie. Ten eerste, een interspecies overspraak waarbij elk micro-quorum sensing systemen, de homoserinelactone gebaseerde P. aeruginosa systeem en de Farnesol gebaseerde C. albicans systeem geëvalueerd. Ten tweede, C. albicans als een &quot;decoy&quot; target voor P. aeruginosa omleiden van het pathogeen uit longepitheelcellen bestudeerd. Beide hypothesen werden ongeldig (ongepubliceerde gegevens). De derde hypothese was dat van een &quot;priming&quot; van het aangeboren immuunsysteem door C. albicans verantwoordelijk voor een versterkte volgende aangeboren respons tegen P. aeruginosa. Deze laatste hypothese werd bevestigd. Inderdaad C. albicans kolonisatie leidde tot een priming van aangeboren immuniteit through IL-22, voornamelijk uitgescheiden door aangeboren lymfoïde cellen, wat resulteert in verhoogde bacteriële verwijdering en verminderde longbeschadiging 12. Concluderend is de gastheer een centrale actor in de interactie tussen microorganismen moduleren van de aangeboren immuunrespons en waarbij verschillende inflammatoire celtypen. Hoewel deze complexe immuuninteracties kan worden ontleed in vitro de oorspronkelijke hypothesen alleen nodig, worden voorzien in vivo modellen. Het volgende protocol geeft een voorbeeld van in vivo onderzoek van gastheer pathogeen gemedieerde interacties die kunnen worden aangepast voor andere micro-organismen.

<table><tbody><tr><td>Sevorane, Sevoflurane</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>250 ml plastic fles</td></tr><tr><td>Fluorescence Reader Mithras&nbsp; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>referentie in eerste kolom</td><td>geen commentaar</td></tr><tr><td>Bromo-cresol purple agar</td><td>Biomerieux</td><td>43021</td><td>20x per eenheid</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique 5.47%</td><td>CEVA</td><td>6742145</td><td>100 ml plastic fles</td></tr><tr><td>2-headed valve&nbsp;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>geen commentaar</td></tr><tr><td>Steriele inoculatie-lus 10 &micro;l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>x1.000 conditionering</td></tr><tr><td>Insuline spuiten 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>per 100 conditionering</td></tr><tr><td>2 posities Cultuurbuis 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>geen commentaar</td></tr><tr><td>Ultrospec 10&nbsp;</td><td>General Electric life sciences</td><td>80-2116-30</td><td>geen commentaar</td></tr><tr><td>Hemolysebuisjes 13 x 75 mm&nbsp;</td><td>Gosselin</td><td>W1773X</td><td>per 100</td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td>verpakt in 500 ml</td></tr><tr><td>amikacin 1 g</td><td>Mylan</td><td>62516778</td><td>per 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparine 10.000 IE in 2 ml</td><td>Pan pharma</td><td>9128701</td><td>10x per eenheid</td></tr><tr><td>RAL 555 kleuring kit</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>3 flacons van 100 mL</td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisje</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>Transparante 300 &micro;l 96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>geen commentaar</td></tr><tr><td>Yest-peptone-Dextrose Broth</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>in poeder</td></tr><tr><td>FITC-albumine</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>in poeder</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>in poeder</td></tr><tr><td>25-gauge naald</td><td>Terumo of unisharp</td><td>A231</td><td>x 100 conditionering</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>geen commentaar</td></tr></tbody></table>

bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; in vivo</em&gt;: een model van de host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; candida albicans</em&gt; en<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; in het airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Bestuderen van gastheer-pathogeen interactie stelt ons in staat om de onderliggende mechanismen van de pathogeniciteit te begrijpen tijdens de microbiële besmetting. De prognose van de gastheer is afhankelijk van de betrokkenheid van een aangepaste immuunreactie tegen de pathogeen 1. Immuunrespons is complex en de resultaten van de interactie van verschillende pathogenen en immune of niet-immune celtypes 2. In vitro studies kunnen deze interacties te karakteriseren en gericht op mobiele-pathogeen interacties. Bovendien is in de luchtweg 3, vooral bij patiënten met etterige chronische longziekte of kunstmatig beademde patiënten, polymicrobiële gemeenschappen aanwezig compliceren gastheer-pathogeen interactie. Pseudomonas aeruginosa en Candida albicans beide problemen pathogenen 4 vaak geïsoleerd uit tracheobronchiale monsters, en geassocieerd met ernstige infecties, vooral in intensive care unit 5. Microbiële interactiesgerapporteerd tussen deze pathogenen in vitro maar de klinische gevolgen van deze interacties onduidelijk 6. Om de interacties tussen C. Albicans en P. bestuderen aeruginosa, een muizenmodel van C. albicans luchtwegen kolonisatie, gevolgd door P. aeruginosa- gemedieerde acute longinfectie werd uitgevoerd.

Zoals eerder gezien tijdens het protocol beschrijving, het experiment moet 5 dag (Figuur 1: experiment tijdlijn) te voltooien. Een operator gevraagd tijdens de gehele run van het experiment en kan omgaan met de processen tot een maximum van 10 muizen. Als er meer dieren nodig zijn, zijn twee personen nodig zijn in het bijzonder voor chirurgische monstername. Inderdaad alle monsters moeten worden verzameld in het kader van 2 uur tot een verhoogde passief alveolaire-capillaire lekkage van FITC-gelabelde a...

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Het algemene doel van deze procedure is het bouwen van een model om de interacties tussen een individuele bacterie en een enkele schimmel te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van pathogeen-interacties, zoals welke factoren betrokken zijn bij cross-talk en interspecies-dialect. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gegevens die uit dit in vivo model voortkomen klinische relevantie hebben.Om de schimmel intranasaal toe te dienen, wordt eerst 2 × 10⁶ CFU C.albicans per milliliter verdund in steriele PBS. Nadat het verlies van de rightreflex bij een volwassen hypotone muis is bevestigd, wordt vervolgens ten minste 50 µL van de schimmelsuspensie opgezogen in een 200 µL pipet. Vasthoud de muis vervolgens met één hand en draai het dier zodat het op zijn rug ligt met de buik naar boven gericht.Wanneer de muis in positie is, gebruikt u de wijsvinger van de hand die de muis vasthoudt om de kop te ondersteunen en de duim om de kaak gesloten te houden, en brengt u de pipetpunt dicht bij de neus van het dier. Dispenseer vervolgens voorzichtig een druppel van 50 µL schimmel op de neusgaten, zodat de druppel door de spontane ademhaling van de muis wordt ingeademd. Plaats de muis vervolgens alleen in een kooi totdat deze volledig is hersteld.Vier dagen na de installatie van C.albicans scheert u de buik van het geëuthanaseerde dier, gevolgd door ethanolsterilisatie van de blootgestelde huid. Gebruik vervolgens een schaar om de huid open te maken van het borstbeen tot het midden van de buik. Breid de incisie vervolgens uit langs de borstkas aan weerszijden van de middellijn en sla de huid aan beide zijden van de thorax terug.Wanneer de borstkas zichtbaar is, wordt aan weerszijden van de borst een verticale incisie gemaakt in de richting van de claviculae, waarna het sternum wordt gebruikt om de gehele voorste borstwand terug te klappen om het hart en de longen zichtbaar te maken. Puncteer vervolgens het hart naast de intraventriculaire arterie met een vooraf gehepariniseerde spuit en onttrek minimaal 500 µL bloed. Plaats het bloedmonster op ijs.Maak vervolgens een mediane cervicale incisie om de trachea bloot te leggen. Dissekeer voorzichtig de fascia rondom de trachea en plaats daarna een hechting onder de trachea. Gebruik vervolgens een gemodificeerde sondeernaald van 20 gauge om de trachea te catheteriseren en bevestig de canule met de eerder geplaatste hechting.Om een bronchoalveolaire lavage uit te voeren, brengt u voorzichtig 500 µL ijskoud PBS aan in de long. Aspireer vervolgens het lavagevloeistof en breng de vloeistof over in een centrifugebuis van 2 mL op ijs. Nadat er nog twee monsters van 500 µL zijn verzameld, verwijdert u de longen uit de borstkas en plaatst u een stuk longweefsel in een centrifugebuis van 1,5 mL voor onmiddellijke bewaring bij -80 °C.Plaats vervolgens een ander stuk longweefsel in een vooraf gewogen hemolysebuis met PBS op ijs. Maak tot slot een incisie aan de linkerzijde van de buikholte. Oogst de milt in een tweede hemolysebuis met één milliliter PBS en plaats de buis op ijs.Een model van vier dagen persistentie wordt verkregen door intranasale installatie van vijf keer tien tot de vijfde CFU van C.albicans per muis. Gedurende deze vier dagen komen de muizen aan in gewicht, maar vertonen zij geen longschade. Naarmate de CFU van het inoculum echter toeneemt, neemt ook de longschade toe.De maximale longbeschadiging werd waargenomen tussen 24 en 36 uur na infectie. De bacteriële belasting vertoont daarentegen elke 24 uur een afname van één log CFU per milliliter, waarbij over elke dag een cumulatieve toename van de bacteriële verspreiding werd waargenomen. In de bronchoalveolaire lavage die werd afgenomen van geïnfecteerde muizen zijn neutrofielen op grote schaal gerekruteerd, waarbij de differentiële cel telling een infiltrerende immuuncelpopulatie van 90 procent neutrofielen en 10 procent macrofaag-lymfocyten aantoont.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals analyse van de bronchoalveolaire lavage, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de karakterisering van de inflammatoire respons te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een Pseudomonas-kolonisatie opbouwt. Vergeet niet dat het werken met luminescente Candida extreem gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van beschermende kleding om druppelcontaminatie te voorkomen, altijd in acht moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

studying-microbial-communities-vivo-model-host-mediated-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft verschillende methoden van...

Co-cultuur modellen van Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown op Live menselijke luchtwegen cellen

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal's back region for biofilm development.

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

We beschrijven de agar-kralen methode om hardnekkige langdurige chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie te vestigen in het muismodel.

Long Term Chronische<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luchtweginfectie in Muizen

We beschrijven een protocol voor een driedimensionaal co-cultuurmodel van geïnfecteerde luchtwegen, met CFBE41o- cellen, THP-1 macrofagen en Pseudomonas aeruginosa, gevestigd op de lucht-vloeibare interface. Dit model biedt een nieuw platform om tegelijkertijd de werkzaamheid van antibiotica, epitheelbarrièrefunctie en ontstekingsmarkers te testen.

P. aeruginosa Geïnfecteerde 3D Co-Cultuur van Bronchiale epitheelcellen en macrofagen bij Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We stellen een muismodel op van C.albicans-geassocieerde kathetergerelateerde infectie (CRI), waarbij biofilm zich vormt op de katheter, en de interactie tussen C.albicans en gastheer goed correleert met de klinische CRI. Dit model helpt bij het screenen van therapieën voor C.albicans biofilm-geassocieerde CRI, waarmee een basis wordt gelegd voor klinische transformatie.

Een kathetergerelateerd Candida albicans-infectiemodel bij muizen

Dit protocol beschrijft de toepassing van antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) in een muizenmodel van orale candidiasis. aPDT werd uitgevoerd met behulp van een in water oplosbaar mengsel van curcuminoïden en blauw LED-licht.

Curcuminoïde-gemedieerde antimicrobiële fotodynamische therapie op een muizenmodel van orale candidiasis

Dit protocol beschrijft een cystic fibrosis (CF) longrelevant vier-species polymicrobieel biofilmmodel dat kan worden gebruikt om de impact van bacteriële interacties tussen soorten te onderzoeken.

Het kweken van een cystische fibrose-relevante polymicrobiële biofilm om fenotypes van de gemeenschap te onderzoeken

Deze methodologie maakt het mogelijk om een polymicrobieel biofilmmodel in cystische fibrose op te zetten voor antimicrobiële gevoeligheidstesten in onderzoeks- en klinische laboratoria. Dit model biedt nauwkeurige en betrouwbare resultaten over een reeks outputs.

Ontwikkeling van een biofilmmodel voor polymicrobiële kolonies om antimicrobiële middelen bij cystische fibrose te testen

Deze studie schetst een raamwerk voor het ontwikkelen van een geaggregeerde polymicrobiële biofilmmodel en het optimaliseren van een RNA-extractieprotocol om de Pseudomonas aeruginosa genexpressie te beoordelen die representatief is voor de longomgeving bij cystische fibrose. Toepassingen omvatten het evalueren van antimicrobiële effecten en het bestuderen van alternatieve antibiotica onder omstandigheden die relevant zijn voor cystische fibrose.

Aggregaatbiofilmmodel van cystische fibrose om infectie-relevante genexpressie te bestuderen

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde, gedetailleerde gids voor het gebruik van de planarian Schmidtea mediterranea als modelsysteem om gastheer-pathogeen interacties tijdens schimmelinfecties te bestuderen. De methode bouwt voort op de vorige procedure voor het infecteren van planarians met de menselijke schimmelziekteverwekker Candida albicans, en biedt gedetailleerde richtlijnen om de reproduceerbaarheid en experimentele consistentie te verbeteren.

Een geoptimaliseerd protocol voor Candida albicans-infectie in Schmidtea mediterranea om schimmelpathogenese en gastheerverdediging te bestuderen

Leer een muizenmodel bouwen voor microbiële interacties tussen Candida albicans en Pseudomonas aeruginosa in de luchtwegen. Deze methode genereert klinisch relevante data over pathogeencommunicatie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen In Vivo: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen Candida albicans En Pseudomonas aeruginosa In het Airways (Video) | JoVE Journal

Bestuderen van microbiële gemeenschappen

Meer video's verkennen