Bestuderen van microbiële gemeenschappen In Vivo: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen Candida albicans En Pseudomonas aeruginosa In het Airways

Het algemene doel van deze procedure is om een model op te bouwen om de interacties tussen een individuele bacterie en een enkele schimmel te bestuderen. Deze boodschap kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van pathogeeninteracties te beantwoorden, zoals welke factoren betrokken zijn bij cross-talk en interspecifieke dialect. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gegevens die uit dit in vivo-model worden gegenereerd, klinisch relevant zijn.

Om de schimmel intranasaal te installeren, verdunt u eerst twee keer tien tot de zesde CFU van C.albicans per milliliter in steriel PBS. Vervolgens, nadat u de verlies van de rechtingsreflex bij een volwassen hypotone muis hebt bevestigd, zuigt u ten minste 50 microliter van de schimmelsuspensie in een 200 microliter pipet. Grijp nu de muis met één hand en draai het dier zodat het op zijn rug ligt met zijn buik rechtop.

Wanneer de muis in positie is, gebruikt u de wijsvinger van de hand die de muis vasthoudt om het hoofd te ondersteunen, en de duim om de kaak gesloten te houden, en beweeg de pipettip dicht bij de neus van het dier. Geef vervolgens voorzichtig een druppel van 50 microliter schimmel op de neusgaten af, zodat de druppel door de spontane ademhaling van de muis wordt ingeademd. Plaats de muis alleen in een kooi totdat deze volledig is hersteld.

Vier dagen na de installatie van C.albicans, scheer de buik van het geëuthaniseerde dier, gevolgd door ethanol-sterilisatie van de blootgestelde huid. Gebruik vervolgens een schaar om de huid van het borstbeen tot het midden van de buik te openen. Strek vervolgens de incisie uit langs de ribbenkast aan beide zijden van de middenlijn en vouw de huid aan beide zijden van de thorax teruggeslagen.

Wanneer de ribbenkast zichtbaar is, maakt u een verticale incisie aan beide zijden van de borst in de richting van de sleutelbeenderen en gebruikt u het borstbeen om de hele voorste borstwand te laten kantelen om het hart en de longen te visualiseren. Prik vervolgens met een voorgeheparineerde spuit het hart naast de intraventriculaire slagader en trek minimaal 500 microliter bloed af. Plaats de bloedmonster op ijs.

Maak vervolgens een middenlijn cervicale incisie om de luchtpijp te onthullen. Verwijder voorzichtig het fascia rond de luchtpijp, gevolgd door het plaatsen van een hechtdraad onder de luchtpijp. Gebruik vervolgens een 20-gauge gemodificeerde maagsonde naald om de luchtpijp te katheteriseren, waarbij de canule wordt vastgezet met de eerder geplaatste hechting.

Voer een bronchoalveolaire lavage uit door voorzichtig 500 microliter ijskoud PBS in de long te spuiten. Zuig vervolgens de lavagevloeistof op en breng de vloeistof over in een twee milliliter centrifugeerbuisje op ijs. Na het verzamelen van nog twee monsters van 500 microliter, verwijdert u de longen uit de borstkas en plaatst u een stukje long in een 1,5 milliliter centrifugeerbuisje voor onmiddellijke opslag bij min 80 graden Celsius.

Plaats vervolgens een ander stukje longweefsel in een vooraf gewogen hemolysetubuisje dat PBS op ijs bevat. Maak ten slotte een incisie in de linkerkant van de buik. Haal de milt in een tweede hemolysetubuisje dat een milliliter PBS bevat en plaats de buis op ijs.

Een vier dagen persistentiemodel wordt verkregen door intranasale installatie van vijf keer tien tot de vijfde CFU van C.albicans per muis. Gedurende deze vier dagen nemen muizen aan gewicht toe, maar vertonen geen longschade. Naarmate de CFU van het inoculum echter toeneemt, neemt ook de longschade toe.

Met de maximale longschade waargenomen tussen 24 tot 36 uur na infectie. De bacteriële belasting vertoont daarentegen een daling van een log CFU per milliliter elke 24 uur, met een cumulatieve toename van bacteriële verspreiding die over elke dag wordt waargenomen. In de bronchoalveolaire lavage die is geoogst uit geïnfecteerde muizen, worden neutrofielen wijdverspreid gerekruteerd, met het differentiële celtelling die een 90 procent neutrofielen, 10 procent macrofaag lymfocyt-infiltrerende immuuncelpopulatie vertoont.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals analyse van de bronchoalveolaire lavage, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de karakterisering van de ontstekingsreactie te beantwoorden. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een kolonisatie Pseudomonas kunt opbouwen. Vergeet niet dat het werken met luminecente Candida uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat de voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van beschermende kleding om druppelbesmetting te voorkomen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.