Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden
11 november 2015
Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.
Het algemene doel van deze procedure is om geïnduceerde pluripotente stamcellen of IPC's te genereren uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van regeneratieve geneeskunde, inclusief hoe IPS-cellen kunnen worden toegepast in klinisch gebruik. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat IPS-cellen kunnen worden genezen zonder de opname van mogelijke schade aan de refactor, wat het risico op pathogeniteit vermindert.
De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar klinisch relevante IPS-celgebaseerde therapieën wereldwijd vanwege de invasieve celbemonstering in combinatie met een verminderd risico op het blootstellen van de ontwikkeling van IPS-cellen aan ongedefinieerde pathogenen. Dus deze methode kan inzicht bieden in IPS-service klinische therapie. Het kan ook worden toegepast op andere gebieden zoals ziektemodellering voorwaarden.
Begin met het voorbereiden van geactiveerde menselijke T-cellen door 10 milliliter heparinevol geheel bloed te verdunnen met 10 milliliter DPBS pipet. 15 milliliter fol-oplossing in een 50 milliliter conische buis. Pipetteer langzaam het verdunde bloed langs de binnenwand van de buis om een laag bovenop de oplossing te vormen.
Wees voorzichtig om de interface niet te verstoren. Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij 400 keer G op kamertemperatuur. Na centrifugatie observeert u drie lagen, inclusief een onderste heldere laag, een dunne witte laag die mononucleaire cellen bevat en een bovenste melkachtige plasmalaag.
Breng de mononucleaire cellagen over naar een nieuwe 50 milliliter conische buis zonder enige fit-hole-oplossing over te brengen. Voeg vervolgens DPBS toe om het totale volume tot 10 milliliter te brengen. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 200 keer G op kamertemperatuur.
Gooi de supernatant weg, was de cellen met 10 milliliter DPBS centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 200 keer G en verwijder de supernatant. Voeg vervolgens een milliliter KBM 5 0 2-medium toe aan de cellen en tel met behulp van een hemo-cytometer om de celkweekschaal te bereiden, bekleed de putjes van een zes-putsplaat met 10 microgram per milliliter anti-menselijke CD drie-antilichaam-oplossing in PBS. Bewaar de plaat gedurende minimaal 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Na incubatie, verwijder de antilichaam-oplossing van de plaat acht en was eenmaal met PBS zaai de mononucleaire cellen bij een dichtheid van 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per vierkante centimeter in een totaal volume van twee milliliter KBM 5 0 2-medium in de beklede zes-putsplaten incubeer de cellen gedurende drie tot zeven dagen zonder het medium te veranderen, waarbij de T-cel confluency zou moeten bereiken gedurende de drie tot zeven dagen. Breng de geactiveerde T-cellen over met een medium naar een 15 milliliter conische buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 keer G. Verwijder de SNAT en voeg een milliliter vers KBM 5 0 2-medium toe.
Tel de cellen en plant 1,5 keer 10 tot de zes cellen in twee milliliter KBM 5 0 2-medium in elke put van een anti CD drie-antilichaam beklede zes-putsplaat. Ontdooi vervolgens de OC drie SOX twee, KLF vier en C-M-Y-C-H en L sendi-virusoplossingen op ijs bij elke geëngineerde Sendai-virus afzonderlijk naar elke put en een multipliciteit van infectie van 10. Bewaar bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Verzamel vervolgens de geïnfecteerde cellen met een pipet en breng ze over naar een 15 milliliter conische buis.
Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 200 keer G. Verwijder de supernatant en voeg twee milliliter vers KBM 5 0 2-medium toe. Plaats de cellen terug in de putjes van een zes-putsplaat en bewaar gedurende 24 uur in een celkweekincubator.
Om de cellen terug te trekken, bewaar de basement membrane matrix-oplossing overnacht bij vier graden Celsius. Los 0,2 milliliter van de gedachte oplossing op in 10 milliliter DMM F 12-medium, bewaar vijf milliliter van de basement membrane matrix-oplossing in 100 millimeter schalen. Laat de schalen gedurende minimaal 30 minuten op kamertemperatuur staan om de matrix de schaal te laten bedekken voordat u cellen zaait. Verzamel ondertussen de SAI-virus geïnfecteerde T-cellen in een 15 liter conische buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 keer G.
Resuspendeer vervolgens de palaat in een milliliter vers KBM 5 0 2-medium en tel de cellen met behulp van een hemo-cytometer na de 30 minuten incubatieperiode. Verwijder de basement membrane matrix-oplossing van de twee platen, bewaar vervolgens eenmaal 10 tot de vijfde cellen en afzonderlijk eenmaal 10 tot de zesde cellen in 10 milliliter vers M-T-E-S-R-medium, een feeder-cel-vrij kweekmedium voor ipsc. Pipetteer elke celsuspensie in een aparte 100 millimeter plaat.
Bewaar de plaat in een celkweekincubator. Ververs het medium om de andere dag gedurende 20 tot 30 dagen. Kolonies die lijken op embryonale stamcelkolonies zouden moeten verschijnen.
Bereid zes wandplaten voor IPSC-expansie voor door één milliliter basement membrane matrix-oplossing in elke put gedurende 30 minuten op kamertemperatuur te bewaren. Bekijk ondertussen kweekplaten met IPSC-kolonies onder een stereomicroscoop en isoleer individuele kolonies door ze af te schrapen met een 20 microliter pipet. Breng elke kolonie over naar een put en een 96-wandplaat met 20 microliter M-T-E-S-R-medium.
Na het overbrengen van de kolonies, voeg 200 microliter M-T-E-S-R-medium toe aan elke put en pipet omhoog en omlaag om de kolonie te verstoren. Na het verwijderen van de basement membrane matrix-oplossing van de zes-putsplaten, breng cellen van een individuele kolonie over naar elke put en voeg vervolgens twee milliliter M-T-E-S-R-medium
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit humane perifere T-cellen onder feeder-vrije condities met behulp van Matrigel en Sendai-virusvectoren. Deze techniek is erop gericht de veiligheid en werkzaamheid van iPSC-toepassingen in de regeneratieve geneeskunde te verbeteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Regeneratieve Geneeskunde
- Stamcelbiologie
- Celherprogrammering
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kunnen worden afgeleid van diverse somatische cellen.
- Deze methode minimaliseert het risico op pathogeniteit dat geassocieerd wordt met traditionele herprogrammeringstechnieken.
- iPSCs hebben een aanzienlijk potentieel voor klinische toepassingen en ziektemodellering.
- Feeder-vrije kweekcondities verbeteren het veiligheidsprofiel van de generatie van iPSCs.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbaar protocol voor het genereren van iPSCs uit menselijke T-cellen.
- Het verkennen van de implicaties van iPSCs in klinische therapieën.
- Het bieden van inzichten in de toepassing van iPSCs bij ziektemodellering.
Gebruikte methoden
- Isolatie van mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed.
- Activering van T-cellen met behulp van anti-humane CD3-antilichamen.
- Transductie van T-cellen met Sendai-virusvectoren die herprogrammeringsfactoren bevatten.
- Kweek van cellen in feeder-vrije condities met geschikte media.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle generatie van iPSCs uit humane perifere T-cellen.
- Expressie van pluripotente markers zoals NANOG, SSEA-4 en TRA-1-60 in afgeleide iPSC-lijnen.
- Aantoonbaarheid van de haalbaarheid van deze methode voor klinische toepassingen.
- Inzichten in het potentieel voor ziektemodellering met behulp van iPSCs.
Conclusies
- Dit protocol biedt een veilige en effectieve methode voor het genereren van iPSCs.
- De benadering vermindert het risico op pathogeniteit dat geassocieerd wordt met traditionele methoden.
- De gegenereerde iPSCs kunnen worden gebruikt voor diverse toepassingen binnen de regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De generatie van iPSC's uit humane perifere T-cellen met behulp van het Sendai-virus onder feeder-vrije omstandigheden pakt cruciale uitdagingen op het gebied van veiligheid en schaalbaarheid aan binnen de R&D voor regeneratieve geneeskunde en celtherapie. Deze benadering maakt de productie van antigeenspecifieke, genetisch traceerbare iPSC-lijnen mogelijk, terwijl de blootstelling aan ongedefinieerde pathogenen en componenten van dierlijke oorsprong wordt geminimaliseerd. De methode ondersteunt de translationele continuïteit van de ontdekkingsfase tot de preklinische ontwikkeling door een klinisch relevante, reproduceerbare celbron te bieden.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt de generatie van iPSC-lijnen met unieke TCR-rearrangementen mogelijk voor lineage tracing en studies naar antigeenspecificiteit.
- Ondersteunt de functionele validatie van herprogrammering en pluripotentie in systemen afgeleid van menselijke immuuncellen.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door het verminderen van storende variabelen afkomstig van feeder-cellen en serum.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, feeder-vrije iPSC-culturen die geschikt zijn voor downstream differentiatie en compound screening.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door het elimineren van ongedefinieerde componenten van dierlijke oorsprong.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van de expressie van pluripotentiemarkers mogelijk voor kwaliteitscontrole.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziektemodellering en de ontwikkeling van celtherapie door het genereren van patiënt- of donor-specifieke iPSC-lijnen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door pathogeniciteitsrisico's in preklinische modellen te minimaliseren.
- Faciliteert translationele biomarkerstudies met behulp van genetisch gelabelde iPSC-derivaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door veilige, schaalbare iPSC-generatie vanuit toegankelijke bloedmonsters mogelijk te maken, wat zowel mechanistische studies als translationele toepassingen ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot herprogrammeringsefficiëntie en plasticiteit van immuuncellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, feeder-vrije iPSC-lijnen voor assay-ontwikkeling en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve gegevens over pluripotentiemarkers voor vergelijkende analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Maakt continuïteit mogelijk van donorbemonstering tot preklinische ziektemodellering en therapieontwikkeling.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar, gestandaardiseerd protocol voor het genereren van traceerbare iPSC-lijnen uit perifeer bloed.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in iPSC-gebaseerde studies.
- Operationele waarde: Verbeterde standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor de generatie van iPSC's.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een laat stadium te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van iPSC-afgeleide modellen en therapieën mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in T-celisolatie, activatie en steriele celkweektechnieken.
- Toegang tot apparatuur voor biologische veiligheidsniveau is noodzakelijk voor het hanteren van Sendai-virusvectoren.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor feeder-vrije en serum-vrije kweekcondities.
- Aanpassing voor verschillende donorbronnen of ziektecontexten kan noodzakelijk zijn.
- Afhankelijk van kwantitatieve immunofluorescentie en moleculaire markeranalyse voor kwaliteitscontrole.
