Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties
25 september 2015
We rapporteren significante verbeteringen voor de reproduceerbare meting van somatische colonische stamcelmutaties na blootstelling van muizen aan potentieel DNA-beschadigende stoffen.
Het algemene doel van deze procedure is om fenotypische somatische mutaties in het glucose zes fosfaat dehydrogenase of G zes PD-gen in colonische stamcellen te kwantificeren. Na behandeling van dieren met vermeende genotoxische middelen, wordt dit bereikt door dieren eerst te behandelen met het middel, te wachten op een gepaste tijd om de nakomelingen van een stamcel die een G zes PD-mutatie draagt, volledig een crypte te laten bevolken, het dier te doden, de dikke darm te verwijderen, en het om te vormen tot een Zwitserse rol en het weefsel in vloeibare stikstof te bevriezen. De tweede stap is om zeven micron dikke bevroren secties op dia's te bereiden uit de dikke darm met behulp van een cryostaat.
Het weefsel wordt opgewarmd tot 37 graden Celsius en vervolgens worden putjes voor weefselkleuring rond de weefselsecties geconstrueerd. De laatste stap is om de weefselsecties te incuberen met de G zes PD-kleuringsmix en vervolgens de secties onder een lichtmicroscoop te analyseren. Cellen met G zes PD-activiteit kleuren blauw, terwijl degenen met fenotypische mutaties witachtig zijn. Uiteindelijk wordt de kwantificering van gemuteerde crypten gebruikt om de mutatiefrequentie te bepalen.
Deze techniek meet glucose zes fosfaat dehydrogenase somatische mutaties in stamcellen, en dit is de kritieke celpopulatie bij coloncarcinogenese. Door somatische stamcelmutaties te identificeren, is het mogelijk om de mutatiefrequentie te correleren met colonkankerincidenten bij behandelde dieren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in stamcelmutaties in de dikke darm, kan deze ook worden toegepast op andere modelorganismen of orgaansystemen.
Als een stamcelnich kan worden geïdentificeerd, zullen individuen die nieuw zijn met deze methode over het algemeen worstelen met de voorbereiding van de MBT-oplossing. Oplossen. De MBT-oplossing vereist zorgvuldige aandacht voor gedetailleerde instructies. Om te beginnen met het voorbereiden van de histologische kleuringsoplossing bij twee milliliter pH 7,4 fosfaatbuffer tot 35 milliliter optimaal snijtemperatuur of OCT-medium in een 50 milliliter buis en krachtig schudden om te combineren met behulp van pH-papier.
Bevestig dat de oplossing ongeveer pH 7,4 is. Vervolgens bij glucose zes fosfaat en een DP- en magnesiumchloride-oplossing opgelost in fosfaatbuffer zoals aangegeven in het tekstprotocol en nogmaals, bevestigd dat de pH van de oplossing ongeveer 7,4 blijft. ADD M-M-P-M-S-oplossing en krachtig mengen.
Dit zou moeten resulteren in een heldere, donkerrode homogenaat. Wikkel de oplossing in folie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Als de oplossing troebel wordt, moet deze worden weggegooid terwijl een oliebad wordt verwarmd. Bereid afzonderlijk een vijf millimolair nitro blauw tot teraz oleum of MBT-oplossing door 0,4 milliliter dimethylformamide, 0,4 milliliter anhydreus ethanol en MBT in een twee milliliter buis met een O-ring deksel losjes te verzegelen en deze krachtig te koken in het oliebad totdat de MBT is opgelost.
Laat vervolgens de MBT-oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en voeg het vervolgens toe aan het OCT-reactiemengsel. De oplossing kan na verloop van tijd van de oorspronkelijke oranjerode kleur veranderen in donkerrood of paars. Na het behandelen van dieren en het voorbereiden van bevroren secties zoals aangegeven in het tekstprotocol, bouw putjes voor weefselkleuring met behulp van twee stalen ringen die met siliconenvet op de basis van de ring zijn gebonden en het middelste deel uitsnijden waar de oplossing zal worden geplaatst vervangen.
Warm de bevroren weefseldia's vooraf in een vochtige 37 graden Celsius kamer gedurende 10 minuten. Plaats vervolgens de putjes op de dia om de weefselsecties te omringen bij ongeveer een halve milliliter van het eerder bereide G zes PD-kleuringsmengsel naar elke weefselsectieput en incubeer gedurende 45 tot 50 minuten. Haal de dia's uit de warme kamer en verwijder voorzichtig de roestvrijstalen putjes van de dia's.
Plaats de dia's op de lange rand en laat het reactiemengsel weglopen, gevolgd door een 30 tot 60 minuten wassing en 100 millimolair fosfaatbuffer. Om de laatste sporen van de G zes PD-kleuringsoplossing te verwijderen, spoel de dia's en gedeïoniseerd water gedurende vijf tot tien minuten om resterend fosfaatbuffer te verwijderen. Ten slotte verzegel het weefsel door fluorogel druppelsgewijs toe te voegen op de dia en droog gedurende 30 minuten om afbeeldingen te verkrijgen voor latere analyse.
Plaats de dia op een lichtmicroscoop en pas deze aan op vier DX-vergroting. Neem vervolgens foto's van de gekleurde weefselsectie met een 5,0 megapixelcamera om het totale aantal onderzochte crypten te schatten. Selecteer voor elke muis een sectie van het niveau met het kleinste oppervlak en beeld deze in op 10 x vergroting af.
Tel het aantal mutante crypten. Volgens de volgende criteria is de hele crypte verstoken van blauwe kleur. De buitenstructuur van de crypte is intact.
De mutant wordt waargenomen op aangrenzende zeven micron secties en twee waarnemers identificeren dezelfde crypte als mutant. Tel visueel het aantal crypten in deze sectie en vermenigvuldig met het aantal niveaus dat voor elke dikke darm is gescreend. Voorbeelden van mutante Crips waargenomen bij muizen behandeld met het DNA-beschadigend middel azoxymethaan zijn hier links te zien, je ziet een verticale of top-down weergave van een mutante crypte.
Terwijl aan de rechterkant een horizontale of zijkant is, moet voor een crypte om te worden verklaard als mutant, alle cellen binnen de crypte aanwezig blijven. Witte crypten met een kleine hoeveelheid wit zijn te wijten aan slijmproductie van bekercellen. De mutatiefrequentie wordt berekend als het aantal waargenomen mutanten gedeeld door het totale aantal gekleurde crypten, geen mutant.
Crypten werden waargenomen in colon van controlemuizen die een mutatiefrequentie vertegenwoordigen van minder dan een keer 10 tot de min vijfde, terwijl az
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het kwantificeren van somatische mutaties in colonstamcellen na blootstelling aan potentiële DNA-beschadigende stoffen. De focus ligt op het glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD)-gen en het proces van het meten van de mutatiefrequentie in behandelde muizen.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Stamcelbiologie
Achtergrond
- Somatische mutaties kunnen de celfunctie beïnvloeden en bijdragen aan ziekten.
- G6PD is een cruciaal gen voor het cellulaire metabolisme.
- Inzicht in de mutatiefrequentie helpt bij het beoordelen van genotoxische effecten.
- Colonstamcellen zijn essentieel voor weefselregeneratie en homeostase.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode te ontwikkelen voor het meten van somatische mutaties.
- Om de impact van genotoxische agentia op colonstamcellen te beoordelen.
- Om de mutatiefrequentie van het G6PD-gen te kwantificeren.
Gebruikte methoden
- Behandeling van muizen met potentiële DNA-beschadigende stoffen.
- Tijd die is toegestaan voor stamcelnakomelingen om de coloncrypten te koloniseren.
- Bereiding van ingevroren weefselcoupes van het colon.
- Kleuring en analyse van de coupes onder een lichtmicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van gemuteerde crypten in behandelde muizen.
- Identificatie van fenotypische mutaties door middel van kleuring.
- Vestiging van een betrouwbare methode voor het meten van mutaties.
- Significante verbeteringen in de reproduceerbaarheid van resultaten.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van somatische mutaties.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de effecten van genotoxische agentia.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methodologie voor verdere inzichten.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het kwantificeren van somatische mutaties in colonstamcellen maakt vroege detectie van genotoxische effecten van kandidaatverbindingen mogelijk, wat direct bijdraagt aan de risicobeoordeling bij de ontdekking van oncologische geneesmiddelen. Deze fenotypische assay biedt voorspellende zekerheid voor mechanische risicoreductie in de fase van targetvalidatie, wat helpt bij de triage van de portefeuille en de prioritering van verbindingen met een lagere carcinogene potentie. De reproduceerbaarheid van de methode en de kwantitatieve resultaten versterken de crossfunctionele besluitvorming bij de preklinische veiligheidsevaluatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe meting van de mutatiefrequentie in kritieke stamcelpopulaties mogelijk na blootstelling aan verbindingen.
- Ondersteunt mechanische risicobeperking door genotoxiciteit te koppelen aan functionele uitkomsten in weefselresidente stamcellen.
- Levert kwantitatief bewijs voor doelvalidatie en triage van verbindingen in een vroeg stadium.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerde, reproduceerbare enzymatische assay voor het detecteren van fenotypische mutaties in situ.
- Faciliteert de standaardisatie van genotoxiciteitsscreening over verschillende verbindingenbibliotheken heen.
- Genereert kwantitatieve, door waarnemers bevestigde resultaten die geschikt zijn voor comparatieve analyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt mutatiefrequentiegegevens uit met ziekterelateerde eindpunten in modellen van coloncarcinogenese.
- Maakt continuïteit mogelijk van genotoxiciteitsbevindingen in de ontdekkingsfase naar preklinische veiligheidsbeoordeling.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling op basis van de mutatielast in stamcellen.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze assay voor de kwantificering van fenotypische mutaties is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek en slaat een brug tussen vroege genotoxiciteitsbeoordeling en daaropvolgende veiligheidswerkstromen.
- Discovery Biology: Biedt een directe weergave van de inductie van somatische mutaties in stamcellen, waardoor risico's met betrekking tot het werkingsmechanisme van verbindingen worden verduidelijkt.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve gegevens over de mutatiefrequentie voor de rangschikking en selectie van verbindingen.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van mutatiesnelheden tussen behandelings- en controlegroepen mogelijk, ter ondersteuning van datagestuurde beslissingen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vivo mutatiegegevens met ziekterelateerde modellen van carcinogenese.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar aan andere organsystemen of modelorganismen met identificeerbare stamcelniches.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in het genotoxiciteitsrisico en de validatie van targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert de detectie en kwantificering van mutaties voor reproduceerbare resultaten.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert uitval in een laat stadium door onvoorziene carcinogeniteit.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van mutatieprofielen in stamcellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, cryosectie en enzymatische histochemie.
- Vereist toegang tot cryostaten, lichtmicroscopie en instrumenten voor kwantitatieve beeldanalyse.
- Noodzaak tot strikte standaardisatie tussen teams voor de bereiding van oplossingen en scorecriteria.
- Aanpasbaar voor andere weefsels met gedefinieerde stamcelcompartimenten, mits de niche is geïdentificeerd.
- Zorgvuldige omgang met oplossingen en validatie door de waarnemer zijn cruciaal voor de betrouwbaarheid van de analyse.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
2:10
Preparation of Glucose-6-phosphate Dehydrogenase (G6PD) Staining Mixture
3:56
Tissue Section Staining
5:19
Determination of Mutation Frequency
6:14
Results: Colonic Stem Cell Mutation Frequency as Determined by Analysis of G6PD Mutant Crypts
7:12
Conclusion
