Name: Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Leer een methode om somatische mutaties in colorectale stamcellen te kwantificeren na behandeling met genotoxische stoffen. Deze techniek analyseert G6PD-genmutaties via histologische kleuring en lichtmicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen bevestigingen.

De experimentele procedures en de ethische behandeling van dieren werd goedgekeurd door de Universiteit van Pittsburgh IACUC (protocol # 1.104.674). 1. Bereiding van G6PD kleuring Mixture OPMERKING: Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van elke reagentia is als volgt; 5 mM glucose-6-fosfaat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0,35 mM 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfaat (MMPMS) en 0,8 mM NBT. 1,8,9 Voor elk reagens de aanvankelijke concentratie die voor een 40 ml eindvolume. Oplossingen werden vers bereid en toegepast per dag. <ol><li> Voeg 2 ml van 200 mM pH 7,4 fosfaatbuffer (PB) tot 35 ml oktober medium in een 50 ml buis en schud krachtig. Bevestig met pH-papier dat de oplossing ~ pH 7,4. Zo niet de oplossing weggooien. </li><li> Voeg 61 mg G6P opgelost in 0,94 ml van 200 mM PB, 61 mg NADP opgelost in 0,94 ml van 200 mM PB en 41 mg MgCl 2, opgelost in 0,96 ml van 100 mM PB. Herbevestigen dat de pH ~ 7.4 with pH-papier. Zo niet ~ 7.4, gooi de oplossing. </li><li> Voeg 5 mg MMPMS opgelost in 0,25 ml van 200 mM PB (pH 7,4). Schud het verkregen reaktiemengsel een heldere donkerrode homogenaat genereren. Als de oplossing troebel, moet het mengsel worden weggegooid. De buis die het reactiemengsel wordt verpakt in folie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Bewaar het reactiemengsel bij kamertemperatuur, terwijl de uiteindelijke component, NBT, bereid. </li><li> Bereid afzonderlijk een 5 mM NBT door toevoeging van 0,4 ml watervrij dimethylformamide (DMF) en 0,4 ml watervrije ethanol 164 mg NBT in een 2 ml buisje met een O-ring deksel. Sluit het deksel los (niet afgedicht) en breng de oplossing van een krachtige kook in een oliebad totdat de NBT in oplossing. 8 </li><li> Laat het opgeloste NBT afkoelen tot kamertemperatuur en voeg alle oplossing aan het reactiemengsel oktober en schud krachtig tot een heldere oplossing te verkrijgen. Let op de oplossing kleurverandering van de eerste oranje-rood tot een donker-rode of purple kleur na verloop van tijd. Dit is normaal. </li><li> Plaats de uiteindelijke G6PD kleuring mengsel in een 37 ° C warme kamer voor 1 uur vóór gebruik. </li></ol> 2. Animal Behandeling en Tissue Collection <ol><li> Behandel 6 weken oude C57BL / 6 mannelijke muizen met DNA beschadigende middel, bijvoorbeeld 10 mg / kg azoxymethaan (AOM) in een volume van 200 pl PBS door ip injectie. Behandel controlemuizen met 200 pl PBS door ip injectie. </li><li> Op 90 dagen, euthanaseren muizen door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie zoals goedgekeurd door IACUC protocol. </li><li> Operatief open de buikholte van net boven de anus naar de basis van het borstbeen. Verplaats de dunne darm uit de lichaamsholte, maar niet te snijden is. Uitsnijden de dikke darm net onder de blindedarm het rectum. 10 </li><li> Zorgvuldig snijden langs één zijde van het colon met een micro-dissectie schaar en verwijder uitwerpselen uit de geopende colon door wassen met schoon steriel PBS. Swiss roll de accijnzend dikke darm met de luminale zijde naar buiten gericht, en plaats in een tissue mal. 10 </li><li> Volledig onder te dompelen de dikke darm in oktober medium en plaats schimmel in een Dewar met vloeibare N2. Houd de mal zodat het plastic base alleen in contact met het vloeibare N2 tot oktober medium wordt vast bevroren. </li><li> Bewaar de ingevroren weefsel blok bij -80 tot snijden van bevroren secties. Gebruik geen fixatief, die zou resulteren in de inactivering van het enzym G6PD gebruiken. </li></ol> 3. Voorbereiding van bevroren secties <ol><li> Knip ingevroren weefselsecties bij een dikte van 7 urn met behulp van een cryostaat bij -25 ° C. Snij 4 opeenvolgende 7 urn secties en plaats twee van hen op dezelfde dia (figuur 1). Bereid 2 glijbanen of vier opeenvolgende 7 urn secties om een niveau van de dikke darm (Figuur 1) te vertegenwoordigen. </li><li> Herhaal dit voor het volgende niveau met een minimale afstand van&gt; 50 um van het laatste deel van de previous niveau. Deze afstand zorgde ervoor dat de crypten beoordeeld voor elk niveau niet dupliceren elkaar. </li><li> Vaak veeg de cryostaat mes met 100% ethanol om de oktober residu dat zich ophoopt tijdens het snijden te verwijderen. Voordat snijden wordt hervat, is de droge mes afgeveegd met een antistatische droger blad aan opgebouwde statische lading af te voeren. Store dia&#39;s met de bevroren secties bij -80 o C </li></ol> 4. kleuring van Frozen afdeling Tissue <ol><li> Voeren het enzym histochemie reactie in een 37 ° C warme ruimte met een hoge luchtvochtigheid. OPMERKING: Proberen de enzymatische reactie in een incubatie oven of op een dia warmer leidde tot slecht en inconsistent G6PD vlekken. </li><li> Bouw putjes weefsel kleuring met twee 1,5 cm x 0,15 cm stalen ringen (inwendige diameter x hoogte) die aan elkaar gehecht siliconenvet gebruikt (figuur 1). Snijd de parafilm aan de basis van de put met het midden fit uitgesneden en de put placed over de sectie weefsel op de dia. Opmerking: De parafilm op de bodem van de ring zorgt voor een afdichting tussen de slede en de ring die het viskeuze G6PD kleuring mengsel op weefselsectie handhaaft. Dit construct geeft een put met 0,4 - 0,5 ml volume, zodat elke sectie weefsel in de studie hetzelfde volume van het reactiemengsel G6PD kleuring mengsel ontvangt. </li><li> Incubate ingevroren weefsel dia bij 37 o C in een warme kamer gedurende 10 minuten. Bij 37 ° C, voeg de G6PD kleuring reactiemengsel aan elk weefselsectie put (2 delen per slide) gedurende 45-50 min. Verwijder dia&#39;s uit warme kamer, en til de RVS putten uit de dia&#39;s. </li><li> Set dia&#39;s op de lange zijde om de reactie medium uitlekken. Plaats de glaasjes in 100 mM PB (pH 7,4) gedurende 30-60 min met de G6PD kleuring reactiemengsel uit het weefsel te verwijderen zonder de weefselkleuring. Dompel dia&#39;s in gedestilleerd water gedurende 5-10 min naar PB zouten te verwijderen </li><li> Verzegelen het weefsel van adding fluor-gel van een druppelaar op het weefsel en wachten ~ 30 min tot het droog is. Vermijd bellen dat de identificatie van gemuteerde crypten kan verwarren. LET OP: Als er bellen te vormen, kan de procedure na het verwijderen van de fluor-gel worden herhaald door het weken in gedestilleerd water. Gebruik geen dekglaasjes als ze de neiging om val luchtbellen. </li></ol> 5. Vaststelling van G6PD Mutant crypten en mutatiefrequentie <ol><li> Analyseer glijbanen voor G6PD mutant crypten onder een lichtmicroscoop. LET OP: Het wordt gebruikt om een ​​volledig mutant crypte identificeren criteria waren: (i) het hele crypte was verstoken van blauwe kleur; (ii) de buitenkant van de crypte intact was, (iii) de mutant crypte waargenomen op aangrenzende secties 7 urn en, (iv) twee waarnemers moest hetzelfde crypte identificeren als een mutant. Mutanten waargenomen op aangrenzende 7 urn secties zijn als één mutant. </li><li> Afbeelding elke G6PD mutant crypte op 40x vergroting en de catalogus van de beelden met behulp van een 5,0 megapixel camera metimaging software. </li><li> Kwantificeren van het totale aantal crypten in een muis onderzocht met een representatief deel van elke muis van de hoogte van de kleinste oppervlakte stippellijn beeld in bij 10x vergroting (figuur 1C) selecteren. LET OP: Een niveau vertegenwoordigt vier opeenvolgende 7 micrometer secties (figuur 1D), die vanwege hun nabijheid vaak tonen gemuteerd crypten op meer dan één sectie. De niveaus worden gescheiden door&gt; 50 urn tot crypten uit verschillende gebieden van de colon te visualiseren. </li><li> Open elke beeldbestand en visueel tellen het aantal crypten op een niveau analyse betreft (weergegeven als boxen in figuur 1C). Beeldbestanden zullen variëren van het aantal crypten waargenomen van zo laag als 20 tot&gt; 300 crypten in één bestand. </li><li> Vermenigvuldig het aantal crypten van het gekozen niveau (figuur 1C) voor elke muis het aantal niveaus gescreend G6PD mutant crypten per colon. Bijvoorbeeld, een totaal aantal van1250 crypten per geselecteerde niveau vermenigvuldigd met 8 niveaus gescreend mutant crypten gelijk aan een totaal aantal van 10.000 crypten. Evalueer minste 10.000 crypten per colon voor statistische analyse. </li><li> Combineer het aantal mutanten in alle dieren waargenomen door het totale aantal crypten gescreend om de MF te berekenen voor elke behandeling. De achtergrond stamcellen MF niveau onbehandelde muizen &lt;0.1x10 -4 (tabel 1), wat dicht bij die voorheen in C57BL / 6 muizen. 11 </li></ol>

<ol><li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li>
<li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li>
<li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+%28g6pd%29+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry%3A+a+consumer%E2%80%99s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li>
<li>Giardina Rosenberg, D. W., C,, Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li>
<li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li>
<li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li>
<li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li>
<li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li>
<li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon%3A+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vaak genotoxische effect van een verbinding wordt bepaald door zijn vermogen om DNA te wijzigen. Dit gebeurt normaal gesproken door het isoleren van het weefsel en het meten van het globale niveau van DNA adducten. Voor AOM, zou dit inhouden kwantificeren O 6 methylguanine adducten in de colon. Met deze aanpak gegevens over schade in specifieke celtypen, zoals in de stamcelniche, verloren. Verder een DNA adduct is niet hetzelfde als een mutatie aangezien slechts een klein deel van adducten uiteindelijk worden...

Darmkanker wordt gedacht dat blootstelling aan milieu-agenten en voedingscomponenten dat DNA kan beschadigen betrekken en produceren van activerende somatische mutaties in oncogenen (bijvoorbeeld ß-catenine) of inactiveren mutaties in tumorsuppressorgenen (bijvoorbeeld APC). Aangenomen wordt dat deze kritische mutaties optreden in colon stamcellen. Vanwege de unieke architectuur crypte van het colonepitheel is het mogelijk om stamcellen mutaties in het colon te meten na blootstelling van dieren aan chemicaliën geassocieerd met darmkanker. Verscheidene X-gebonden enzymen kunnen dienen als indicatoren voor de mutaties die voorkomen in stamcellen, de mutaties in alle cellen binnen een crypte zal zijn. Voorheen werd een procedure gepubliceerd waaruit blijkt dat chemische stoffen die darmtumoren induceren in muizen ook gegenereerd somatische stamcellen mutaties in het colon via de analyse van mutaties in het X-gebonden glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) gen. 1-3De werkwijze kwantificeert het optreden van willekeurige mutaties in somatische stamcellen colon zonder selectiedruk. De procedure heeft betrekking op de productie van niet-gefixeerde bevroren dikke delen van behandelde en controle muizen en de identificatie van de crypten verstoken van cellen die functionele G6PD activiteit te produceren. Deze gemuteerde crypten, die wit verschijnen aan dat de mutatie zich in een stamcel die tot nageslacht gaf ook herbergt een gemuteerd gen G6PD. In de enzymatische assay, kan G6PD deficiënte mutant crypten niet oxideren glucose-6-fosfaat, die nodig is voor de reductie van nitro blue tetrazolium (NBT). Wanneer de G6PD enzym functioneel, de NBT de kleuring mengsel wordt gereduceerd tot oplosbare formazan en neerslagen accumuleren op de plaats van het enzym en &quot;kleuring&quot; blue cellen. Cellen die G6PD mutanten zijn blijven witachtig in tegenstelling tot blauw gekleurde wild type crypten. Deze methode meet mutaties die een &quot;nul&quot; fenotype hebben. Omdat nlZymes zoals G6PD kunnen diffunderen uit de cellen op een niet vastgelegde weefselsectie wanneer de secties in een waterige oplossing worden gebracht, is het noodzakelijk het enzym te stabiliseren in de weefselcoupes te analyseren. 4 De stabilisering van het enzym in het weefsel moet niet belemmeren diffusie van kleine moleculen reagentia voor de enzymatische reactie G6PD. We hebben een aantal belangrijke wijzigingen in de oorspronkelijke procedure gemaakt. Het medium voor de kritische enzymatische kleuring is gewijzigd van polyvinyl alcohol Optimaal snijtemperatuur Verbinding (oktober), waarbij de pH controle en oplossen van de bestanddelen die in de test vergemakkelijkt. De kleuring wordt uitgevoerd met 0,4-0,5 ml wells van staal ringen zodat elke weefselsectie ontvangen hetzelfde volume van de G6PD reactiemengsel. Een procedure werd ontwikkeld voor het schatten van het aantal crypten per afgebeeld sectie die een grote bemonstering van het colon weefsel verschaft zonderhandmatig tellen&gt; 10 5 crypten per colon. De analyse van aangrenzende 7 urn weefselcoupes verschaft visualisatie van een mutant crypte op meer sledes, die potentiële kleuring artefacten verminderd. Deze wijzigingen maken de procedure efficiënter en reproduceerbaar. Met deze herziene protocol, hebben we de mutatiefrequentie in colon stamcellen gekwantificeerd na blootstelling van C57BL / 6 muizen azoxymethane, een bekend carcinogeen colon bij knaagdieren. 5-7

<table><tbody><tr><td>reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitroblue tetrazoliom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glucose-6-fosfaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-methoxy-5-methylfenazinium methylsulfaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimethylformamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfaatbuffer (pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimale Snijtemperatuur Compound (OCT)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lichtmicroscoop uitgerust met een 5 megapixel camera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>warme kamer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van colonic stem cell mutaties

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

De mogelijkheid om stamcellen mutaties te meten, is een krachtig hulpmiddel om te kwantificeren in een kritische cel populatie of, en in welke mate, kan een chemische mutaties die kunnen leiden tot kanker veroorzaken. De toepassing van een enzymatische bepaling om stamcellen mutaties kwantificeren in de X-gebonden glucose-6-fosfaat-dehydrogenase gen is eerder gemeld. 1 Deze methode vereist de bereiding van ingevroren secties en incubatie van het doorgesneden weefsel met een reactiemengsel dat een oplevert blauw wanneer de cellen functioneel glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) enzym. Indien niet, de cellen lijken witachtig. We hebben het reactiemengsel met behulp van optimale Cutting Temperatuur Verbinding (oktober) medium in plaats van polyvinyl alcohol gewijzigd. Dit vergemakkelijkt pH meting verhoogt oplosbaarheid van de G6PD kleuring componenten en beperkt diffusie van de G6PD enzym. Om aan te tonen dat een mutatie zich in een stamcel, moet de gehele crypt G6PD enzymatische missenactiviteit. Alleen als een stamcel herbergt een fenotypische G6PD mutatie zullen de nakomelingen in de crypte gebrek G6PD enzymatische activiteit. Om crypten met een stamcel mutatie te identificeren, werden vier opeenvolgende aangrenzende vriescoupes (niveau) gesneden op 7 urn dikte. Deze benadering van het maken aangrenzende sneden worden conformatie die een crypte volledig gemuteerd aangezien dezelfde gemuteerde crypte zal worden waargenomen in aangrenzende secties. Slides met weefselmonsters die meer dan 50 urn uit elkaar waren bereid waren totaal&gt; 10 4 crypten per muis evalueren. De mutatie-frequentie is het aantal waargenomen gemuteerde (wit) crypten ÷ door het aantal wild type (blauw) crypten in een behandelgroep.

Het vermogen om colon stamcellen mutaties meten bij dieren biedt een unieke manier om mutaties kankerinductie correleren. Gewoonlijk wordt aangenomen dat de kritische stap in carcinogenese omvat activerende mutaties in oncogenen en / of inactiverende mutaties in tumorsuppressorgenen. Geïnjecteerd C57BL / 6 muizen met 200 ul PBS of 10 mg / kg AOM in 200 pl PBS. AOM is een bekend colon kankerverwekkend. 07/05 Bij 90 dagen werden de dubbele punten geanalyseerd voor stamceltransplantatie mutaties. Deze tijd nodig...

We rapporteren significante verbeteringen voor de reproduceerbare meting van somatische colonische stamcelmutaties na blootstelling van muizen aan potentieel DNA-beschadigende stoffen.

Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

Het algemene doel van deze procedure is om fenotypische somatische mutaties in het glucose-6-fosfaatdehydrogenase- of G6PD-gen in colonstamcellen te kwantificeren. Na behandeling van dieren met vermeende genotoxische agentia wordt dit bereikt door de dieren eerst met het agens te behandelen, een passende tijd af te wachten zodat de nakomelingen van een stamcel met een G6PD-mutatie een crypt volledig kunnen bewonen, het dier te offeren, de dikke darm te verwijderen, deze in een Swiss roll te vormen en het weefsel in vloeibare stikstof te bevriezen. De tweede stap is het vervaardigen van zeven micron dikke bevroren coupes van de dikke darm op objectglazen met behulp van een cryostaat.Het weefsel wordt opgewarmd tot 37 °C en vervolgens worden er per weefselkleuring putjes rondom de weefselcoupes geconstrueerd. De laatste stap is het incuberen van de weefselcoupes met het G6PD-kleuringsmengsel, waarna de coupes onder een lichtmicroscoop worden geanalyseerd; cellen met G6PD-activiteit kleuren blauw, terwijl cellen met fenotypische mutaties witachtig verschijnen. Uiteindelijk wordt de kwantificering van gemuteerde crypten gebruikt om de mutatiefrequentie te bepalen.Deze techniek meet somatische mutaties van glucose-6-fosfaatdehydrogenase in stamcellen, wat de kritieke celpopulatie is bij coloncarcinogenese. Door somatische stamcelmutaties te identificeren, is het mogelijk om de mutatiefrequentie te correleren aan colonkankerincidenten in behandelde dieren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in stamcelmutaties in het colon, kan ze ook worden toegepast op andere modelorganismen of orgaansystemen.Indien een stamcelniche geïdentificeerd kan worden, zullen personen die nieuw zijn met deze methode over het algemeen moeite hebben met de bereiding van de MBT-oplossing. Het oplossen. De MBT-oplossing vereist zorgvuldige aandacht voor de gedetailleerde instructies. Om de histologische kleuringsoplossing te bereiden, voegt men 2 mL fosfaatbuffer pH 7,4 toe aan 35 mL optimal cutting temperature, of OCT-medium, in een buis van 50 mL en schudt men krachtig om te mengen onder controle met pH-papier.Bevestig dat de oplossing een pH van ongeveer 7,4 heeft. Voeg vervolgens glucose-6-fosfaat, ATP en een magnesiumchloride-oplossing toe, opgelost in fosfaatbuffer zoals aangegeven in het tekstprotocol, en bevestig opnieuw dat de pH van de oplossing ongeveer 7,4 blijft. Voeg de MMP-MS-oplossing toe en meng krachtig.Dit moet resulteren in een helder, donkerrood homogenaat; wikkel de oplossing in folie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Als de oplossing troebel wordt, moet deze worden weggegooid terwijl een oliebad wordt opgewarmd. Bereid apart een vijf millimolaire nitro-blauwe tetrazolium- of MBT-oplossing door 0,4 milliliters dimethylformamide, 0,4 milliliters watervrije ethanol en MBT in een buisje van twee milliliter met een O-ring dop te mengen; sluit het buisje losjes en breng het aan de kook in het oliebad tot de MBT is opgelost.Laat de MBT-oplossing vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur en voeg deze vervolgens toe aan het OCT-reactiemengsel. De kleur van de oplossing kan na verloop van tijd veranderen van het oorspronkelijke oranjerood naar donkerrood of paars. Nadat de dieren zijn behandeld en de bevroren coupes zijn voorbereid zoals aangegeven in het tekstprotocol, worden er putjes voor weefselkleuring gemaakt door twee stalen ringen met siliconenvet aan elkaar te hechten, deze op de basis van de ring te passen en het centrum uit te snijden waar de oplossing zal worden geplaatst.Warm de bevroren weefselcoupes 10 minuten voor in een bevochtigde ruimte van 37 °C. Plaats vervolgens de wells op de coupes om de weefselsecties te omringen, voeg ongeveer een halve milliliter van het eerder bereide G6PD-kleuringsmengsel toe aan elke well met een weefselsectie en incubeer gedurende 45 tot 50 minuten. Haal de coupes uit de warme ruimte en verwijder voorzichtig de roestvrijstalen wells van de coupes.Plaats de objectglaasjes op de lange zijde en laat het reactiemengsel weglopen, gevolgd door een wasbeurt van 30 tot 60 minuten met 100 millimolaire fosfaatbuffer. Om de laatste sporen van de G6PD-kleuringsoplossing te verwijderen, worden de objectglaasjes vijf tot 10 minuten gespoeld met gedeïoniseerd water om resterende fosfaatbuffer te verwijderen. Seal tot slot het weefsel door druppelsgewijs fluorogel op het objectglas aan te brengen en laat dit 30 minuten drogen voordat er beelden worden vastgelegd voor latere analyse.Plaats de preparaatglas op een lichtmicroscoop en stel deze in op een 4x vergroting. Neem vervolgens foto's van de gekleurde weefselcoupe met een camera van 5,0 megapixel om het totale aantal onderzochte crypten te schatten. Selecteer voor elke muis een coupe op het niveau met het kleinste oppervlak en beeld dit af bij een 10x vergroting.Tel het aantal mutante crypten. Volgens de volgende criteria is de gehele crypt ontdaan van blauwe kleur. De buitenstructuur van de crypt is intact.De mutant wordt geobserveerd op aangrenzende secties van zeven micron en twee waarnemers identificeren dezelfde crypt als mutant. Tel visueel het aantal crypten in deze sectie en vermenigvuldig dit met het aantal gescreende niveaus per colon. Voorbeelden van mutante crypten waargenomen in muizen die zijn behandeld met het DNA-beschadigende middel azoxymethaan kunnen hier worden gezien; links ziet u een verticaal of bovenaanzicht van een mutante crypt.Terwijl aan de rechterkant een horizontaal of zijdelings beeld te zien is, moeten voor het classificeren van een crypt als mutant alle cellen binnen de crypt behouden blijven. Witte crypten met een kleine hoeveelheid wit worden veroorzaakt door slijmproductie van bekercellen. De mutatiefrequentie wordt berekend als het aantal waargenomen mutanten gedeeld door het totaal aantal gescreende crypten zonder mutant.Crips werden waargenomen in darmen van controlemuizen, waarbij de mutatiefrequentie minder dan 1 × 10⁻⁵ was, terwijl azoxymethaan-behandelde muizen na deze procedure een stamcelmutatiefrequentie van 4,44 × 10⁻⁴ vertoonden. Andere methoden, zoals de genetische analyse van het type glucose-6-fosfaatdehydrogenase-mutaties, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop het chemische agens een mutatie veroorzaakt. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het meten van somatische stamcelmutaties in muizen die zijn behandeld met potentieel mutagene en carcinogene verbindingen.

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Verminderd / afwezige uitdrukking van PMS2 en / of ERCC1 in hele crypten is een frequent geval binnen 10 cm aan elke kant van colon adenocarcinomen, waarschijnlijk de basis van een gezichtsveld met een hoge veranderlijkheid en de progressie van kanker. Deficiëntie in Ku86 of CcOI is veel minder frequent in deze veld gebreken.

Gebrekkige PMS2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Gebreken Tijdens Progressie naar Colon Cancer

Beschreven wij een procedure voor het uiteenvallen van colorectale kanker (CRC) levensvatbare enkele cellen, die vervolgens worden opgevangen op maat antilichaam microarrays herkennen van oppervlakte-antigenen (DotScan CRC microarray) te produceren. Subpopulaties van cellen gebonden aan de microarray kan worden geprofileerd door fluorescentie multiplexen behulp van monoklonale antilichamen gelabeld met een fluorescerende kleurstoffen.

Colorectal Cancer Cell oppervlakte-eiwit Profiling Met behulp van een antilichaam Microarray en fluorescentie Multiplexing

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een experimentele opstelling voor een analyse van de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen van de stam voorafgaand aan de transplantatie van de cel.

Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie

De gepresenteerde diagnostische FL-DNA kit is een tijdbesparende en gebruiksvriendelijke methode om de betrouwbare waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van colorectale kankerlaesies te bepalen.

Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie

Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van klonale en subclonale veranderingen tussen verschillende specimens van een bepaalde patiënt. Hoewel de hier beschreven experimenten gericht zijn op een specifiek tumor type, is de aanpak algemeen toepasbaar op andere vaste tumoren.

Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering

Hier gepresenteerd is een protocol om de overuitexpressieve driver genen behoud van de gevestigde kanker stam-achtige cellen afgeleid van colorectale HT29 cellen te ontdekken. RNAseq met beschikbare bioinformatica werd uitgevoerd om genexpressienetwerken te onderzoeken en te screenen voor het ophelderen van een potentieel mechanisme dat betrokken is bij de overleving van gerichte tumorcellen.

Ontdekking van drivergenen in colorectale HT29-afgeleide kankerstam-achtige tumorsferen

Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en kosteneffectieve methode om celdood in menselijke colonorganoïden te onderzoeken en te kwantificeren als reactie op cytotoxische perturbagens zoals cytokines. De aanpak maakt gebruik van een fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), live fluorescentiemicroscopie en open-source beeldanalysesoftware om enkelvoudige organoïde reacties op cytotoxische stimuli te kwantificeren.

Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Leer een methode om somatische mutaties in colorectale stamcellen te kwantificeren na behandeling met genotoxische stoffen. Deze techniek analyseert G6PD-genmutaties via histologische kleuring en lichtmicroscopie.

Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties

Meer video's verkennen