Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Het algemene doel van deze procedure is om de progressie van de celcyclus te volgen van gesorteerde neurale stamcellen en hun nakomelingen, geïsoleerd uit de subventriculaire zone van transgene fluorescentie-ubiquitinering-celcyclus-muizen (FCI-muizen). Dit wordt bereikt door eerst de subventriculaire zone van transgene volwassen muizenhersenen te dissecteren. De tweede stap is het dissocieren van het neurale weefsel tot een enkelcel-suspensie met behulp van een papayne-behandeling.

Vervolgens worden de verschillende neurogene celpopulaties van de subventriculaire zone gelabeld met behulp van antilichamen om quiescente neurale stamcellen, geactiveerde neurale stamcellen, transit-amplificerende cellen en onrijpe alsmede migrerende neuroblasten te identificeren. De laatste stap is het gebruik van FACS om de cellen direct in vers kweekmedium te sorteren voordat ze worden geplaatst op met poly-D-lysine gecoate platen. Ten slotte wordt continue time-lapse videomicroscopie gebruikt om de progressie van de celcyclus van de geplaatste cellen te bestuderen, aangezien de verschillende transgene cellen fluoresceren op verschillende tijdstippen tijdens hun celcyclus.

Door de cel sorteertechniek te combineren met de Fuji-technologie kunnen de verschillende celpopulaties uit de subventriculaire zone worden gevisualiseerd en geïsoleerd, waardoor de eigenschappen en dynamiek in het volwassen bewegingsbrein kunnen worden bestudeerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de context van veroudering en hersenpathologieën. De dag voor het experiment: voeg ongeveer 200 µL van een 10 µg/mL poly-D-lysine-oplossing toe aan elke put van een steriele 96-wells plaat met zwarte wanden om de bodem van de putten te coaten; dek de plaat af en incubeer deze overnacht bij 37 °C. De volgende dag.

Verwijder de poly-D-lysine-oplossing en spoel de wells drie keer met steriel gedestilleerd water voordat de plaat gedurende ten minste twee uur in de zuurkast onder laminaire stroming wordt gedroogd. Indien de plaat niet onmiddellijk wordt gebruikt, kan de gedroogde gecoate plaat tot zeven dagen bij vier graden Celsius worden bewaard.

Bereid vervolgens de papaine-dissociatie-oplossing en steriliseer deze door het mengsel door een 0,2 micron filter te leiden. Verwarm de oplossing voor tot 37 °C voordat deze wordt gebruikt. Bereid daarnaast een protease-remmingsoplossing door 0,7 mg/mL trypsineremmer type twee toe te voegen aan steriel TM F 12-medium.

Filter de oplossing met een 0,2 micron filter en verwarm de oplossing voor tot 37 degrees Celsius voordat deze wordt gebruikt. Plaats de vers gedisseceerde subventriculaire zone van een adult fucci red muizenbrein in een Petrischaal met 0,6% Glucose in PBS en vermaal het weefsel totdat er geen grote stukken meer overblijven. Breng vervolgens alles over in een 15 milliliter buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 times G.

Zodra het weefsel is gepelletteerd, wordt het supernatant weggegooid en het pellet geresuspendeerd. Suspendeer het weefsel in één milliliter voorverwarmde papaïne, aangevuld met 0,01 milligram per milliliter dna.One. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten in een waterbad bij 37 °C.

Centrifugeer vervolgens opnieuw bij 200 ×g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Voeg één milliliter van de voorverwarmde OVO MOID-oplossing toe om de enzymatische digestie te stoppen. Gebruik daarna een P 1000 micropipetpunt om het fijngehakte weefsel tijdens het pipetteren voorzichtig 20 keer op en neer te pipetteren, zodat het mechanisch wordt gedissocieerd tot een enkelcellige suspensie.

Voorkom dat er luchtbellen in het mengsel terechtkomen, omdat dit extra stress voor de cellen zou veroorzaken. Filter de celsuspensie door een steriel filter van 20 micron in een nieuwe buis van 15 milliliter. Spoel het cellenfilter met twee milliliters PBS met 0.15% BSA om celverlies te voorkomen.

Centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 200 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant. Voer de kleuring uit door de cellen van elke muis eerst te suspenderen in 100 µL PBS met 0,15% BSA.

Gebruik één tiende van de cellen van een van de muizen om elk van de vier controles voor te bereiden, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Voeg de hier vermelde primaire antilichamen toe aan elk van de buisjes die worden gebruikt voor cel sortering en incubeer de mengsels gedurende 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius. Was de cellen na incubatie met de primaire antilichamen met één milliliter PBS met 0,15% BS, A, en centrifugeer de cellen vervolgens 10 minuten bij 200 ×g.

Resuspendeer de cellen in 200 µL PBS met 0,15% BSA per brein en breng ze over naar geschikte sorteerbuisjes. Plaats de sorteerbuisjes op ijs en voeg vlak voor het sorteren van de cellen een vitale kleurstof toe, zoals Hoechst 33342 kleuring in een concentratie van 2 µg/mL, om levende van dode cellen te kunnen onderscheiden.

Analyse vervolgens de cellen uit de buis met de negatieve controle in de flowcytometer en selecteer de cellen met behulp van de parameters voor side scatter en forward scatter. Sluit de dode cellen uit door alleen de hooks naar de negatieve fractie te gaten en dubletten door de puls met negatieve fractie te selecteren. Analyseer de enkelkleurcontroles en pas indien nodig de voltages van de fotomultiplicatorbuizen aan.

Voer de kleurcompensatie uit in het compensatievenster van de software. Draai de drie fluorescence minus one-controles en trek de sorteerpoorten. Zodra alle poorten zijn ingesteld, sorteert u de gelabelde cellen direct in 100 µL kweekmedium.

Zaai de vers gesorteerde cellen uit op poly-D-lysin gecoate 96-wells platen met een dichtheid van 1000 tot 3000 cellen per well in 300 µL kweekmedium. Incubeer de kweekplaten gedurende ten minste één uur bij 37 °C en 5% CO2.

Om celadhesie mogelijk te maken, bereidt u een confocale laserscanningsmicroscoop voor op beeldvorming door de bijbehorende temperatuurgecontroleerde kamer voor te verwarmen tot 37 °C onder een 5% koolstofdioxide-atmosfeer. Plaats de 96-wellplaat in de voorverwarmde microscoopkamer en stel de eerste well scherp. Open vervolgens de software voor beeldvorming en klik met de rechtermuisknop in het hoofdvenster om 'acquire acquisition controls' en 'DEAC acquisition' te selecteren.

Om het TI-pad te openen en vervolgens het plan A PO VC 20 XDIC-objectief te selecteren, klikt u op 'acquire acquisition controls' en opent u daarna de time-lapse-opties. Stel het centrum van elke put in als tafelpositie en selecteer de optie voor het grote beeld op 7 by 7 millimeter squared. Bekijk een mozaïekbeeld rond het centrum van elk.

Stel de overlap voor de grote mozaïekafbeelding in op 5% en stel de frequentie zo in dat er gedurende 24 uur elke 20 minuten foto's worden genomen. Selecteer onder de OnePlus-instellingen het voltagesniveau van de fotomultiplicatorbuis voor elke fluorescentie die in de menubalk wordt vermeld. Selecteer de optie om afbeeldingen te verwerven met een high-speed resonantiescanner in een formaat van 512 bij 512 pixels en gebruik DIC om de cellen te visualiseren.

Select vervolgens een map om de gegevensbestanden op te slaan. Selecteer de knop 'run now' in het ND-acquisitievenster om de acquisitie te starten. Volg het werk op de computer gedurende ten minste één cyclus om er zeker van te zijn dat alles correct functioneert.

Fuji-rode muizen werden gebruikt om de G1-fase te volgen met rode fluorescentie middels time-lapse videomicroscopie. De geïsoleerde cellen vertonen rode fluorescentie tijdens de eerste groeifase en verliezen hun kleur tijdens de synthese, de tweede groeifase en mitose. Lex positief eeg FR positief en eeg.

FR-positieve cellen van jonge volwassen en middelouderdom muizen werden geplaatst en gevolgd via microscopie. De lengte van de S- en G2M-fasen vertoonde geen verschil tussen Lex-positieve EGFR-positieve en EG FFR-positieve cellen, noch bij jonge noch bij middelouderdom muizen. De lengte van de daaropvolgende groeifase vanaf de eerste deling tot het moment dat de rode fluorescentie uitschakelt, bleek echter langer te zijn in de oudere cellen als gevolg van de toename in de lengte van de G1-fase.

Neurosferen die vijf dagen na het uitplaten zijn verkregen, zijn kleiner in Lex-positieve EGFR-positieve cellen afkomstig van oudere muizen. Het volledige protocol mag niet meer dan drie uur in beslag nemen voor de dissectie en de fax-preparatie en nog eens drie uur voor het cellsorteren bij het werken met 12 muizen. Houd er rekening mee dat het werken met te veel muizen op dezelfde dag zal leiden tot een langere duur van het cellsorteren, wat mogelijk resulteert in een verhoogde celdood of celdifferentiatie.