Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen

Het algemene doel van deze procedure is om invariante natuurlijke killer T- of INKT-cellen, geoogst uit de milt van een muis, uit te breiden. Dit wordt bereikt door eerst mononucleaire splenische cellen te isoleren, gevolgd door verrijking van de CD vijf positieve lymfocytpopulatie door magnetische celscheiding. De splenische INKT-celfractie wordt vervolgens verder geïsoleerd door middel van door fluorescentie geactiveerde celsortering.

In de laatste stap worden de gesorteerde INKT-cellen voor uitbreiding in vitro geplaatst. Uiteindelijk kan het cytokineprofiel van de uitgebreide INKT-cellen worden beoordeeld door Eliza. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen, aangezien de zuivering en uitbreiding van INKT-cellen de combinatie van verschillende technieken vereist.

Deze procedure zal worden uitgevoerd door een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Na het oogsten van de milt, breng het weefsel over in een 70 micron nylonfilter en gebruik vervolgens de plunjer van een tweeduizend milliliter spuit om de milt voorzichtig door de zeef in een 50 milliliter kegelbuis te persen en was de filter met vijf milliliter PBS. Voeg vervolgens drie milliliter van de koolstofpak aan een 15 milliliter buis toe en leg de dichtheidsgradiënt bovenop de vijf milliliter cellulaire suspensie.

Schei de cellen door centrifugatie en breng het interface over naar een nieuwe 15 milliliter buis. Was vervolgens de cellen in 10 milliliter koud PBS en suspendeer het pellet in twee milliliter faxbuffer om de CD vijf positieve splenische lymfocyten te verrijken. Pas de celdilutie aan tot eenmaal 10 tot de zevende cellen per 90 microliters met meer faxbuffer en voeg 10 microliters anti CD vijf microbeads toe aan de cellen.

Na 15 minuten bij vier graden Celsius, was de cellen met vier milliliter faxbuffer en suspendeer het pellet in 500 microliters verse faxbuffer. Isoleer de CD vijf positieve cellen door magnetische celscheiding volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Verdun vervolgens de verrijkte CD vijf positieve lymfocyten bij eenmaal 10 tot de zesde cellen per 20 microliters inaxbuffer die anti CD 16, CD 32 en PE geconjugeerd alpha gals air CD 1D tetrameer bevat bij kamertemperatuur in het donker na 30 minuten, en incubeer de cellen met de belangrijke antilichamen bij vier graden Celsius in het donker gedurende nog eens 30 minuten.

Was vervolgens de cellen in verse faxbuffer en kleed ze met 10 microliters van een 20 micromolar werkoplossing van DPI per eenmaal 10 tot de zesde cellen gedurende vijf minuten. Verkrijg nu bij kamertemperatuur ongeveer eenmaal 10 tot de vierde verrijkte CD vijf positieve lymfocytgebeurtenissen op de flowcytometer door elektronisch te gaten op de voorwaartse verstrooiing met lage cellen om dubbele cellen en aggregaten elektronisch uit te sluiten. Gate uit de DAPI positieve CD acht positieve CD 19 positieve cellen binnen de voorwaartse verstrooiing met lage populatie en gebruik zijwaartse verstrooiing en voorwaartse verstrooiing gebied plots.

Om de lymfocyten elektronisch te selecteren, plot de alpha gal SER CD 1D tetramers door CD drie epsilon en elektronisch ga de alpha gal ser CD 1D tetramer positieve CD drie epsilon positieve INKT-cellen zoals aangegeven. Verkrijg vervolgens niet meer dan tweemaal 10 tot de vijfde CD vijf positieve verrijkte lymfocyten en bepaal het percentage alpha gal SER CD 1D tetramer positieve CD drie epsilon positieve INKT-cellen dat aanwezig is in de verrijkte cellulaire fractie. Gebruik deze gate om de alpha alser CD 1D tetramer positieve CD drie epsilon positieve INKT-cellen in een faxbuis met één milliliter foetaal kalfsserum te sorteren aan het einde van de sorteerprocedure.

Spoel de geïsoleerde NKT-cellen van de zijkant van de faxbuis af met 10 milliliter RPMI 1640 medium. Spin vervolgens de cellen neer, suspendeer het pellet in één milliliter RPMI 1640 en gebruik een 40 microliter aliquot van de cellen om de zuiverheid van de gesorteerd cellen te beoordelen. Gebruik dezelfde gatingstrategie.

Wat betreft het instellen van de sorteerparameters om de INKT-cellen uit te breiden, spin de cellen neer en suspendeer de geïsoleerde cellen bij vijfmaal 10 tot de vijfde cellen per milliliter in compleet RPMI 1640 medium aangevuld met IL twee IL 12 en anti CD 28. Zaai vervolgens de cellen bij eenmaal 10 tot de vijfde INKT-cellen per putje in een 96-putjes platte bodem anti CD drie epsilon gecoate plaat en incubeer ze bij 37 graden Celsius in een cellencultuurincubator. Na twee dagen, breng de cellen over naar een verse ongecoate platte bodem 96-putjes plaat voor cultuur onder rustomstandigheden in compleet RPMI 1640.

Medium gedurende nog eens twee dagen incubatie. Op de vierde dag na het sorteren, pipetteer voorzichtig het supernatant in elke putje om de cellen los te maken en pool ze in een 15 milliliter kegelbuis. Na centrifugatie, suspendeer het pellet bij vijfmaal 10 tot de vijfde cellen per milliliter.

In compleet RPMI 16 medium aangevuld met IL zeven en zaai eenmaal 10 tot de vijfde cellen per putje. In een nieuwe platte bodem 96-putjes plaat breng de cellen terug naar de incubator na vier dagen, haal ze in een verse 15 milliliter kegelbuis voor centrifugatie. Suspendeer het pellet in compleet RPMI 1640 medium bevattende oplosbaar anti CD 28 en zaai de cellen op een 96-putjes platte bodem plaat gecoat met anti CD drie epsilon bij eenmaal 10 tot de vijfde cellen per putje en breng de cellen terug naar de incubator voor nog eens drie dagen, vier dagen, 11 tot 18.

Herhaal de IL zeven anti CD 28 en anti CD drie epsilon behandeling zoals net gedemonstreerd op dag 19. Breng de cellen over naar een nieuwe 15 milliliter kegelbuis. Spin ze neer en suspendeer het pellet bij vijfmaal 10 tot de vijfde cellen per milliliter in compleet RPMI 1640.Medium.

Zaai vervolgens de cellen bij eenmaal 10 tot de vijfde cellen per putje in een platte bodem 96-putjes plaat en laat de cellen twee dagen rusten in de cellencultuurincubator. Het