Name: Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer een geoptimaliseerde methode voor het isoleren en expanderen van invariante natuurlijke killer T-cellen uit de milt van muizen. Deze techniek combineert magnetische celscheiding en fluorescentie-geactiveerde cel sortering voor efficiënte opbrengst.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.E. en M.B.D. zijn lid van een multidisciplinair onderzoeksplatform (MRP) van de Universiteit Gent, en het consortium van Gentse Onderzoekers over Ontvouwde Eiwitten bij Inflammatoire Ziekten (GROUP-ID).

In deze studie werden volwassen (6-8 weken) vrouwelijke C57BL / 6-muizen gebruikt. Muizen werden gehuisvest en gefokt volgens de richtlijnen van de Universiteit Gent terrarium. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en de ethische commissie. 1. Bereiding van mononucleaire cellen (MNC) van Mouse Spleen <ol><li> Offer de muis door cervicale dislocatie. </li><li> Plaats de muis terug naar beneden op het ontleden bord en bevestig de achterpoten en de voorpoten met pinnen. </li><li> Steriliseer de huid oppervlak met 70% (vol / vol) ethanol / H2O </li><li> Snijd de huid langs de buik middellijn op de thorax en de milt bloot met steriele chirurgische instrumenten. </li><li> Na het trimmen het omringende vetweefsel, plaatst de milt in een 24 wells plaat met 1 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur. </li><li> Ontleden de milt met een steriele scalpel en de overdracht van de stukken in een 70 um nylon filter geplaatst in een 50 ml bade. </li><li> Met behulp van een 2 ml zuiger voorzichtig mash de milt stukken door de cel zeef en was met 5 ml 1x PBS. </li><li> Voeg 3 ml Ficoll-Paque een 15 ml buis en bedekken de dichtheidsgradiënt medium met 5 ml celsuspensie. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur zonder rem. </li><li> Breng de interfase een verse 15 ml buis, voeg 10 ml koud 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen in 2 ml 1 x PBS bevattende 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (FACS-buffer). Breng 10 pl van de celsuspensie aan een buisje, meng met 10 gl 0,4% </li></ol> 2. Verrijking, Detectie en Zuivering van Mouse iNKT Cells <ol><li> Verrijking van muis milt CD5positive (CD5 +) lymfocyten. <ol><li> (Optioneel) Stain 10 5 cellen met FITC-geconjugeerd anti-CD5 (4 pl van 1:30 verdunning / 10 6 cellen)gedurende 30 min bij 4 ° C in het donker, wassen met 200 pi FACS-buffer en resuspendeer in 500 pi FACS-buffer. Bereid een 20 pM werkende oplossing van 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 1x PBS, voeg 1 pl daarvan 10 5 cellen in FACS-buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwerven 10 4 pre-verrijkte cellen op de flowcytometer. <ol><li> Met behulp van FCS-H en FCS-W, elektronisch hek op FSC-W lo cellen naar cel wambuizen en aggregaten (figuur 1A) uit te sluiten. Vervolgens elektronisch hek uit DAPI + (dode) cellen in het FSC-W lo populatie (Figuur 1B), en het gebruik van SSC-A en FCS-A elektronisch selecteer de lymfocytenpopulatie door grootte (figuur 1C). </li><li> Met behulp van cellen binnen de lymfocytpoort, plot SSC-A versus CD5 en elektronisch gate CD5 + lymfocyten zoals getoond in figuur 1D. Het verwerven van de rest van de pre-verrijkte monster op de flowcytometer. </li&gt; </ol></li><li> Pas cel tellingen 10 7 cellen per 90 ul in FACS buffer en voeg 10 ul anti-CD5 microbolletjes. </li><li> Incubeer bij 4 * C gedurende 15 min, eenmaal wassen met 4 ml FACS buffer en resuspendeer in 500 ul koude FACS-buffer. Verrijken CD5 + lymfocyten met behulp van magnetische celscheiding (MACS) kolommen volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Optioneel) Stain 10 5 cellen met FITC-geconjugeerd anti-CD5 (4 pl 1:30 verdunning / 10 6 cellen) en DAPI zoals in 2.1.1. Verwerven 10 4 verrijkt lymfocyten op de flowcytometer en controleer of de elektronische poorten die in 2.1.1. selecteert CD5 + lymfocyten in de verrijkte cellulaire fractie. Verwerven 10 5 cellen op de flowcytometer en analyseren percentage CD5 + lymfocyten in de verrijkte fractie aanwezig zoals getoond in figuur 1E - H. </li></ol></li><li> Detectie en isolatie van de muis iNKT cells door FACS. <ol><li> Resuspendeer verrijkt CD5 + lymfocyten bij een concentratie van ongeveer 10 6 cellen per 20 ul in FACS-buffer bevattende anti-CD16 / CD32 (4 pl 1:50 verdunning / 10 6 cellen) en PE-geconjugeerd αGalCer / CD1d tetrameer (1 ug / 10 6 cellen). </li><li> Incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Verdun muis antilichamen (mAbs) tegen CD3e V500 (4 pl 1:20 verdunning / 10 6 cellen), anti-CD19 E450 (4 pl 1:50 verdunning / 10 6 cellen) en anti-CD8a E450 (4 pl 1:50 verdunning / 10 6 cellen) in FACS buffer, toevoegen CD5 + lymfocyten en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was de cellen met 1 ml FACS buffer door centrifugeren bij 300 g gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in 4 ml FACS-buffer bij een uiteindelijke concentratie van 10 7 cellen / ml. </li><li> Filter de cellen door een 30 um cel zeef en zet de cellen op ijs. </li><li> Kalibreer de flowcytometer voor celsortering volgens de aanbevelingen van de fabrikant 14,15. Opmerking: kalibratie van een flowcytometer voor celsortering vereist training en kan worden uitgevoerd door een ervaren operator, of een vakman. </li><li> Voeg 10 pi van een 20 pM oplossing van werkende DAPI per 10 6 cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwerven ongeveer 10 4 verrijkt CD5 + lymfocyten op de flowcytometer. Elektronisch hek op FSC-W lo cellen naar cel wambuizen en aggregaten (figuur 2A) uit te sluiten. Vervolgens elektronisch gate uit DAPI + CD8 + CD19 + cellen (dump kanaal) binnen de FSC-W lo populatie (Figuur 2B), en gebruik SSC-A en FCS-A elektronisch selecteren lymfocyten (figuur 2C) zoals beschreven in 2.1.1.1 . <ol><li> Perceel αGalCer / CD1d tetrameer door CD3e en elektronisch hek αGalCer / CD1dtetrameer + CD3e + iNKT cellen zoals getoond in figuur 2D. Verwerven niet meer dan 2 x 10 5 CD5 + verrijkte lymfocyten om het percentage te bepalen αGalCer / CD1d tetrameer + CD3e + iNKT cellen aanwezig in de verrijkte cellulaire fractie. </li></ol></li><li> De elektronische poorten die in 2.2.7., FACS sorteren αGalCer / CD1d tetrameer + CD3e + iNKT cellen op de flowcytometer bij 70 psi onder toepassing van een 70 urn mondstuk met een stroomsnelheid van &#39;1,5&#39;. Verzamel gesorteerde iNKT cellen in een FACS buis met 1 ml 100% FCS. Vervolgens reinigen gesorteerd iNKT cellen van de kant van de FACS buis met behulp van 10 ml RMPI 1640 medium en centrifugeer de cellen bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer gesorteerd iNKT cellen in 1 ml RPMI 1640 medium en 40 ul verwerven daarvan op een flowcytometer de zuiverheid van de gesorteerde iNKT cellen te beoordelen. Selecteer FSC-W lo DAPI - lymfocyts zoals beschreven in 2.2.7. (Figuur 2E - G) en elektronisch gate αGalCer / CD1d tetrameer + CD3e + iNKT cellen zoals getoond in figuur 2H. </li></ol></li></ol> 3. Cultuur en uitbreiding van de Muis iNKT Cells Dag 0 <ol><li> Coat een vlakke bodem 96 wells plaat met gezuiverde anti-CD3e (3 ug / ml) per putje gedurende 1 uur bij KT. Tweemaal wassen met 200 pl 1x PBS en een keer met 200 ul compleet RPMI 1640 medium (10% vol / vol FCS, 100 U / ml penicilline-streptomycine, 5,5 uM β-mercaptoethanol). </li><li> Tel het aantal levensvatbare gesorteerd iNKT cellen (stap 2.2.8) met behulp van een hemocytometer 0,4% zoals in 1,11. Gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in 5 x 10 5 cellen / ml in compleet RPMI 1640 medium met recombinant Muis IL-2 (10 ng / ml), recombinant Muis IL-12 (1 ng / ml) en oplosbaar anti-muis CD28 (5 ug / ml). Plaat sorted iNKT cellen op 10 5 cellen / putje anti-CD3e beklede platen en incubeer bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 2 dagen. </li></ol> Dag 2 <ol start="3"><li> Overdracht van de cellen om een nieuwe onbeklede vlakke bodem 96 wells plaat en de cellen te kweken onder rusttoestand in volledig RPMI 1640 medium bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 2 dagen. </li></ol> Dag 4 <ol start="4"><li> Los van de cellen van de plaat door voorzichtig pipetteren en breng de cellen een nieuwe 15 ml buis. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, hersuspenderen in 5 x 10 5 cellen / ml in compleet RPMI 1640 medium met recombinant Muis IL-7 (5 ng / ml), en plaat 10 5 cellen / putje in platte bodem 96 wells plaat gedurende 4 dagen bij 37 ° C in een CO2 incubator. </li></ol> Dag 8 <ol start="5"><li> Verzamel de cellen in een nieuwe buis, centrifuge bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in 5 x 10 5 cellen / ml in compleet RPMI 1640 medium dat oplosbaar anti-CD28 (5 ug / ml). </li><li> Coat een platte bodem 96-well plaat met gezuiverd anti-CD3e (3 ug / ml) per putje en was als in 3.1. Plate 10 5 cellen / putje anti-CD3e beklede platen en incubeer bij 37 ° C in een CO 2-incubator tot 11 dagen. </li></ol> Dag 11-18 <ol start="7"><li> Herhaal de stappen 3,4-3,6. </li></ol> Dag 19-20 <ol start="8"><li> Overdracht van de cellen om een nieuwe 15 ml buis centrifugeer bij 300 xg en resuspendeer in 5 x 10 5 cellen / ml in compleet RPMI 1640 medium. </li><li> Plaat cellen op 10 5 cellen / putje in vlakke-bodem 96 wells plaat en laat de cellen te rusten voor 2 dagen bij 37 ° C in een CO2 incubator voorafgaand aan gebruik bij een experiment. </li></ol> 4. Cytokine productie door Mouse iNKT cellen met behulp van een CD1d Plate-gebonden Assay <ol><li> Coat een vlakke bodem met 96 putjes plaat met 100 gl recombinant Muis CD1d (10 ug / ml in 1 x PBS) per putje en incubeer 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Was vier keer met 200 pl 1x PBS, voeg 200 ul van 2% FCS in 1x PBS (blokkerende oplossing) per putje en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de blokkerende oplossing, voeg 200 pl αGalCer (5 ng / ul) per putje en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 uur. [Voor de bereiding van de αGalCer oplossing, voeg 1.085 μ 1x PBS tot 55 ug αGalCer opgelost in vehikel bevattende 96 mg / ml sucrose, 10 mg / ml natriumdeoxycholaat en 5 mg / ml Tween 20]. </li><li> Na incubatie, gooi de αGalCer oplossing en was het goed tweemaal met 200 ul 1x PBS, gevolgd door 200 ul volledig RPMI 1640 medium. </li><li> Verzamel de in vitro geëxpandeerde iNKT cellen op dag 21, centrifuge de cellen bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in volledige RPMI 1640 medium bij een concentratie van 0,5 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Voeg 200 ul van de iNKT cellen resuspensie per putje en incubeer 72 uur bij 37 ° C in een CO2 incubator. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof en meet cytokines plaats door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol>

<ol><li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells%3A+development%2C+specificity%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li>
<li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li>
<li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1-restricted+CD4%2B+T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li>
<li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li>
<li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease%3A+a+joint+dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity%3A+a+new+immunoregulatory+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li>
<li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li>
<li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li>
<li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li>
<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
<li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li>
<li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+%27real+time%27%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li>
<li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Kritische stappen in het huidige protocol omvat de isolatie en de daaropvolgende verrijking van CD5 + lymfocyten (deel 1 &amp; 2), FACS sorteren (deel 3) en de eerste beplating van iNKT cellen (hoofdstuk 4). Van de stappen in paragraaf 1, vergeet niet om zorgvuldig lagen de milt cellulaire schorsing over de dichtheid gradiënt medium zodanig dat een duidelijke cellulaire tussenfase wordt gegenereerd na centrifugeren. De daaropvolgende verrijking voor CD5 + lymfocyten door magnetische cel scheiding (...

Muizen onveranderlijke natural killer T (iNKT) cellen zijn een afzonderlijke populatie van aangeboren T-lymfocyten geselecteerd in de thymus door-CD1d uiten corticale thymocyten 1,2. iNKT cellen brengen een T cel receptor (TCR) bestaande uit een invariant Vα14 Jα18 TCR-keten gecombineerd met ofwel Vβ8, Vβ7 of Vβ2 TCR 3, dat in staat is te herkennen endogene en buitenlandse lipide antigenen in de context van CD1d. Bijvoorbeeld, muizen iNKT cellen herkennen en worden geactiveerd door een endogene lipiden antigen isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, en α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, een glycolipide geïsoleerd uit mariene sponzen. TCR-activatie van iNKT cellen bevordert priming van adaptieve immuunreacties, en als gevolg daarvan zijn iNKT cellen aangetoond functioneel betrokken bij de verbetering of ontwikkeling van verschillende ziekten waaronder reumatische ziekten en kanker 7 &lt;sup&gt; 8. Momenteel, synthetische iNKT cellen liganden vormen veelbelovende vaccin adjuvantia die kunnen reguleren meerdere immuunpathologische aandoeningen kunnen zijn. Er is eerder aangetoond dat iNKT cellen kunnen worden gegenereerd in vitro na isolering uit muizen weefsel echter; veel van deze studies met het gebruik van primaire antigeen presenterende cellen (APC&#39;s) en / of cellijnen 9, Vα14 TCR transgene (Tg) muizen 10 of thymomen voor het genereren van iNKT cellen afgeleide hybridomen 11,12. Bovendien, grote aantallen muizen, grote hoeveelheden reagentia zoals αGalCer geladen CD1d dimeren en langdurige cultuur tijden maken een aantal gepubliceerde protocollen minder ethisch en economisch aantrekkelijk 9,13. In dit rapport beschrijven we een aangepaste methode voor de isolatie en in vitro expansie van iNKT cellen uit muizen milt. Meer specifiek protocol beschrijft een werkwijzevoor het verrijken van iNKT cellen uit muizen milt waar de muizen, reagentia en tijd vereist voor FACS-celsortering vermindert, en stelt een geoptimaliseerde aanpak voor het uitbreiden gesorteerde milt iNKT cellen in vitro.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>gezuiverd anti-muis CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>gezuiverd anti-muis CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-geconjugeerd anti-muis CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-geconjugeerd anti-muis CD8α (53-6.7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-muis CD5 (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500-geconjugeerd anti-muis CD3ε (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis CD5 (Ly-1) microbeads</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>gezuiverd anti-muis CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw, 0,4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - vrij]</td></tr><tr><td>Fetaal kalfs serum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Rund serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plaat F-bodem</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>24-well plaat</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>6-well plaat</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falconbuis</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falconbuis</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 μm filter</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 μm filter</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Watermantel CO2 incubator</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie Kit</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en expanding invariant natural killer t-cellen van mouse spleen

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

De mogelijkheid om snel cytokinen na stimulatie is een functioneel kenmerk van invariante natuurlijke killercellen (iNKT) cellijn. iNKT cellen worden ook gekenmerkt als een aangeboren T-cel populatie kan activeren en sturen adaptieve immuunreacties. De ontwikkeling van verbeterde technieken voor het kweken van murine en uitbreiding iNKT cellen vergemakkelijkt de studie van iNKT celbiologie in in vitro en in vivo modelsystemen. Hier beschrijven we een optimale procedure voor de isolatie en expansie van muizen milt iNKT cellen. Milt van C57BL / 6 muizen worden verwijderd en ontleed gespannen en de resulterende celsuspensie wordt gelaagd over dichtheidsgradiënt media. Na centrifugatie worden de milt mononucleaire cellen (MNC&#39;s) verzameld en CD5-positieve (CD5 +) lymfocyten worden verrijkt via magnetische partikels. iNKT cellen in de CD5 + fractie worden vervolgens gekleurd met ^5, GalCer-geladen CD1d tetrameer en gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). FACS gesorteerd iNKT cellen worden vervolgens aanvankelijk gekweekt in vitro onder toepassing van een combinatie van recombinant muriene cytokines en plaat-gebonden T-celreceptor (TCR) stimuli voordat uitgebreid in de aanwezigheid van recombinant murine IL-7. Met deze techniek ongeveer 10 8 iNKT cellen kunnen worden gegenereerd binnen 18-20 dagen kweek, waarna ze kunnen worden gebruikt voor functionele assays in vitro of in vivo overdracht experimenten bij muizen.

Isolatie van milt mononucléaire cellen met behulp van een dichtheidsgradiënt duurt ongeveer 1 uur en elimineert het gebruik van de reagentia nodig om rode bloedcellen (RBCs) te lyseren. Een hoge opbrengst van levensvatbare cellen wordt zo verkregen en puin ontstaat tijdens het uitpersen van het orgaan verwijderd. Typisch, de frequentie van iNKT cellen in de milt lymfocyten pool varieert tussen 1 en 5% van de totale T-lymfocyten maar dit kan variëren afhankelijk van de leeftijd, het geslacht en de gezondheid van de diere...

Hier presenteren we een aangepast protocol dat kan worden gebruikt om een groot aantal muisinvariante natuurlijke killer-T-cellen uit de muizenmilt te genereren. Het protocol schetst een benadering waarmee splenkachtige iNKT-cellen kunnen worden verrijkt, geïsoleerd en in vitro uitgebreid met behulp van een beperkt aantal dieren en reagentia.

Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Het algemene doel van deze procedure is het expanderen van invariant natural killer T-cellen of INKT-cellen geoogst uit de milt van een muis. Dit wordt bereikt door eerst splenische mononucleaire cellen te isoleren, gevolgd door verrijking van de CD5-positieve lymfocytenpopulatie middels magnetische celseparatie. De splenische INKT-cellenfractie wordt vervolgens verder geïsoleerd door middel van fluorescence-activated cell sorting.In de laatste stap worden de gesorteerde iNKT-cellen klaargezet voor expansie in vitro. Uiteindelijk kan het cytokineprofiel van de geëxpandeerde iNKT-cellen worden beoordeeld via ELISA. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien de zuivering en expansie van iNKT-cellen de combinatie van verschillende technieken vereist.Deze procedure zal worden uitgevoerd door een promovendus uit mijn laboratorium. Na het oogsten van de milt wordt het weefsel overgebracht naar een nylon filter van 70 micron; gebruik vervolgens de zuiger van een spuit van twee milliliter om de milt voorzichtig door de zeef in een conische buis van 50 milliliter te persen en spoel het filter met vijf milliliter PBS. Voeg daarna drie milliliter van de coal pack toe aan een buis van 15 milliliter en breng de vijf milliliter cel-suspensie aan als laag over de dichtheidsgradiënt.Scheid de cellen door middel van centrifugatie en breng de interface over naar een nieuwe buis van 15 milliliter. Was de cellen vervolgens in 10 milliliters koud PBS en resuspendeer de pellet in twee milliliters fax-buffer om de CD5-positieve miltlymfocyten te verrijken. Pas de celdilutie aan naar 1 × 10⁷ cellen per 90 µL met extra fax-buffer en voeg 10 µL anti-CD5 microbeads toe aan de cellen.Na 15 minuten bij 4 °C worden de cellen gewassen met 4 mL FACS-buffer en wordt het pellet改めて gesuspendeerd in 500 µL verse FACS-buffer. Isoleer de CD5-positieve cellen via magnetische celseparatie volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Verdun vervolgens de verrijkte CD5-positieve lymfocyten tot 1 × 10⁶ cellen per 20 µL FACS-buffer bevattend anti-CD16, CD32 en PE-geconjugeerd alpha-gal-restricted CD1D-tetrameer bij kamertemperatuur in het donker. Incubeer de cellen na 30 minuten nog eens 30 minuten met de relevante antilichamen bij 4 °C in het donker.Was de cellen vervolgens in verse fax-buffer en kleur ze gedurende vijf minuten met 10 µL van een werkoplossing van 20 µM DPI per 1 × 10⁶ cellen. Neem nu bij kamertemperatuur ongeveer 1 × 10⁴ verrijkte CD5-positieve lymfocyten-events op de flowcytometer op, waarbij elektronisch wordt gegatet op de forward scatter met low cells om cel-doubletten en aggregaten elektronisch uit te sluiten. Gate de DAPI-positieve, CD8-positieve en CD19-positieve cellen uit binnen de forward scatter with low populatie en gebruik side scatter en forward scatter area plots.Om de lymfocyten elektronisch te selecteren, worden de alpha gal SER CD 1D-tetrameren uitgezet tegen CD three epsilon en worden de alpha gal ser CD 1D-tetrameer-positieve CD three epsilon-positieve iNKT-cellen elektronisch gegated zoals aangegeven. Bepaal vervolgens het percentage alpha gal SER CD 1D-tetrameer-positieve CD three epsilon-positieve iNKT-cellen in de verrijkte cellulaire fractie door niet meer dan 2 × 10⁵ CD five-positieve verrijkte lymfocyten te acquireren. Sorteer met behulp van deze gate de alpha alser CD 1D-tetrameer-positieve CD three epsilon-positieve iNKT-cellen aan het einde van de sortering in een FACS-buis met 1 mL foetaal kalfsserum.Spoel de geïsoleerde NKT-cellen aan de zijkant van de fax-buis af met 10 milliliter RPMI 1640-medium. Centrifugeer vervolgens de cellen, resuspendeer het pellet in één milliliter RPMI 1640 en gebruik een aliquot van 40 microliter van de cellen om de zuiverheid van de gesorteerde cellen te beoordelen, met gebruik van dezelfde gating-strategie.Wat betreft het instellen van de sorteerparameters voor de expansie van de iNKT-cellen: centrifugeer de cellen en resuspendeer de geïsoleerde cellen in een concentratie van 5 × 10⁵ cellen per milliliter in compleet RPMI 1640-medium aangevuld met IL-2, IL-12 en anti-CD28. Zaai vervolgens de cellen uit met 1 × 10⁵ iNKT-cellen per well in een 96-well flat-bottom plaat die is gecoat met anti-CD3ε en incubeer deze bij 37 °C in een celkweekincubator. Breng de cellen na twee dagen over naar een nieuwe, ongecoate flat-bottom 96-well plaat voor kweek onder rustcondities in compleet RPMI 1640.Medium voor nog eens twee dagen incubatie. Op de vierde dag na sortering wordt het supernatant in elke well voorzichtig gepipetteerd om de cellen los te maken, waarna deze worden samengevoegd in een conische buis van 15 milliliter. Na centrifugatie wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd op vijf keer 10⁵ cellen per milliliter.In compleet RPMI 1640 medium aangevuld met IL-7 en zaai 1 × 10⁵ cellen per well. In een nieuwe 96-well plaat met platte bodem worden de cellen teruggeplaatst in de incubator. Na vier dagen worden ze overgebracht naar een nieuwe conische buis van 15 ml voor centrifugatie. Resuspendeer het pellet in compleet RPMI 1640 medium dat oplosbaar anti-CD28 bevat en zaai de cellen op een 96-well plaat met platte bodem, gecoat met anti-CD3ε, tegen een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per well. Plaats de cellen opnieuw in de incubator voor nog eens drie dagen, vier dagen, 11 tot 18.Herhaal de behandeling met IL-7, anti-CD28 en anti-CD3 epsilon zoals zojuist gedemonstreerd op dag 19. Breng de cellen over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer ze en resuspendeer het pellet op 5 × 10⁵ cellen per milliliter in compleet RPMI 1640-medium.Zaai de cellen vervolgens uit met een dichtheid van 1 x 10⁵ cellen per putje in een 96-wells plaat met een platte bodem en laat de cellen twee dagen rusten in de celkweekincubator. Stimulatie van gesorteerde iNKT-cellen met plaatgebonden anti-CD3ε in aanwezigheid van IL-2, IL-12 en oplosbaar anti-CD28 resulteert in een ongeveer drievoudige expansie van het aantal iNKT-cellen na twee dagen kweek. Verdere expansie van de iNKT-cellen in aanwezigheid van IL-7 resulteert in een drie tot viervoudige toename van het aantal aanwezige iNKT-cellen op dag vier van de kweek.Opvallend is dat het herhalen van deze kweekcondities gemiddeld zeven keer 10⁷ iNKT-cellen kan opleveren na twee expansierondes, zonder zichtbaar celverlies tussen de wissels van het kweekmedium op verschillende dagen, wat resulteert in een expansie van ten minste 70-voudig in 18 dagen. Verder geëxpandeerde iNKT-cellen die geactiveerd zijn met plaatgebonden recombinant muis CD1d geladen met α-GalCer produceren IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α en IL-6 gedurende 48 uur na stimulatie, wat aantoont dat de iNKT-cellen hun vermogen om Th1- en Th2-cytokinen te produceren behouden na expansie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de juiste kleuring van iNKT-cellen met alfa-ceramide-geladen cdre essentieel is voor de identificatie van de iNKT-cellen tijdens flowcytometrie.

an-optimized-method-for-isolating-expanding-invariant-natural-killer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes T-cells enrichment from the spleen of a mouse by negative selection using a magnetic separator. The technique involves targeting the other cells in the sample for depletion using antibodies or ligands directed against specific cell surface antigens.

T-Cell Enrichment: A Technique to Isolate T-Cells from Mixed Cell Population by Magnetic Separation

This video demonstrates the isolation of lymphocytes, including natural killer cells or NK cells, from human liver tissue for selective expansion. Enzymatic and mechanical digestion, followed by density gradient separation, promotes lymphocyte isolation, including NK cells. The collected lymphocytes can be further used for the selective expansion of NK cells.

Natural Killer Cell Isolation from Liver Tissue for Selective Expansion

This video describes a protocol for isolating rare-antigen-specific CD8+ T cells using magnetic nanoparticle-based artificial antigen-presenting cells (aAPCs) functionalized with antigenic peptide-loaded MHC-Igs and anti-CD28 antibodies. Interaction of the aAPCs with CD8+ T cells specifically expressing the antigenic peptide-targeting T cell receptors, followed by their expansion in vitro, results in the enrichment and expansion of this CD8+ T cell population.

Nanoparticle-Based Enrichment and Expansion of Antigen-Specific CD8+ T Cells

This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

This video illustrates a method for isolating invariant natural killer T cells, also known as iNKT cells. The procedure begins with injecting a synthetic glycolipid into a mouse to stimulate the activation and proliferation of iNKT cells in the spleen. Subsequently, single-cell suspensions are prepared from the spleen and incubated with iNKT-cell-recognizing complexes labeled with fluorophores, followed by magnetic bead-based separation, to isolate the iNKT cells.

Isolating Invariant Natural Killer T Cells from a Mouse Model

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Hier presenteren we een protocol waarin wordt beschreven van Allogene hematopoietische stamceltransplantatie en repetitieve mini-Endoscopische evaluaties van de distale dubbelpunt ter plaatse voor de aanwezigheid, de kenmerken en de ernst van Colon ontsteking binnen live kunt muizen intestinale graft - versus - host-ziekte lijden.

Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

We beschrijven een snel en robuust protocol om invariante natural killer T (iNKT) cellen uit muizen milt te verrijken en in vitro uit te breiden tot geschikte aantallen voor in vitro en in vivo studies.

Zuivering en uitbreiding van muisinvariante Natural Killer T-cellen voor in vitro en in vivo studies

Hier presenteren we een methode om perifere bloed natural killer (PBNK), NK-cellen uit leverweefsels en chimere antigeenreceptor (CAR) -NK-cellen afgeleid van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) of navelstrengbloed (CB) uit te breiden. Dit protocol demonstreert de uitbreiding van NK- en CAR-NK-cellen met behulp van 221-mIL-21-feedercellen naast de geoptimaliseerde zuiverheid van geëxpandeerde NK-cellen.

Natural Killer (NK) en CAR-NK-celuitbreidingsmethode met behulp van membraangebonden-IL-21-gemodificeerde B-cellijn

Leer een geoptimaliseerde methode voor het isoleren en expanderen van invariante natuurlijke killer T-cellen uit de milt van muizen. Deze techniek combineert magnetische celscheiding en fluorescentie-geactiveerde cel sortering voor efficiënte opbrengst.

Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen

Meer video's verkennen