Spatiotemporele Mapping van Motiliteit in

De algemene doelen voor het creëren van een uitgebreide spatiotemporele kaart van ex vivo darmen zijn het bestuderen van de respons op luminale inhoud door de gedetailleerde beweging van de darmwand gedurende een volledig segment te observeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat activiteit binnen verschillende regio's van hetzelfde weefselsegment in ruimte en tijd kan worden geregistreerd en vergeleken, waardoor complexe motiliteitspatronen kunnen worden geïdentificeerd in plaats van enkel eenvoudige contractie of relaxatie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de normale darmmotiliteit, kan deze ook worden toegepast voor de identificatie van effecten van diverse geneesmiddelen en intraluminale agentia, zoals nutriënten of motiliteitspatronen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat spatiotemporele kaarten in het begin moeilijk te interpreteren kunnen zijn. Na verloop van tijd kan men echter complexe patronen in één oogopslag onderscheiden. Begin met het verwijderen van de dikke darm of dunne darm uit een geëuthanaseerd cavia.

Zet het vast in warme Krebs-oplossing. Verwijder in de dissectieschaal alle intraluminale inhoud door voorzichtig Krebs-buffer door het lumen te perfunderen. Gebruik een spuit met een stomp-uiteinde katheter en voorkom overmatige distensie van het colonsegment tijdens de perfusie.

Bevestig vervolgens twee stukjes polyethyleenslang van drie millimeter lang aan twee vuurgepolijste glazen katheters met een diameter van drie millimeter. Plaats in een verwarmde dissectieschaal één katheter in het orale uiteinde van het weefselpreparaat en knoop een hechtdraad achter het kleine stukje slang rondom de katheter met een chirurgische knoop. Probeer de katheter voorzichtig terug te trekken om er zeker van te zijn dat de knoop strak zit.

Het kleine stukje polyethyleenslang voorkomt dat de hechting wegglijdt. Herhaal dit proces met de andere katheter aan het aborale uiteinde van het weefsel. Verwijder vervolgens het mesenterium uit de weefselpreparaat.

Nadat beide katheters zijn vastgezet, wordt de preparatie vanuit de dissectieschaal overgebracht naar een van de GIMM-orgaanbaden en wordt het weefsel zo gepositioneerd dat het orale uiteinde van de gebruiker af is gericht. Bevestig vervolgens de glazen buiskatheters aan het orgaanbad met behulp van boetseerklei door het uiteinde van de glazen buis aan de zijkant van het bad te bevestigen, of gebruik plastic klemmen om de katheters te bevestigen aan de palen boven het bad die worden gebruikt om de camera's vast te zetten. Bevestig nu een stukje slang van vijf centimeter aan het open uiteinde van elke katheter.

Sluit voor de orale katheter het korte stukje slang aan op een langer stuk slang met een luer-lockkoppeling. Sluit vervolgens de spuit van vijf milliliter aan op de luer-lockverbinding. Deze zal worden gebruikt om buffer in de weefselpreparatie te injecteren.

Gebruik voor de aborale katheter de slang om de luminale uitstroom naar een opvangbak te leiden. Spoel het weefsel nu langzaam met verwarmde Krebs-buffer met behulp van de bijgevoegde spuit om te controleren of er een goede doorstroming is, wat zichtbaar is aan de vloeistof die uit de aborale katheter komt. Kalibreer vervolgens het videoregistratiesysteem terwijl het weefsel 30 minuten lang equilibreert.

Kalibreer de hoogteplaatsing van de camera, de video-instellingen voor helderheid en contrast en de horizontale afstand met de GIMM-software. Klik op het experimenttabblad voor de camera die gekalibreerd moet worden. Klik vervolgens in het bestandmenu op Kalibreren.

Zodra de video verschijnt in het venster voor het kalibreren van het werkstation, stelt u de camera in op een hoogte waarbij het beeld de uiteinden van de katheters bevat die in het colont lumen zijn ingebracht. Kalibreer vervolgens de horizontale afstand die in het beeld op het scherm wordt weergegeven met de doorschijnende liniaalsticker die op elk bad is bevestigd. Stel in hetzelfde venster voor het kalibreren van het werkstation de rode verticale richtlijnen zo in dat ze 10 millimeter uit elkaar staan.

Typ vervolgens deze afstand in het venster van de afstandscursor en klik op de Cal-knop. Stel daarna de schuifregelaars voor gain, helderheid en sluiter in het kalibratiewerkstationvenster zo in dat het weefselsegment verschijnt als een donker silhouet op een lichte achtergrond. Pas vervolgens de focus- en diafragmaknoppen op de camera zelf aan om het beeld verder te verbeteren.

Om de beeldkalibratie te voltooien, klikt u op Save en vervolgens op Yes in het pop-upvenster. Klik ten slotte op Exit. Begin het experiment na de equilibratieperiode van een half uur.

Begin met het benoemen van de experimentele proef. Occludeer vervolgens het lumen van de slang die uit de aborale katheter steekt met de plastic klem. Injecteer daarna ongeveer 7 milliliters Krebs-buffer in het proximale colum lumen.

Het doel is om voldoende distensie te verkrijgen om propulsieve contracties te initiëren. Zodra het segment is gedistendeerd door luminale vloeistof, start u de video-opname. Dubbelklik in de software op de benoemde trial om het experimentele camerabeeld te openen en zet vervolgens de schakelaar op de aan-positie om het cameraveld te bekijken.

Verzamel videodata van een vooraf bepaalde lengte. Aan het einde van deze eerste gecontroleerde distensieproef wordt de klem losgelaten of verwijderd, zodat het weefselsegment de distenderende vloeistof uit het lumen kan stuwen. Laat het weefsel 10 tot 20 minuten re-equilibreren en herhaal vervolgens de procedure met de behandeling.

Een enkele weefselpreparaat kan tot vijf behandelingen van 10 minuten ondergaan, mits er passende rustperioden tussen de testen worden inelast. Let op slijmvliesafstoting, wat wijst op degradatie van het weefsel. Om de opname te analyseren, dubbelklikt u op de naam van een specifieke trial om het analysevenster te openen voor de constructie van een ST-kaart.

Pas in het videoweergavegebied de schuifregelaars voor contrast en helderheid aan om het beeld geschikt te maken voor analyse. Creëer een zwart weefselsilhouet op een lichte achtergrond. Stel vervolgens de horizontale en verticale rode richtlijnen in het videobeeldscherm in om het weefselgebied voor analyse te isoleren en gebieden met artefacten te verwijderen.

Stel vervolgens de analysetijd in. Klik op de groene A-knop om het startpunt te selecteren en klik op de gele B-knop voor het stoppunt wanneer de tijdschuifregelaars in de juiste posities staan. Selecteer daarna het tabblad Motor Analysis om het ST-kaartvenster te openen en klik vervolgens op de stopwatchknop.

Begin de generatie van de ST-kaart door met de kruisdraadcursor binnen het zwarte silhouet van het weefsel te klikken. De generatie van de kaart kan enkele minuten duren. Nadat de ST-kaart is opgebouwd, selecteert u de zoomfunctie om het beeld te vergroten.

Select vervolgens de kleuroptie om de afbeelding in kleur in plaats van in grijstinten te bekijken. Selecteer daarna 'inschakelen' zodat de cursor kan worden gebruikt om de pixel voor analyse te selecteren. Voor het weefsel dat geassocieerd is met de geselecteerde pixels wordt de verandering in luminale diameter in de loop van de tijd geanalyseerd en weergegeven als een tracing van de korreldiameter rechts van de ST-kaart.

Select na de analyses Exit. Exporteer nu de ST-kaart voor andere doeleinden door File en vervolgens Export Data en daarna Metafile te selecteren. Geef het bestand een naam en sla het op als een emf-bestand door op Save te klikken.

De kaarten die met deze techniek worden gegenereerd, tonen veranderingen in de luminale diameter van het weefsel, zowel in afstand als in tijd. De horizontale afstand bevindt zich op de X-as en de tijd op de Y-as, waarbij de starttijd bovenaan staat en de eindtijd onderaan. In de rechterbovenhoek bevindt zich een legenda, waarin de minimale en maximale luminale diameters worden weergegeven, evenals de schaalverdeling voor zowel de X- als de Y-as.

Hierdoor komen verschillende pixeltinten binnen de grijswaardenafbeelding overeen met verschillende luminale diameters. Donkerdere pixels komen overeen met grotere diameters en lichtere pixels met kleinere diameters. Contractiele golven van de circulaire spier zullen verschijnen als regio's met lichtere pixelvorming vanwege de afname van de luminale diameter.

In tegenstelling hiermee wordt luminale uitzetting als gevolg van relaxatie van de ringvormige spieren of een grote vloeistofbolus weergegeven met donkere pixels. Naast golven van een voortplantende contractie kan ook het mengmotiliteitspatroon, bekend als segmentatie, worden gevisualiseerd. Kleine stationaire contracties treden gelijktijdig op in verschillende gebieden.

Na verloop van tijd bewegen deze kleine contracties zich richting het aborale anale uiteinde. Mesenterium dat op het weefsel achterblijft kan artefacten veroorzaken, die zichtbaar zijn als donkere verticale lijnen. De horizontale beweging van deze artefactuele verticale lijnen kan worden gebruikt om de timing van de beweging van de longitudinale spieren te bepalen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u darmsegmenten voorbereidt voor videoregistratie en hoe u de daaropvolgende weergave van darmmotiliteit als spatiotemporele kaarten genereert. Door deze procedure te volgen, kunnen verschillende nutriënten aan de luminale oplossing worden toegevoegd om te bepalen hoe natuurlijke componenten specifieke motiliteitspatronen induceren om spijsvertering en absorptie te vergemakkelijken. Het gebruik van specifieke farmacologische agonisten of antagonisten van receptoren voor neurale humorale agentia kan worden ingezet om de mechanismen te bepalen waarmee motiliteit wordt geïnitieerd en voortgeplant.

Deze techniek zou kunnen helpen bij het genereren van gegevens die nuttig zijn voor het bepalen van verbindingen voor de behandeling van motiliteitsstoornissen.