-Bakkebaard gesignaleerd Eyeblink klassieke conditionering in-Head vaste Muizen

Het algemene doel van dit protocol is om genetische vooruitgang bij muizen, en ons begrip van het snorhaarsysteem, te gebruiken om de neurobiologische basis van ooglimberoep te onderzoeken, een vertaalbaar paradigma voor het bestuderen van leren en geheugen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van mechanistische vragen over leren en geheugen door calciumbeeldvorming en elektrofysiologie te gebruiken bij genetisch gemanipuleerde muizen terwijl specifieke snorharen worden gestimuleerd tijdens conditionering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om de hoofden van muizen vast te zetten terwijl stress wordt geminimaliseerd, door de muizen toe te staan ​​op hun eigen tempo te lopen op een cilindrische loopband.

De implicaties van deze techniek reiken tot mogelijke behandelingen voor geheugenstoornissen, inclusief die geassocieerd met normaal ouder worden en de ziekte van Alzheimer. De voorbereiding van de cilinder en het snorhaarstimulatiesysteem worden elk behandeld in het tekstprotocol. Deze sectie behandelt de voorbereiding van de hoofdband.

De hoofdbandstrook is een 3D-geprinte strip met zeven gaten, gemodelleerd naar de Amphenol 221-serie nylonstrook die niet langer commercieel wordt vervaardigd. Van het 3D-gedrukte stuk, tik het eerste gat in de strip voor 0-80 door een inch machineschroef en laat één gat leeg na het eerste gat. Plaats vervolgens, met behulp van een tang, vijf vergulde pinnen in de resterende vijf gaten.

Duw de pinnen door de smallere gaten in het plastic. Gebruik vervolgens een thermische strip om een halve centimeter polyimidecoating te verwijderen. Soldeer vervolgens het ontmantelde uiteinde op een van de pinnen waar de pin een opening heeft.

Snijd de gesoldeerde draad tussen zes en zeven millimeter en verwijder ongeveer twee millimeter van de draad. Herhaal dit proces nu om in totaal vier draden aan de vijf pinnen te bevestigen. De eerste twee draden registreren EMG-reacties van de oogleden, terwijl de tweede twee elektrische stimulatie leveren aan de periorbiale regio.

Soldeer aan de vijfde pin een ongeïsoleerde vijf centimeter roestvrijstalen draad om als elektrische aarding te dienen. Controleer na het maken van alle verbindingen elk ervan met een multimeter om hun elektrische continuïteit te garanderen. Begin met een volledig verdoofd dier, bevestigd door een teenprik.

Injecteer een dosis buprenorfinehydrochloride als pijnstiller. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid oogzalf aan op de hoornvliezen en scheer de bovenkant van het hoofd van het dier. Bevestig vervolgens het hoofd van het dier aan een stereotactisch frame en desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende scrubs van povidonjodium en alcohol.

Maak met een nummer 10 of 15 scalpelmes een incisie langs de middenlijn van de hoofdhuid, waardoor de schedel wordt blootgelegd vanaf de voorkant van de ogen tot voorbij het interparietale bot. Trek de flappen van de huid terug met zes microclips, waardoor zoveel mogelijk van de schedel wordt blootgelegd, inclusief de zijden en achterkant. Gebruik vervolgens het scalpel om het periosteum van de schedel te schrabben.

Reinig vervolgens de bovenkant van de schedel met 3% waterstofperoxide drie keer. Zodra de schedel is opgedroogd, boor twee gaten met een formaat 34 omgekeerde kegelboor, wees voorzichtig om de hersenen niet te beschadigen. Plaats een gat voor bregma en plaats het andere gat voor lambda, links van de middenlijn bij het conditioneren van het rechteroog, of vice versa.

Deze gaten moeten voorzichtig worden geboord om de schroeven te passen, en er moet veel moeite worden gedaan om de hersenen niet te beschadigen. Plaats in de gaten schroeven voor de elektrische verbindingen. Elke volledige omwenteling zal de schroef 0,28 millimeter verlagen, dus twee volledige omwentelingen zijn voldoende.

Maak vervolgens verschillende kleine kuiltjes op de schedel om het oppervlak voor het cement te vergroten. Wind vanaf de voltooide hoofdband de aardedraad in een figuur acht-configuratie rond de twee schroeven. Laat wat losheid in de aardedraad zodat de hoofdband goed kan worden gepositioneerd.

Breng nu koud lijmcement aan. Bekleed de schedel en de schroeven royaal en laat het cement drogen. Zodra het cement is opgedroogd, plaats de hoofdband verticaal, met de pinnen boven de schedel omhoog staand.

Bevestig de hoofdband met een houder die aan een arm van het frame is bevestigd. De houder moet vijf vergulde houders hebben om de pinnen van de hoofdband te accepteren. Plaats de twee EMG-draden op de muscularis orbicularis oculi boven de oogkas.

Plaats vervolgens de twee stimulerende draden. Plaats de ontmantelde uiteinden onder de huid twee tot vier millimeter direct caudaal van het oog. Laat hun uiteinden elkaar niet raken.

Als de draden zo lang zijn dat ze het oog van het dier kunnen krassen, knip ze dan terug of buig ze terug. Er moet wat blote draad zichtbaar blijven. Cementeer nu de basis van de draden aan de schedel met wat meer lijmcement en laat het drogen.

Gebruik ongeveer de helft van het eerder gebruikte volume. Verwijder vervolgens de microclips en positioneer de huid opnieuw. Laat de huid op natuurlijke wijze bezinken om spanning op de huid te voorkomen die het ooglid zou remmen en dus het experiment zou verpesten.

Zodra de huid is bezonken, verwijdert u de hoofdbandhouder en verzegelt u het blootgestelde gebied met tandcement. Vermijd het druppelen van cement op de ogen of de pinnen van de hoofdband. Gebruik vervolgens een wattenstaafje dat is bevochtigd met tandcementoplosmiddel om gedeeltelijk uitgehard cement glad te maken en te manipuleren zoals nodig.

Zodra het cement volledig is opgedroogd, verwijdert u het dier uit het stereotactisch frame en laat het herstellen op een warm oppervlak voordat u het terugbrengt naar zijn kooigebied. Begin met het wennen van muizen nadat ze minstens vijf dagen hersteltijd hebben gehad. Om de muis vast te zetten, houdt u deze kort vast aan de staart om achter de schouders te knijpen.

Til vervolgens de muis op van on