-Bakkebaard gesignaleerd Eyeblink klassieke conditionering in-Head vaste Muizen

Het algemene doel van dit protocol is om genetische vorderingen bij muizen en onze kennis van het snuifhaarsysteem te gebruiken om de neurobiologische basis van oogknippconditioning te onderzoeken, een vertaalbaar paradigma voor het bestuderen van leren en geheugen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van mechanistische vragen over leren en geheugen door calcium-imaging en elektrofysiologie toe te passen bij genetisch gemanipuleerde muizen, terwijl specifieke snuifharen worden gestimuleerd tijdens de conditioning. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om de koppen van de muizen te fixeren terwijl stress wordt geminimaliseerd, door de muizen hun eigen tempo te laten bepalen op een cilindrische loopband.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot potentiële behandelingen voor geheugenstoornissen, waaronder die geassocieerd met normaal ouder worden en de ziekte van Alzheimer. De voorbereiding van de cilinder en het systeem voor snorstimulatie worden elk behandeld in het tekstprotocol. Deze sectie behandelt de voorbereiding van het hoofdpunt.

De strip van het hoofdstuk is een 3D-geprinte strip met zeven gaten, gemodelleerd naar de nylon strip uit de Amphenol 221-serie die commercieel niet meer wordt geproduceerd. Tap in het 3D-geprinte onderdeel het eerste gat in de strip aan voor een 0-80 by one inch machineschroef en laat één gat na het eerste gat leeg. Plaats vervolgens met behulp van een bankschroef vijf vergulde pinnen in de resterende vijf gaten.

Duw de pinnen door de smallere gaten in het plastic. Strip vervolgens met een thermische stripper een halve centimeter van de polyimidecoating. Soldeer daarna het gestripte uiteinde aan een van de pinnen op de plek waar de pin een opening heeft.

Knip de gesoldeerde draad af op een lengte tussen zes en zeven millimeter en strip ongeveer twee millimeter van de draad. Herhaal dit proces nu om in totaal vier draden aan de vijf pinnen te bevestigen. De eerste twee draden zullen de EMG-responsen van het ooglid registreren, terwijl de tweede twee elektrische stimulatie aan het periorbitale gebied zullen toedienen.

Soldeer aan de vijfde pin een ongeïsoleerd roestvrijstalen draadje van vijf centimeter om als elektrische aarding te dienen. Controleer na het maken van alle verbindingen elke verbinding met een multimeter om de elektrische continuïteit te bevestigen. Begin met een volledig geanestheseerd dier, bevestigd door een knijptest in de teen.

Injecteer een dosis buprenorfinehydrochloride als analgeticum. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid oogzalf aan op de hoornvliezen en scheer de bovenkant van de kop van het dier. Zet daarna de kop van het dier vast in een stereotaxisch frame en desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende spoelingen van povidonjodium en alcohol.

Maak met een scalpelblad nummer 10 of 15 een incisie langs de middellijn van de hoofdhuid, waarbij de schedel wordt blootgelegd vanaf de voorkant van de ogen tot voorbij het interpariëtaalbeend. Trek de huidflappen terug met zes microclips om zoveel mogelijk van de schedel bloot te leggen, inclusief de zijkanten en de achterkant. Gebruik vervolgens de scalpel om het periosteum van de schedel af te schrapen.

Reinig vervolgens de bovenkant van de schedel drie keer met 3% waterstofperoxide. Zodra de schedel is gedroogd, boort u twee gaten met een omgekeerde conische boor maat 34, waarbij u er nauwkeurig op let het brein niet te beschadigen. Plaats één gat vóór bregma en het andere gat vóór lambda, links van de middellijn bij conditionering van het rechteroog, of vice versa.

Deze gaten moeten zorgvuldig worden geboord zodat ze op de schroeven passen, en er moet grote zorg worden betracht om het brein niet te beschadigen. Plaats in de gaten schroeven voor de elektrische verbindingen. Elke volledige slag verlaagt de schroef met 0,28 millimeters, dus twee volledige slagen zijn voldoende.

Maak vervolgens enkele kleine inkepingen in de schedel om het oppervlak voor het cement te vergroten. Wikkel bij het voltooide hoofdstuk de aardingsdraad in een achtvormige configuratie rond de twee schroeven. Laat wat speling in de aardingsdraad zodat het hoofdstuk correct gepositioneerd kan worden.

Breng nu koude lutingcement aan. Bedek de schedel en de schroeven ruimvuldig en laat het cement drogen. Zodra het cement is gedroogd, wordt het hoofdstuk verticaal geplaatst, waarbij de pinnen boven de schedel uitsteken.

Bevestig het hoofdstuk met een houder die aan een arm van het frame is bevestigd. De houder moet vijf vergulde sockets hebben om de pinnen van het hoofdstuk op te nemen. Positioneer de twee EMG-draden op de muscularis orbicularis oculi boven de oogkas.

Positioneer vervolgens de twee stimulatiedraden. Plaats de gestripte uiteinden onder de huid, twee tot vier millimeter direct caudaal ten opzichte van het oog. Zorg ervoor dat de uiteinden elkaar niet raken.

Als de draden zo lang zijn dat ze het oog van het dier kunnen beschadigen, kort ze dan in of buig ze terug. Een deel van de onbedekte draad moet zichtbaar blijven. Fixeer nu de basis van de draden aan de schedel met nog wat lutingcement en laat dit drogen.

Gebruik ongeveer de helft van het volume dat voorheen werd gebruikt. Verwijder vervolgens de microclips en positioneer de huid opnieuw. Laat de huid zich natuurlijk settelen om spanning op de huid te voorkomen, aangezien dit het ooglid zou vervormen, het knipperen zou belemmeren en zo het experiment zou verpesten.

Zodra de huid is gestabiliseerd, verwijdert u de houder van het hoofdstuk en verzegelt u het blootgestelde gebied met tandheelkundig cement. Voorkom dat er cement op de ogen of op de pinnen van het hoofdstuk druppelt. Gebruik vervolgens een wattenstaafje dat is bevochtigd met oplosmiddel voor tandheelkundig cement om gedeeltelijk uitgehard cement naar behoefte glad te strijken en te manipuleren.

Zodra het cement volledig is opgedroogd, wordt het dier uit het stereotaxische frame gehaald en mag het herstellen op een warm oppervlak voordat het wordt teruggeplaatst in de thuiskooi. Start de habituatie van de muizen nadat zij ten minste vijf dagen hersteltijd hebben gehad. Om de muis te fixeren, wordt deze kortstondig bij de staart vastgegrepen om hem achter de schouders vast te klemmen.

Til de muis vervolgens op bij de buik en de romp. Bevestig daarna een connector aan het hoofdstuk en draai de borgschroef vast. Plaats de muis vervolgens voorzichtig op de cilinder en houd deze stil terwijl u twee schroeven gebruikt om de connector aan de stangen boven de cilinder te bevestigen.

Laat de muis vervolgens vrij. Laat de muis tijdens de eerste twee sessies gewennen aan de cilinder gedurende dezelfde tijdsduur als een conditioneringssessie. Registreer tijdens de gewenning de spontane knipperfrequentie.

Stel de muizen daarnaast bloot aan de vibratiestimulator voor de snorharen zonder elektrische stimulatie toe te passen. Plaats het piëzosysteem dicht bij de geconditioneerde zijde en schuif de tanden van de kam over de individuele snorharen. Selecteer voor elke sessie dezelfde snorharen.

Vervolg vervolgens met de klassieke conditioneringstraining zoals beschreven in de tekst. Mannelijke C57 Black 6J-muizen van acht tot tien weken oud werden getraind met trace eyeblink-conditionering in de kopgefixeerde cilindrische loopband. Van elke trial werden EMG-registraties gemaakt.

De EMG's werden gegerectificeerd en geïntegreerd met een tijdconstante van 10 milliseconden, en vervolgens gemiddeld over alle trials. De evolutie van de geconditioneerde responsen over 10 trainingssessies laat zien dat de amplitude van de respons geleidelijk toenam en de latentietijd van de respons korter werd. Deze evolutie is niet zichtbaar in de responsen van de pseudogeconditioneerde muizen, waarbij de stimuli in willekeurige volgorde werden gepresenteerd.

De evolutie van goed getimede en dus goed aangeleerde geconditioneerde reacties kan ook worden gezien in de histogrammen van de tijd tot de piek van de reactie na het begin van de CS. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het hoofdstuk moet voorbereiden, het hoofdstuk chirurgisch bij een muis moet implanteren en de muis op de cilindrische loopband moet plaatsen voor head-fixed oogknipperconditionering. Uw muizen zouden een goede leercurve over de dagen heen moeten vertonen terwijl ze de conditionering verwerven.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om waakzaam te blijven en elk teken van stress bij de dieren op te merken. Er moeten passende maatregelen worden genomen om de stress voor de dieren tot een minimum te beperken.