Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de

Het algemene doel van deze procedure is om de immuunrespons van Arabidopsis diliana kwantitatief te karakteriseren via een geoptimaliseerde spuiten-infiltratieanalyse. Dit wordt bereikt door eerst spuiten-infiltratie te gebruiken om bacteriën handmatig via de natuurlijke openingen, genaamd huidmondjes, in het blad te brengen. De tweede stap is het verkrijgen van schijfjes van geïnfecteerd bladweefsel nadat ziekteverschijnselen zijn ontwikkeld.

Vervolgens worden de bacteriën uit de bladschijfjes geëxtraheerd via high-throughput homogenisatie. De laatste stap is de seriële verdunning en het uitplaten op bacteriële telplaten om de kolonies te tellen. Uiteindelijk kan de bacteriële groei in elk bladschijfje worden gecorreleerd aan de relatieve sterkte van de immuunrespons van de plant.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van plantimmuniteit, zoals het identificeren van genen die bijdragen aan afweerreacties tegen biotische stress. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het een nauwkeurige kwantificering van de pathogenengroei in het geïnfecteerde plantweefsel mogelijk maakt en helpt experimentele fouten te voorkomen die ontstaan door het bemonsteren van bladeren met een variërende ontwikkelingsstatus. Deze methode kan inzicht bieden in de immuunrespons van de plant op een infectie met een virulent bacterieel pathogeen, en kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals immuunresponsen die worden uitgelokt door salicylzuur of microbe-geassocieerde moleculaire patronen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het inbrengen van de bacteriën in het blad zonder weefselschade te veroorzaken. De volgende procedure zal worden gedemonstreerd door postdoc-onderzoeker Hindu en promovendi Shalu en Yali Soon uit mijn laboratorium. De assay voor verhoogde ziektegevoeligheid zal in deze video worden gedemonstreerd.

Bereid voorafgaand aan het experiment King's B of KB-mediaplaatjes door één liter KB-vast medium te maken zoals beschreven in de protocoltekst en laat dit afkoelen op een magnetische roerplaat. Wanneer het medium op aanraking is afgekoeld, voegt u 80% glycerol, één molaire magnesiumsulfaat en streptomycine toe aan het medium; giet vervolgens twee verschillende maten KB-mediaplaatjes. De kleinere Petrischaal dient als de primaire bacteriële cultuurplaat en de grotere Petrischaal dient als de plaat voor het tellen van de bacteriën.

Bewaar de platen twee dagen voor het uitstrijkassay bij vier graden Celsius. PSM ES 43 26. Ent de volgende dag bacteriën uit een glycerolstock van min 80 graden Celsius op een KB-streekplaat voor bacterieculturen en incubeer deze gedurende 24 tot 48 uur bij 28 graden Celsius.

Start de vloeibare kweek in een steriele reageerbuis met vier milliliter vloeibaar kb-medium dat 50 micrograms per milliliter streptomycin bevat. Schud dit gedurende de nacht bij 250 RPM bij 28 degrees Celsius. De Arabidopsis-planten voor het experiment worden gekweekt onder de condities die in de protocoltekst worden beschreven op dezelfde dag dat de vloeibare bacteriële kweek wordt gestart.

Markeer de bloembladen van blad nummer vijf en zes met een stomp, waterbestendige stift voor een eenvoudige identificatie van het geïnfecteerde weefsel tijdens de bemonstering. Om de opening van de huidmondjes te bevorderen en de instroom van de pathogeensolutie in het blad te vergemakkelijken, worden de planten goed verzadigd door de kweekplaat gedurende 20 minuten van onderaf te laten weken.

Giet na 20 minuten het overtollige water af. De infectie van de arabidopsisplanten is voltooid. De dag na aanvang van de vloeibare cultuur.

Overbreng de bacteriële cultuur naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer bij 9.600 Gs gedurende twee minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in één milliliter steriel 10 millimolair magnesiumchloride. Verdun de bacteriesuspensie met negen milliliter 10 millimolair magnesiumchloride in een centrifugebuis van 50 milliliter. Na het meten van de optische dichtheid van de bacteriën, wordt de bacteriesuspensie verdund met 10 millimolair magnesiumchloride tot een uiteindelijke OD 600 van 0,0002.

Voor de EDS-infectieassay. Een stompe, naaldloze spuit van één milliliter, algemeen bekend als een insulinespuit, wordt gebruikt voor infiltratie. Vul de spuit met 0,5 tot 0,6 milliliter van de verdunde bacteriële oplossing voor een veel betere controle tijdens het infiltratieproces; vul de spuit niet tot zijn volledige capaciteit.

Plaats de onderzijde van het blad op de bovenkant van de wijsvinger en pas vervolgens met behulp van de duim voorzichtig de positie van het blad aan. Plaats de spuit verticaal tegen het bladoppervlak om een gelijkmatige drukverdeling te garanderen en bladschade te beperken. Probeer tijdens de infiltratie het gebied rond de hoofdnerf te vermijden.

Duw de zuiger langzaam in om de bacteriële oplossing te infiltreren. Het binnendringen van de vloeistof in het mesofyl van het blad is zichtbaar aan de donkerdere bladkleur; infiltreer het gehele bladoppervlak, zelfs als dit meerdere pogingen vereist. Wanneer de infiltratie voltooid is, dep het blad voorzichtig droog met absorberend weefsel om de overtollige pathogene oplossing te verwijderen.

Inspecteer het geïnfecteerde bladweefsel visueel op schade. Laat de geïnfiltreerde planten één tot twee uur drogen en plaats de planten vervolgens terug in hun oorspronkelijke kweekomstandigheden. Besproei een transparante stolp met water en dek de geïnfecteerde planten hiermee gedurende twee uur af.

Breek vervolgens de koepel om een opening van vijf tot zevenenhalf centimeter te creëren en laat deze gedurende de rest van het infectie-experiment, wat gewoonlijk drie dagen duurt, op de plaat staan. Eén dag voordat de pathogenengroei wordt gekwantificeerd, worden de KB-mediaplaten van 150 millimeter bij 15 millimeter voorbehandeld door ze te drogen.

Droog de platen door ze ongeveer 24 uur bij kamertemperatuur te laten staan. Verwerk het geïnfecteerde weefsel nadat de sclerose is verschenen, aangegeven door het geel worden van het geïnfecteerde weefsel in de vatbare genotypen, maar vóór de ontwikkeling van necrotische laesies. Bereid voor elk genotype zes maalbuisjes.

Plaats één roestvrijstalen maalsfeer in elke buis en voeg 500 µL steriel, 10 mM magnesiumchloride toe. Detacheer vervolgens het geïnfecteerde blad van de plant en pons met een pincet en een enkelgat-papierpons willekeurig een bladschijfje uit; plaats twee bladschijfjes van twee verschillende planten in elke maalsbuis. Sluit de buizen af en homogeniseer het weefsel met een high-throughput homogenisator op maximale snelheid gedurende 10 minuten.

Herhaal dit proces indien nodig totdat het weefsel goed is gehomogeniseerd en de oplossingen groen kleuren door de vrijgave van chlorofyl uit de geïnfecteerde bladeren tijdens het wachten. Vul voor de homogenisatie elke put in de eerste zes rijen van een 96-well cultuurplaat met 180 µL 10 mM magnesiumchloride. Breng 20 µL van de suspensie van het gemalen weefsel over naar elke put in de eerste rij van de 96-well plaat en meng door de vloeistof herhaaldelijk op en neer te pipetteren.

Als kleine weefselfragmenten de tip verstoppen, knip deze dan met twee tot drie millimeter af om te helpen het juiste volume van de oplossing te verkrijgen; zorg voor voldoende ruimte voor de druppel bovenop de plaat en plaats het weefsel van verschillende genotypen in afwisselende rijen. Om een tienvoudige seriële verdunning voor te bereiden, brengt u 20 µL van de weefselsuspensie over naar de tweede rij en herhaalt u deze procedure tot aan de zesde verdunning. Breng met behulp van verdeelde pipetpunten 20 µL van de oplossing vanuit de 96-wellplaat over naar de 150 mm bij 15 mm KB-plaat.

Werk van de meest verdunde suspensie naar de meest geconcentreerde, zodat het niet nodig is om de pipetpunten tussen de verdunningen te vervangen. Droog de plaat bij kamertemperatuur met het deksel op een kier. Zodra er geen vloeistof meer zichtbaar is op het platoppervlak, sluit u het deksel, keert u de plaat om en incubeert u deze bij kamertemperatuur.

Incubeer de platen gedurende 40 tot 60 uur totdat de kolonies zichtbaar worden. Bevestig dat de bacteriën op de platen de voorspelbare tienvoudige afname in kolonievormende eenheden weerspiegelen.

Tel de bacteriën voordat ze overgroeien en kolonies samensmelten. Bepaal het aantal bacteriën in de laagste verdunning waarin geen overlappende kolonies aanwezig zijn. Gewoonlijk bevat de bij voorkeur te tellen verdunning tussen de 10 en 50 kolonies, en dit kan variëren tussen technische replica's.

Om de niveaus van bacteriële proliferatie te berekenen, bepaalt u het aantal colony forming units per bladschijf met behulp van deze formule, waarbij R het rijnummer is en T het aantal bacteriën binnen elke technische replica. De gegevens worden vervolgens gebruikt om een grafiek op te stellen. Elk datapunt wordt weergegeven als het gemiddelde van zes technische replica's op een logaritmische schaal.

De foutenbalken vertegenwoordigen het 95%-betrouwbaarheidsinterval van de gemiddelde versterkte ziekte. De vatbaarheid voor P-S-M-E-S 43 26 werd beoordeeld door infectie met een inoculum met een OD 600 van 0,0002. De resultaten laten zien dat de zeer vatbare NPR one dash one mutanten ongeveer 2,5 log of 300 keer meer pathogeengroei vertonen in vergelijking met de wildtype Columbia zero planten.

De assay voor infiltratie met een spuit kan worden aangepast om verschillende lagen van de immuunrespons te beoordelen. Om salicylzuur-geïnduceerde immuniteit te evalueren, wordt externe applicatie van natriumsalicylaat gebruikt om de immuunrespons te triggeren, welke vervolgens wordt gekwantificeerd aan de hand van de pathogenengroei. Het verlies van NPR1, dat fungeert als de salicylzuurreceptor en als belangrijke transcriptionele co-regulator van salicylzuur-afhankelijke doelgenen, leidt tot ongevoeligheid voor exogene applicatie van het salicylzuurderivaat.

Om de immuniteit die wordt getriggerd door microbe-geassocieerde moleculaire patronen te karakteriseren, werden planten voorbehandeld met twee bekende triggers. Na behandeling met FLAG 22 vertoonden de wild-type Columbia zero planten een reductie van de bacteriële populatie met één log of 10 keer, terwijl de FLS2-mutante planten er niet in slaagden het effect van remming van de bacteriële groei te triggeren. Op vergelijkbare wijze waren de EFR-mutante planten ongevoelig voor voorbehandeling met L 18.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de immuunrespons van Arabic opsys kan worden gekwantificeerd via de spuitinfiltratie-assay. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de ziekteontwikkeling te monitoren en het weefsel te bemonsteren na het verschijnen van corsis. De pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 is een hemi-atrofisch pathogeen.

Daarom moet de bemonstering worden uitgevoerd vóór de overgang naar de neurotrofe fase. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve real-time PCR en Western blot-analyse, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke specifieke immuunsignaleringsroute is verstoord. Vergeet niet dat u met levende bacteriën werkt.

Hoewel Pseudomona Senge niet pathogeen is voor mensen, dient u er tijdens het uitvoeren van deze procedure aan te denken om besmette verbruiksartikelen en geïnfecteerde planten op de juiste wijze af te voeren.