Name: Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Leer een methode voor multi-kleur lineage tracing van hoornvliesepitheelcellen met R26R-Confetti muizen. Deze techniek volgt migratie en overleving van stamcellen niet-invasief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RSF heeft financiering ontvangen van het zevende kaderprogramma (FP7/2007-2013]) van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, evenals van de Israel Science Foundation (218/14).

Ethiek Verklaring: In deze studie dierlijke zorg en het gebruik werden gelijkvormigheid aan het ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research. Alle experimenten werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie. 1. Kies een geschikte Cre-recombinase uitdrukken Mouse Strain <ol><li> Uit het grote aantal Cre transgene lijnen verkrijgbaar 26 en afhankelijk van het beoogde weefsel te onderzoeken, kiest een Cre transgene muizenstam waarin het Cre recombinase gen wordt gecontroleerd door een promoter die specifiek is voor het weefsel van belang. In het geval tijdelijke controle nodig is, kies dan een induceerbare Cre lijn. Let op: We kozen voor de tamoxifen induceerbare K14-Cre ERT transgene specifiek label limbale en cornea epitheliale stamcellen / voorlopercellen 24. Merk op dat er verschillen kunnen zijn tussen stammen, zoals Di Girolamo en medewerkers gerapporteerd limbale specificiteit zonder cornea uitdrukking voor hun K14-Cre ERT 22. Een voordeel van het gebruik induceerbare Cre transgene muizen dat het de inductie van lineage tracing veelzijdig tijdframes. </li></ol> 2. Kies een geschikte Br Muis Strain <ol><li> Kies de juiste Br cassette, afhankelijk van de onderzoeksvraag en beschikbaar Cre lijn 16,18,20. <ol><li> Als een niet-induceerbare Cre muis stam wordt gebruikt, kies een Br cassette die niet toestaat continu DNA inversies / excisies en daarmee aanleiding geven tot dead-end producten (bijvoorbeeld Br1.0 of Br1.1) 16. </li></ol></li></ol> 3. Steek de transgene lijnen van Interest <ol><li> Voor de hier getoonde protocol, steek de homozygote R26R Confetti-stam (Br2.1 / Br2.1) met de homozygote Cre ERT stam (Cre ERT / Cre ERT) naar hemizygoot nakomelingen krijgen (Br2.1 / +; Cre / +) die klaar zijn voor mono-allelische lineage tracing omdat ze bevatten allemaal een enkele Br2.1 allel en zijnenkele Cre allel. Opmerking: Om de efficiëntie van de etikettering te verhogen, kan men muizen die twee Cre allelen (Br2.1 / +; Cre / Cre) bevatten genereren, terwijl twee Br2.1 allelen (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) zou verhogen kleurencombinaties (zoals beschreven in 22). </li></ol> 4. Cre-recombinase Inductie Opmerking: De toediening van tamoxifen bij deze experimenten werd uitgevoerd door dagelijkse intraperitoneale injectie uitgevoerd voor de duur van 3-4 dagen om de translocatie van Cre recombinase ERT te induceren in de kern van limbale cornea en basale K14-positieve stam / voorlopercellen epitheelcellen. Het volgende protocol kan worden gebruikt voor het injecteren van vier muizen. Alternatief topische applicatie van Tamoxifen het oogoppervlak levert hogere efficiëntie. De Tamoxifen oplossing in het donker bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week. Verwarm de oplossing voor gebruik. <ol><li> Weeg 100 mg Tamoxifen en oplossen in 5 ml maïsolie naarvormen een 20 mg / ml oplossing tamoxifen. </li><li> Injecteer 200 ui Tamoxifen (4 mg) oplossing intraperitoneaal tot 8 weken oude muizen gedurende 3-4 opeenvolgende dagen. Opmerking: De Tamoxifen oplossing kan in het donker bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week. Verwarm de oplossing voor gebruik. </li><li> Voor topicale toediening: weegt 60 mg Tamoxifen en oplossen in 1 ml maïsolie een 60 mg / ml tamoxifen te vormen. Vortex en stel de oplossing in een schuddend waterbad gehandhaafd op 65 ° C totdat het wordt duidelijk laat het in het bad tot gebruik. <ol><li> Zorgvuldig toepassing 100 ul van de oplossing in elk Tamoxifen oogoppervlak van de muis. </li></ol></li></ol> 5. Tissue Voorbereiding voor Imaging <ol><li> Opoffering dieren met behulp van isofluraan (2% verdampt zuurstof) anesthesie (bevestiging juiste verdoving door het gebrek aan reflexen) gevolgd door CO 2 inhalatie op geschikte tijdstippen na injectie en Tamoxifen colteer de relevante weefsel. <ol><li> Voor deze experimenten ophelderen ogen op de volgende tijdstippen: 1, 4, 8, 12 en 16 weken na injectie Tamoxifen. Bereiken enucleatie met behulp van gebogen pincet. Druk op de oogleden waardoor de oogbol om pop uit de oogkas. Plaats de tang achter de oogbal die de oogzenuw. Trek de oogbol en verwijder. Opmerking: In dit stadium, zoals hieronder beschreven weefsels worden bereid voor wholemount analyse van gemerkte cellen. Regelmatige ingevroren weefselcoupes kunnen ook worden bereid, in PFA gefixeerd en afgebeeld zoals hieronder beschreven (zie paragraaf 6 en 22). </li></ol></li><li> Plaats elk oog in een 60 mm schaal gevuld met PBS. </li><li> Onder een stereomicroscoop behulp van een tang houdt het oog nabij de oogzenuw van de cornea naar beneden en gebruik een scalpel om de oogzenuw, spier- en bindweefsel te verwijderen en een kleine snede in het achterste gedeelte van het oog. </li><li> Met behulp van de lente een schaar zorgvuldig te vergrotengesneden laten de lens pop uit en verwijder de iris met behulp van een tang. </li><li> Plat de cornea door 4-5 radiale insnijdingen vanaf het midden naar de omtrek met behulp van een scalpel. </li><li> Gebruik een scalpel om overtollig perifere weefsels snijden buiten de limbus. </li><li> Fix hoornvliezen in 4% PFA gedurende 10 min, vervolgens kort wassen met PBS. </li><li> Incubeer monsters met DAPI gedurende 10 minuten en kort wassen met PBS. </li><li> Mount hoornvliezen op glasplaatjes met de epitheliale zijde naar boven. Breng een druppel fixeermiddelen bovenop het hoornvlies en deksel met een dekglas. Laten drogen slides O / N bij RT. Houd slides bij 4 ° C. </li></ol> 6. confocale microscopie en beeldanalyse <ol><li> Gebruik een spectrale confocale systeem dat scheiding van YFP / GFP / CFP uitstoot mogelijk maakt. Set fluorescentie-excitatie en emissie golflengten afhankelijk van de fluorescerende eiwitten van de Br cassette. Kies de meest geschikte golflengte voor elk eiwit gericht op het minimaliseren kruisexcitatie. Kies smalle emissie varieert teneinde het lekken van signalen van de verschillende eiwitten te minimaliseren. <ol><li> Voor de Br2.1 cassette, gebruik dan de volgende set-up van de fluorescentie excitatie (ex) en emissie (em) als uitgangspunt: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm en RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm. </li></ol></li><li> Om grote weefselgebieden visualiseren met hoge resolutie verwerven tegel beeldvorming. Voor de in figuur 2A-B, beeld het gehele hoornvlies door het verkrijgen van een array van 12 x 12 beelden, namelijk resultaten verkrijgen 144 velden (512 x 512) met behulp 4 fluorescente kanalen in elk veld. Alles bij elkaar te verzamelen 576 beelden en vervolgens samen te voegen. </li><li> Om de lokalisatie van gemerkte cellen in verschillende diepten en structuren van het weefsel staand verwerven Z-stack beelden van verschillende gebieden van belang. Om to imago van de volledige diepte van het hoornvlies, te verwerven 8 optische secties 3 micrometer intervallen. Orthogonale uitzicht op de alsmede verzameld image projecties gebaseerd op maximale intensiteit secties kunnen worden gebouwd met behulp van conventionele imaging software 24. </li></ol> 7. hoornvliesletsel gecombineerd met Tamoxifen Inductie <ol><li> Verdoven muizen met isofluraan (2% verdampt in zuurstof) en dienen analgetica (10 mg / kg Carpofen, subcutaan). Bevestig de juiste verdoving door ongevoeligheid tot teen-snuifje. </li><li> Weeg 1 g poeder Tamoxifen en oplossen in 5 ml steriel DMSO tot 200 mg / ml concentratie in oplossing leidt. </li><li> Tamoxifen Verwarm de oplossing 65 ° C in een waterbad totdat de oplossing helder. Bewaar oplossing in het bad tot gebruik. </li><li> Gelden oogzalf met de onbehandelde contralaterale oog om uitdroging tijdens anesthesie te voorkomen. Heeft een dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende con heeft herwonnenbewustzijn te borstligging handhaven. Niet muizen die ogen verwonden aan het gezelschap van andere muizen hadden ondergaan, totdat volledig hersteld terugkeren. Muizen moeten nauwgezet worden gevolgd na het letsel. Indien verliezen ze meer dan 10% van hun lichaamsgewicht, lijden corneale erosie, of ongemak, wordt het experiment gestopt. Herhaal analgetica toediening elke 24 uur gedurende het gehele experiment. </li><li> Met behulp van een steriele spuit, zonder naald die eraan verbonden zijn; toepassing 200 ul Tamoxifen oplossing topisch over het gehele hoornvlies van een oog van elke muis. Opmerking: De vloeibare oplossing stolt snel aan het oogoppervlak bij KT. Het effect van hoornvliesletsel afhankelijk van de ernst van de wond. Na een toepassing van Tamoxifen / DMSO oplossing geen nadelige effecten worden waargenomen in de muizen. In het geval van herhaalde toepassingen kan het hoornvlies worden waargenomen. </li><li> Ga verder met het prepareren van weefsels en beeldvorming (zie parionen 5 en 6) op relevante tijdstippen. Voor de hier getoonde resultaten, offeren de muizen (zoals beschreven in fase 5.1), een week na de verwonding (figuur 2 en 24). </li></ol>

<ol><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior.</a> Dev Cell. 21, 394-409 (2011).</li>
<li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing.</a> Cell. 148, 33-45 (2012).</li>
<li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).</li>
<li>Beck, B., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+cancer+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unravelling cancer stem cell potential.</a> Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vital+dye+analysis+of+the+timing+and+pathways+of+avian+trunk+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration.</a> Development. 106, 809-816 (1989).</li>
<li>Eagleson, G. W., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+presumptive+brain+regions+in+the+neural+plate+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis.</a> J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).</li>
<li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate%3A+implications+on+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
<li>Snippert, H. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Tracking adult stem cells.</a> EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr6+marks+stem+cells+in+the+hair+follicle+that+generate+all+cell+lineages+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.</a> Science. 327, 1385-1389 (2010).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li>
<li>Jaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-layer+and+lineage-restricted+stem%2Fprogenitors+regenerate+the+mouse+digit+tip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip.</a> Nature. 476, 409-413 (2011).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506, 322-327 (2014).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+podocyte+reporter+highlights+heterogeneous+podocyte+changes+in+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney Int. 85, 972-980 (2014).</li>
<li>Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+and+imaging+multicolor+Brainbow+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating and imaging multicolor Brainbow mice.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 763-769 (2011).</li>
<li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainbow%3A+new+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199, 293-306 (2015).</li>
<li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nat Methods. 10, 540-547 (2013).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li>
<li>Di Girolamo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+fate+of+limbal+epithelial+progenitor+cells+in+the+murine+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea.</a> Stem Cells. 33, 157-169 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+stem+and+progenitor+cells+of+the+murine+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium.</a> Stem Cells. 33, 230-239 (2015).</li>
<li>Schepers, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337, 730-735 (2012).</li>
<li>Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre mice.</a> Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).</li>
<li>Collinson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+patterns+of+growth%2C+stem+cell+activity%2C+and+cell+movement+during+the+development+and+maintenance+of+the+murine+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium.</a> Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).</li>
<li>Buck, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+centripetal+migration+of+normal+corneal+epithelial+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).</li>
<li>Nagasaki, T., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+movement+of+corneal+epithelial+cells+in+the+normal+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).</li>
<li>Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligopotent+stem+cells+are+distributed+throughout+the+mammalian+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface.</a> Nature. 456, 250-254 (2008).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Lineage tracing experimenten zijn uitgevoerd voor vele jaren. De recente technologische verbeteringen en de opkomst van de Confetti muizenstammen opende nieuwe mogelijkheden voor onderzoek. Tegenwoordig kunnen onderzoekers profiteren van een groot aantal commercieel verkrijgbare weefsel-specifieke Cre lijnen knockout muizen en transgene muizen. Dit biedt de mogelijkheid voor het ontwerpen van veelzijdige experimentele systemen voor de aanpak van wetenschappelijke vragen met elementaire kennis, het vermijden van moeizame praktijk, terwijl het verstrekken van robuuste en betrouwbare gegevens. R26R-Confetti muizen een elegant middel voor efficiënte tracking en bestuderen van de aard en het gedrag van cellen in een levend organisme. Het systeem is eenvoudig vast te stellen en geeft niet-invasieve stam traceren van afzonderlijke cellen gedurende embryogenese stamcel regeneratie onder homeostase, of onder verschillende omstandigheden, zoals letsel, ontsteking en kanker. De verkregen data biedt een robuuste description van het voortbestaan ​​van gerichte cellen, klonale cel expansie en cel migratie, in een meetbare manier. Een kritische stap is om de juiste genetische muizenstam die met zekerheid kan toestaan ​​weefselspecifieke efficiënte labeling op een bepaald ontwikkelingsstadium te kiezen. Een beperking van dit systeem is dat voor het bewaken van een levend organisme, weefsel toegankelijk en transparant moeten zijn. Evenzo volgen van een dikke weefsel in een levend dier kan alleen worden vergemakkelijkt door twee-foton of meerdere foton microscopie. Echter, cell tracking is mogelijk postmortem weefselsecties en misschien intact weefsel worden onderzocht nadat deze is getransformeerd door de transparante CLARITY werkwijze 32,33 te worden. Een andere beperking te worden beschouwd is dat hoewel aangrenzende cellen die dezelfde fluorofoor expressie waarschijnlijk tot dezelfde klonale lijn, is het mogelijk dat zij kunnen worden verkregen uit onafhankelijke celoorsprong die willekeurig expressie dezelfde fluorescerende gen. Dit possibility wordt zeer waarschijnlijk bij het gebruik van meerdere Br allelen tal van kleurencombinaties mogelijk te maken. In de toekomst, het combineren van de Confetti-systeem met de beschikbare genetische instrumenten (dwz, knockout, knockin en transgene muismodellen) zal de studie van de genen en hun mutaties in gezondheid en pathologie toe. Ook lineage tracing systeem onder verschillende storingen (dwz stamcel niche vernietiging, laser gemedieerde cel ablatie, behandeling met geneesmiddelen) zal nieuwe inzichten brengen op de betrokkenheid van de signaalwegen in de cel beslissingen over het lot. Uiteindelijk is de combinatorische gebruik van fluorescerende en bioluminescentie etikettering, genetische verslaggevers van signaalwegen en geavanceerde microscopie zullen onderzoekers van een robuust systeem om te leren hoe enkele cellen reageren op hun omgeving in hun eigen omgeving.

Tijdens de embryonale ontwikkeling, weefsels en organen morfogenese plaatsvinden door middel van een nauwkeurig programma dat in termen van celproliferatie, migratie en lineage specificatie 1-4 kunnen worden beschreven. Deze biologische processen zijn betrokken bij het handhaven van volwassen weefsel homeostase, hetwelk stamcel regeneratie. Lineage tracing, de identificatie en opsporing van de nakomelingen van een specifiek type cel populatie, levert een belangrijk instrument voor het bestuderen van embryogenese en stamcel homeostase. Inderdaad wordt steeds vaker gebruikt in vele gebieden van onderzoek. Bijzonder, lineage tracing werd een essentieel hulpmiddel bij het identificeren van de oorsprong en het lot van de stamcellen in homeostase en de ontwikkeling van kanker. Dit is omdat het essentiële informatie over de cel gedraagt ​​in het kader van het intacte weefsel of organisme, met minimale experimentele interventie verschaffen, in tegenstelling tot cel isolatie en in vitro kweek of TransplantatieOp die kunnen leiden tot ongewenste vertekening. Traditioneel kleurstoffen zoals vetoplosbare carbocyanine die integreren in het plasmamembraan van cellen, werden gebruikt voor lineage tracing. Hoewel deze soorten experimenten succes hebben geleid tot belangrijke ontdekkingen en gevormde rudimentaire concepten ontwikkelingsbiologie 5,6, ze hebben een aantal beperkingen, zoals de moeilijkheid om de specificiteit van doelcellen controle, het ongewenste effect van de kleurstof op celgedrag en de verdunning van het label in de tijd. Nucleotideanalogon etikettering benaderingen zijn ingeschakeld documenteren van het bestaan ​​van slow-cycling &quot;label behoud van cellen&quot; die vermoedelijk overeen met stamcellen 7,8 rusttoestand. Hoewel deze techniek de aanwezigheid van langzaam delende cellen op basis van proliferatie kinetiek gedurende een beperkte tijdsperiode konden aantonen kon geen wezenlijke inzicht over de functionaliteit van stamcellen. Een optimale lineage tracing methdologie dient het effect van etikettering op de eigenschappen van de gemarkeerde cellen, het nageslacht of de buren te minimaliseren. Bovendien zou het gunstig zijn om controle op het etiket inductie, namelijk de mogelijkheid om de celpopulatie label per fase en tijdsafhankelijke wijze als in een enkele cel (klonale) te vervullen. Een stabiele en onomkeerbare labeling methode die wordt doorgegeven aan alle nakomelingen van de cel grondlegger van belang dat het etiket in de tijd worden vastgehouden en niet naar naburige cellen. Recentelijk genetische benaderingen cel labeling ontwikkeld. In deze systemen kunnen celspecifieke promoters worden gebruikt voor Cre recombinase expressie activeren teneinde een loxP-geflankeerd wegversperring de expressie van reportergenen te verwijderen en zoals groen fluorescent eiwit of Β-galactosidase reporter genen 9-13. Deze benadering maakt niet alleen het volgen van cellen en hun nageslacht, maar maakt ook celolation en moleculaire karakterisatie. Cell volgen op enkele cel niveau werd mogelijk door inductie van de expressie van een fluorescente reporter gen. Een belangrijke beperking van dit systeem is dat slechts bij zeer lage percentage van cellen gemerkt is het mogelijk om te scheiden en traceren individuele klonen. Om deze beperking veelkleurige reporters kan worden overwonnen. Bij het ​​gebruik van multicolor etikettering, kan het volgen van differentiële lot van naburige cellen in dezelfde niche efficiënt 14-17 worden bereikt. Recentelijk diverse Brainbow (Br) allelen werden ontwikkeld voor lineage tracing experimenten, waardoor een stochastische expressie van meerdere fluorescente reporter genen met gebruikmaking van de Cre / lox-systeem. De Cre / lox-systeem bestaat uit het Cre recombinase enzym dat herkent en bindt aan specifieke DNA-sequenties zoals loxP sites. Na de binding van Cre recombinase, plaatsspecifieke recombinatie, waardoor het verwijderen van sequenties loxP geflankeerd resulting willekeurige expressie van verschillende fluorescerende eiwitten (het mechanisme wordt hieronder beschreven). Een verscheidenheid van Br lijnen zijn beschikbaar voor gebruik (zie reviews 16,18,19). De belangrijkste verschillen tussen de Br stammen omvatten (i) verschillen in het aantal fluorescerende genen in de cassette, variërend van 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) tot 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescent genen (ii) de aanwezigheid van wederzijds georiënteerd lox locaties aan gen inversie (Br2.0-2.1) maken, (iii) het soort gebruikte lox plaatsen, en (iv) de expressie of stilte van fluorescente genexpressie vóór Cre activatie. Het onlangs gevestigde Br3 biedt een verbeterde werkwijze voor meerkleurige beeldvorming van neuronen. Een van de belangrijkste kenmerken van deze transcriptie is dat het een nieuwe reeks van fotostabiele gefarnesyleerde fluorescerende eiwitten, die een nog kleuring van de fijnste neuronale processen 20 mogelijk te maken bevat. Belangrijk is, kunnen verschillende versies van Br cassettes neuronale specifieke bevatten Thy1 promoter of alomtegenwoordig tot expressie CAG (CMV) promoter. Tenslotte, terwijl sommige van de Br transgene muizen kan een enkele Br transgen bevatten, andere kunnen bestaan ​​uit meerdere transgene kopieën, waardoor de productie van een enorm aantal mogelijkheden om kleurcombinaties uit te drukken in elke cel (zie bijvoorbeeld 16). In onze studie gebruikten we de R26R-Confetti muis die de Br 2,1 cassette 21 bevat. Br2.1 is speciaal ontworpen om Cre-gemedieerde DNA inversies en niet alleen uitsnijdingen vanwege de onderlinge oriëntatie van de loxP-plaatsen (figuur 1) mogelijk maken. Zo kunnen deze inversie / uitsnijding gebeurtenissen die leiden tot kleurverandering zolang Cre huidige 16 blijven. Daarom een ​​induceerbare Cre tijdelijke expressiesysteem is essentieel voor betrouwbare cell tracking behulp Br2.1. In figuur. 1, de Br2.1 bevat een alomtegenwoordige CAG promotor gevolgd door loxP geflankeerd Neo R -cassette, die fungeert als een transcriptionele wegversperring, die wordt gevolgd door 4 fluorescerende reporter genen coderend voor groen (GFP), geel (YFP), rood (RFP) en cyaan (CFP) fluorescerende eiwitten, gelegen in twee tandems. Geen fluorescentie wordt vóór Cre activatie expressie. Inductie van Cre recombinase veroorzaakt het verwijderen van de neo-R cassette waarvan de willekeurige expressie van één van de 4 fluorescerende eiwitten in een bepaalde cel. Het eerste segment bevat loxP-geflankeerd GFP en een omgekeerde YFP, terwijl het tweede segment bevat loxP-geflankeerd RFP en een omgekeerde CFP. Deze DNA-segmenten kunnen continu worden geïnverteerd (via loxP dat in omgekeerde richting), of uitgesneden, zolang Cre recombinase aanwezig is. Daarom moet een voorbijgaand en gecontroleerd Cre transgene gebruikt. De Br2.1 cassette biedt een uitstekend systeem voor het onderscheid tussen overlappende uitstoot op signaal locatie: de uitdrukking van YFP en RFP is cytoplasma, de GFP is kernenergie en het GVB is gebonden aan het celmembraan. GFPen RFP emissies worden gemakkelijk gescheiden door conventionele fluorescentiemicroscopie. Om YFP / GFP / CFP emissie scheiden, wordt een spectrale confocale beeldvormingssysteem nodig. Al met al, de Br2.1 cassette maakt de willekeurige, induceerbare, en weefsel specifieke expressie van één van de vier verschillende fluorescerende genen in elke gerichte cel. In feite, wanneer een groter aantal kleurcombinaties nodig, kan homozygote muizen die 2 allelen van Br2.1 in voorkomen, hetgeen resulteert in de expressie van 2 kleurenmarkeringen voor elke cel en het verhogen van het aantal mogelijke kleurencombinaties 10 22. Enkele Br muizenstammen mogelijk de expressie van een veel groter aantal mogelijke kleurencombinaties sinds meerdere kopieën van de cassette geïntegreerd in hun genoom 16. Maar in de meeste gevallen, de vier kleurencombinaties die door één Br2.1 allel volstaan. Volgens het protocol hier verschaft, kan men deze methode tot stand met behulp van een relatief eenvoudige opzet van spectral microscopie met weinig of geen noodzaak tot kalibratie. Hier geven we een aanpasbare protocol voor het gebruik van de R26R confetti-muizen die één Br2.1 allel bevatten, lineage tracing experimenten van het hoornvliesepitheel. Deze transgene muizenstam is gebruikt voor het bestuderen van de oorsprong en bestemming van de colon 21,23 en corneale epitheliale stamcellen 22,24, de aanwezigheid van stamcellen activiteit darmkanker 25 en voor het karakteriseren nieren podocyte bij focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) 17.

<table><tbody><tr><td>R26R-Confetti transgene muizen homozygoot voor de Brainbow 2.1 cassette</td><td>Jackson</td><td>stam #013731</td><td></td></tr><tr><td>K14-CreERT muizen</td><td>Jackson</td><td>stam #005107</td><td></td></tr><tr><td>tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>isofluraan USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprieve 30</td><td>b.wt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>gebruikt bij een concentratie van 4&#160;&micro;g/ml</td></tr><tr><td>Immu Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 Meta laser scanning confocal systeem aangesloten op een geïnverteerde gemotoriseerde microscoop (Axiovert 200M) uitgerust met een gemotoriseerde stage</td><td>Zeiss</td><td></td><td>De spectrale overlap tussen GFP, YFP en CFG vereist het gebruik van spectraal beeldvorming die de scheiding van de emissiespectra van de fluorescente eiwitten mogelijk maakt. Hier gebruiken we de Zeiss LSM 510 Meta spectrale confocale microscoop. De Meta detector die in dit systeem is opgenomen, heeft 32 detectorelementen die elk emissie verzamelen vanuit een golflengteband van 10 nanometer. Deze techniek, "spectraal vingerafdrukken" genoemd, stelt de gebruiker in staat om de meest adequate grenzen voor golflengtefiltering in te stellen. Er is een verscheidenheid aan spectrale confocale systemen die kunnen worden gebruikt, waaronder Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).</td></tr><tr><td>Zen 2009 Imaging Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-oogzalf</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een methode voor lineage tracing van hoornvliescellen de multi-kleur fluorescent reporter muizen

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lijntraceringsexperimenten bepalen de oorsprong, het lot en het gedrag van cellen in een specifiek weefsel of organisme. Deze techniek is al vele decennia met succes toegepast en heeft baanbrekende ontdekkingen opgeleverd in de ontwikkelingsbiologie. Meer recentelijk werd het door stamcelbiologen overgenomen om verschillende stamcelpopulaties te identificeren en te volgen met minimale experimentele tussenkomst. De recente ontwikkelingen in muisgenetica, de beschikbaarheid van een groot aantal muisstammen en de vooruitgang in fluorescentiemicroscopie maken de eenvoudige ontwerping van krachtige lijntraceringssystemen mogelijk voor verschillende weefsels met basisexpertise, met behulp van commercieel verkrijgbare hulpmiddelen. We hebben onlangs gebruik gemaakt van deze krachtige methodologie om de oorsprong en het lot van stamcellen aan het oogoppervlak te onderzoeken met behulp van de R26R-Confetti muis. Dit model biedt een meerkleurig genetisch systeem voor de expressie van 4 fluorescerende genen op willekeurige wijze. Hier beschrijven we de principes van deze methodologie en bieden we een aanpasbaar protocol voor het ontwerpen van lijntraceringsexperimenten; specifiek voor het hoornvliesepitheel evenals voor andere weefsels.

Onlangs hebben we gericht op het identificeren van de oorsprong, de overleving en migratie van stamcellen en stamcellen van het cornea epitheel 24. Accumulerende bewijs ondersteunt het dogma dat het hoornvliesepitheel wordt geregenereerd door stamcellen uitsluitend in het limbale gebied, een ringvormige zone in het corneale periferie. Deze theorie wordt ondersteund door in vitro en in vivo gegevens, en klinisch bewijs dat de basis verschaft voor een succesvolle baanbrekende limbale stamcellen celtherapie 27-29. Echter, bleef dit onderwerp zeer besproken in de afgelopen jaren als gevolg van een studie op basis van limbale enten experimenten die suggereerde dat de muis limbus neemt niet deel aan het hoornvlies vernieuwing 30. Om deze interessante hypothese te testen, lineage tracing experimenten met R26R-Confetti muizen werden uitgevoerd, om het lot van limbale en cornea epitheliale stamcellen / voorlopercellen onder steady-state condities te volgen voor maximaal 120 dagen 24.Ogen waren enucleated en een flatscreen-mount hoornvliezen werden geanalyseerd door spectrale confocale laser scanning fluorescentiemicroscopie 10 en 120 dagen na Tamoxifen injectie. Zoals verwacht, werden sporadische kleine clusters van fluorescerende cellen door het oogoppervlak waargenomen 10 dagen na injectie, terwijl 1-4 maanden later (figuur 2B en 24) langwerpige stroken die zich uitstrekken vanaf de limbus richting het hoornvlies centrum langzaam ontwikkeld. Dit resultaat suggereert dat de cornea wordt geregenereerd door cellen die migreren uit de limbus naar het midden van de cornea. Vervolgens regeneratie onder verwonden voorwaarden hoornvlies werd onderzocht. Om het lot van K14-positieve limbale / hoorncellen testen onder omstandigheden verwonden tijdens induceren efficiënt cell tracking, we opgelost de Tamoxifen in dimethylsulfoxide (DMSO), die hoornvliesbeschadiging bij topicale toepassing veroorzaakt. Op deze manier zijn we erin geslaagd om een lichte verwonding veroorzaken als een enkele topische applicatie werd toegepast (figuur 2C), mo<html> derate verwonden als extra DMSO alleen behandeling werd toegepast op de dag vóór Tamoxifen inductie of ernstige wond wanneer DMSO alleen lokaal in 2 opeenvolgende dagen werd toegepast voorafgaand aan Tamoxifen inductie. In tegenstelling tot de dunne limbale strepen die langzaam ontwikkeld en bereikte het hoornvlies centrum binnen 4 maanden onder steady-state condities, celmigratie na letsel was snel. Opmerkelijk waren lang en dik limbale strepen reeds ontwikkeld onder deze omstandigheden binnen 7 dagen. Interessant, diversiteit kleur was soms minimaal (Figuur 2D). In onze handen, af en toe, vooral rode cellen werden geïdentificeerd in het hele hoornvlies, wat aangeeft dat de diversiteit kleur kan worden beïnvloed in de richting van specifieke fluoroforen. Deze ongewenste vertekening kan worden gekalibreerd door dosis-respons testen zoals eerder gemeld in Br1.0L 31 en in Br2.1 21. les / ftp_upload / 53.370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Schematische weergave van de R26R-Confetti construct. (A) De R26R confetti-construct bevat een CAG promotor voor hoge expressie niveaus, een loxP (zwarte driehoek) -flanked Neo R -roadblock en de Brainbow2.1 cassette op de Rosa26 locus 16,21. De Brainbow2.1 cassette omvat twee kop-staart-loxP geflankeerd dimeren. Een dimeer bestaat uit nucleair gelokaliseerde green fluorescent eiwit (GFP) en een reverse-georiënteerde cytoplasmatisch geel fluorescerend eiwit (YFP, de omgekeerde oriëntatie wordt aangeduid - PFY). De tweede dimeer bevat cytoplasma RFP en een reverse-georiënteerde membraan-tethered cyaan fluorescente eiwit (GVB, de omgekeerde richting wordt aangeduid - PFC) 16. (B - E) Bij het ​​Cre-recombinase activering, verschillende uitsnijding en inversie gebeurtenissen kunnen optreden; mogelijke uitkomsten zijn exemplified in B - E. De Cre-activiteit induceert stochastische herschikking van de cassette leidt tot gen verhuizingen en / of omkeringen en dus resulteert in de willekeurige expressie van één van de vier fluorescerende eiwitten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> Figuur 2. Cornea lineage tracing onder homeostase en verwondingen. R26R-confetti / K14-Cre muizen werden geïnjecteerd met 4 mg Tamoxifen zoals beschreven in het protocol. In de aangegeven tijdstippen plaatsen afgevlakt inductie hoornvliezen werden afgebeeld (A - B). Corneale verwonding gekoppeld Cre inductie werd bereikt door topische applicatie van Tamoxifen opgelost in DMSO (C - D). Mozaïek verkregen beeldendoor multichannel betegelen spectrale confocale microscopie worden getoond (A - D). In homeostase, radiale limbale strepen van langzame migrerende cellen verlengd tussen de limbus en het hoornvlies centrum. Deze strepen ontwikkelde langzaam, het bereiken van het hoornvlies centrum binnen 4-5 maanden (B). Clusters van het hoornvlies cellen waren duidelijk ook (witte pijlen, B). Daarentegen grote limbale stroken verschenen binnen één week onder condities verwonding (C). Een voorbeeld van kleurzweem verscheidenheid aan rode cellen (D). De limbale cornea-grens wordt geannoteerd door een stippellijn. Schaal bar is 500 pm. Afkortingen: GVB, cyaan fluorescente eiwit; GFP, groen fluorescent eiwit; RFP, rood fluorescerend eiwit; YFP, geel fluorescerend proteïne. Dit cijfer is aangepast van 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie te bekijken</a>dit cijfer.

In dit artikel beschrijven we de principes voor het ontwerpen en uitvoeren van een multi-kleurig lijn-traceringsexperiment met behulp van R26R-Confetti muizen. We bieden een specifiek protocol voor het volgen van hoornvliesepitheelcellen die kunnen worden aangepast voor andere weefsels van belang.

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Het algemene doel van deze methode is het lokaliseren en volgen van de migratie, expansie en overleving van stamcellen en progenitorcellen in het hoornvliesepitheel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de biologie van het hoornvliesepitheel met betrekking tot homeostase, weefselherstel, veroudering en pathologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig op te zetten is en een niet-invasieve lineage tracing van cellen op clonale wijze mogelijk maakt.Begin met het selecteren van een Cre-transgene muizenstam met een induceerbare weefselspecifieke promoter om de progenitorcellen en stamcellen van het limbus- en hoornvliesepitheel te labelen. De Tamoxifen-induceerbare K 14 Cre ERT-lijn wordt hiervoor gebruikt. Kies vervolgens de passende brainbow-cassette, afhankelijk van de onderzoeksvraag en de beschikbare Cre-lijn.In dit geval wordt de Brainbow 2.1-lijn gebruikt. Kruis de homozygote R 26 R confetti-stam met de homozygote K 14 Cree ERT-stam om muizen te genereren met vierkleurige K 14-positieve cellen. Om recombinatie in de transgene muizen te induceren, weegt u eerst 80 milligram Tamoxifen en lost u dit op in één milliliter maïsolie door middel van vortexen.Plaats de oplossing in een schud-waterbad, op 65 °C gehouden tot deze volledig is opgelost, en laat de oplossing in het bad staan tot het volgende moment van anesthesie. Gebruik een acht weken oude Brainbow 2.1 Cree ERT heterozygote muis en controleer de diepte van de anesthesie zorgvuldig met een teenknijptest; breng vervolgens 100 µL van de Tamoxifen-oplossing aan op elk oogoppervlak van de muis. Directe applicatie van Tamoxifen resulteert in een hoge efficiëntie van Cree-inductie. Bewaar eventuele resterende Tamoxifen-oplossing afgeschermd van het licht bij 4 °C voor maximaal één week.Verwarm de oplossing vóór toepassing, wat gedurende drie opeenvolgende dagen voor elke muis wordt herhaald. Los eerst één gram Tamoxifen-poeder op in vijf milliliter steriele dimethylsulfoxide. Om een oplossing van 200 milligram per milliliter te verkrijgen, plaatst u de oplossing in een schudwaterbad bij 65 °C tot deze helder wordt en laat u deze in het bad tot gebruik.Anestheseer vervolgens de muis en controleer de diepte van de anesthesie met een knijptest in de teen, breng oogsalf aan op het onbehandelde oog van de muis om uitdroging tijdens de procedure te voorkomen en dien adequate analgesica toe. Trek daarna 200 µL van de Tamoxifen-oplossing op in een spuit zonder naald en breng dit topisch aan over het gehele hoornvlies van het oog. De vloeistof stolt bij kamertemperatuur op het weefsel.Blijf bij de muis totdat deze in sternale recumbens ligt en plaats deze pas terug bij de andere dieren wanneer deze volledig bij bewustzijn is. Nadat de muizen op de juiste tijdstippen na inductie zijn opgeofferd, wordt een oogverwonding aangebracht zoals beschreven in het tekstprotocol. Enucleer het oog door eerst op het ooglid te drukken zodat de oogbol uit de kas springt.Schuif gebogen pincetten achter de oogbol om de oogzenuw vast te houden en trek de oogbol omhoog om deze los te maken. Plaats elke oogbol in een schaal van 60 millimeter met PBS. Plaats de plaat met de ogen onder een chirurgische stereomicroscoop.Zorg dat u de basisstructuur van het oog herkent, waaronder het hoornvlies, de limbus en de oogzenuw. Verwijder de oogzenuw, de spieren en het bindweefsel rondom het oog. Houd het oog vast bij het achterste gedeelte met het hoornvlies naar beneden gericht en maak met een veerschaar een incisie in de sclera aan de achterzijde van de oogbol.Vergroot de incisie zodat de lens eruit kan springen en verwijder de iris met een pincet. Maak vervolgens vier tot vijf radiale incisies door van het centrum naar de periferie te snijden om het hoornvlies af te vlakken en verwijder daarna eventuele resterende delen van de iris met een dunne vlakke spatel. Snijd tot slot het overtollige perifere weefsel rondom de limbus weg om het hoornvlies te fixeren.Breng het gedissecteerde weefsel over naar een 12-wells plaat en incubeer dit gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde. Was het weefsel vervolgens kort in PBS om de celkernen te kleuren. Incubeer het hoornvlies gedurende 10 minuten in een DPI-oplossing van 2 µg/mL, gevolgd door een korte wasstap in PBS.Plaats vervolgens het hoornvlies op een glazen objectglas met de epitheliale zijde naar boven. Plaats daarna een druppel monteermedium op het hoornvlies en dek dit af met een dekglas. Laat de preparaten een nacht drogen bij kamertemperatuur en bewaar ze bij vier graden Celsius.Gebruik voor cornea-imaging een spectraal confocaal systeem dat scheiding van RFP, YFP, GFP en CFP-emissies mogelijk maakt. Stel eerst de fluorescentie-, excitatie- en emissiegolflengten in op basis van de fluorescerende eiwitten van de hersenen. Bo cassette, waarbij u erop let dat kruisexcitatie of overlap van emissiesignalen wordt voorkomen.Verkrijg vervolgens betegelde beelden om het gehele hoornvlies in hoge resolutie te visualiseren. Maak hierbij een array van 12 bij 12 beelden in alle vier de fluorescentiekanalen. Voeg tenslotte de beelden samen om een samengestelde lineage te creëren.Traceringsexperimenten met R 26 R confetti-muizen werden uitgevoerd om het lot van progenitorcellen in het limbus- en cornea-epitheel te volgen. Onder steady-state-condities werden 10 dagen na inductie, zoals verwacht, kleine clusters van fluorescerende cellen waargenomen. Na vier maanden ontstonden er strepen van de limbus naar het centrum van het hoornvlies, wat suggereert dat cellen vanuit de limbus migreren om het hoornvlies te regenereren na een beschadiging van het hoornvlies.De migratie van de zaag vanuit de limbus verliep snel, waarbij binnen zeven dagen lange, dikke limbaire strepen ontstonden. Dit model is waardevol voor het volgen en bestuderen van corneale stam- en progenitorcellen onder verschillende omstandigheden. Het zal in de toekomst onderzoek mogelijk maken naar clonale celexpansie, overleving en migratie onder steady-state condities en onder stresscondities, zoals wondgenezing, chemische brandwonden, mutaties en meer.Dit model kan ook worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te ontleden die ten grond liggen aan normale en pathologische hoornvliesregeneratie. Deze techniek kan bijdragen aan ons begrip van verschillende pathologische aandoeningen, zoals hoornvliesdystrofieën, brandwonden en hoornvliestrauma, en daarnaast aan de evaluatie van de impact van verschillende behandelingen op hoornvliesregeneratie, celexpansie en migratie.

a-method-for-lineage-tracing-corneal-cells-using-multi-color

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

Source: Laboissonniere, et. al. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates a fluorescent tracing technique to identify retinal ganglion cell (RGC) subtypes in a transgenic mouse retina. The process involves securing the isolated retina in a recording chamber, maintaining cell viability with oxygenated perfusion, and targeting fluorescently labeled RGCs using a pipette with a tracer. By analyzing dendritic morphology and...

Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing

Cel organisatie van craniofaciale botten is al lang de hypothese, maar niet direct zichtbaar. Multispectrale cell labeling en in vivo levende   beeldvorming maakt visualisatie van de dynamische cel gedrag in de zebravis onderkaak. Hier hebben we detail het protocol te manipuleren Zebrabow transgene vis en direct waar te nemen cel intercalatie en morfologische veranderingen van chondrocyten in de Meckel's kraakbeen.

Visualisatie van Chondrocyte Intercalatie en Directional Proliferatie via Zebrabow Klonale Cell Analysis in het Embryonale Meckel&#39;s Kraakbeen

We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Hier presenteren we een protocol voor een mozaïek labeling techniek die de visualisatie van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke voorlopercel in twee verschillende kleuren mogelijk maakt. Dit vergemakkelijkt neurale stam analyse met de mogelijkheid van geboorte uit individuele neuronen en studeren genfunctie in dezelfde neuronen verschillende individuen.

Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Deze methode beschrijft het gebruik van het R26R-Confetti (Confetti) muismodel om gemineraliseerde weefsels te bestuderen, die alle stappen van de fokstrategie naar het beeld acquirements bedekken. Inbegrepen is een algemeen protocol dat kan worden toegepast op alle zachte weefsels en een gemodificeerd protocol dat kan worden toegepast op gemineraliseerde weefsels.

Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

Een protocol voor het uitvoeren van lijntracering en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op een celniveau met behulp van mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) wordt gepresenteerd. MADM kloonanalyse biedt een kwantitatief kader om het proliferative gedrag, cellulaire output en afstammingsrelatie van individuele voorlopers en hun dochtercellen te meten.

Lineage Tracing en klonnale analyse in het ontwikkelen van cerebrale cortex met behulp van Mozaïek Analyse met dubbele markers (MADM)

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Hier stellen we drie verschillende methoden voor om de sensorische vezels die het hoornvlies innerveren te beschadigen. Deze methoden vergemakkelijken de studie van axonregeneratie bij muizen. Deze drie methoden, die kunnen worden aangepast aan andere diermodellen, zijn ideaal voor de studie van de fysiologie en regeneratie van de innervatie van het hoornvlies.

Drie strategieën om neurotrofe keratitis en zenuwregeneratie in het hoornvlies van muizen te induceren

Leer een methode voor multi-kleur lineage tracing van hoornvliesepitheelcellen met R26R-Confetti muizen. Deze techniek volgt migratie en overleving van stamcellen niet-invasief.

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Meer video's verkennen