Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Het algemene doel van deze methode is om de migratie, expansie en overleving van stamcellen en voorlopercellen in het hoornvliesepitheel te lokaliseren en volgen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de biologie van hoornvliesepitheelcellen over homeostase, weefselherstel, veroudering en pathologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze gemakkelijk te implementeren is en niet-invasieve lijntraceringsmethoden van cellen op een clonale manier mogelijk maakt.

Begin met het selecteren van een Cree transgene muisstam met een induceerbare weefselspecifieke promotor om de limbale en hoornvlies epitheel voorlopercellen en stamcellen te labelen. De Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT lijn wordt gebruikt. Kies vervolgens de juiste brainbow cassette afhankelijk van de onderzoeksvraag en de beschikbare Cree lijn.

In dit geval wordt de Brainbow 2.1 lijn gebruikt. Kruis de homozygote R 26 R confetti stam met de homozygote K 14 Cree ERT stam om muizen te genereren met vierkleurige K 14 positieve cellen. Om recombinatie in de transgene muizen te induceren. Weeg eerst 80 milligram Tamoxifen af en los het op in één milliliter maïsolie door te Vortexen.

Plaats de oplossing in een schudwaterbad, gehouden op 65 graden Celsius totdat het volledig is opgelost en laat het in het bad tot het volgende gebruik. Anesthesiseer een acht weken oude Brainbow 2.1 Cree ERT heterozygote muis en controleer de diepte van de anesthesie. Breng voorzichtig 100 microliter van de Tamoxifen-oplossing aan op elk oogoppervlak van de muis. Directe toediening van Tamoxifen levert een hoge efficiëntie van Cree-inductie op. Bewaar eventueel overgebleven Tamoxifen-oplossing beschermd tegen licht bij vier graden Celsius gedurende maximaal een week.

Verwarm de oplossing voorafgaand aan het aanbrengen, wat wordt herhaald op drie opeenvolgende dagen voor elke muis. Los eerst één gram Tamoxifen-poeder op in vijf milliliter steriele dimethylsulfoxide. Om een oplossing van 200 milligram per milliliter te produceren, plaats de oplossing in een schudwaterbad, houd deze op 65 graden Celsius totdat deze helder wordt en laat het in het bad tot gebruik.

Anesthesiseer vervolgens de muis en controleer de diepte van de anesthesie met een teenprikje, breng oogzalf aan op het onbehandelde oog van de muis om het tijdens de procedure tegen uitdroging te beschermen en dien voldoende pijnstillers toe. Trek vervolgens 200 microliter van de Tamoxifen-oplossing op in een spuit zonder naald en breng het topisch aan over het gehele hoornvlies van het oog. De vloeistof stolt op kamertemperatuur op het weefsel.

Let op de muis totdat deze in sternal recumbent blijft en breng deze alleen terug naar de gezelschap van anderen als deze volledig bij kennis is. Na het opofferen van muizen op geschikte tijdstippen na inductie, een oogwond zoals beschreven in het tekstprotocol. Nucleateer het oog door eerst het ooglid in te drukken om het oogbol uit de oogkas te laten springen.

Schuif gekromde pincetten achter de oogbol om de oogzenuw vast te houden en trek de oogbol omhoog om deze los te maken. Plaats elke oogbol in een 60 millimeter schaal met PBS. Plaats de oogplaat onder een chirurgische stereomicroscoop.

Zorg ervoor dat u de basisstructuur van het oog herkent, de hoornvlies, limbus en de oogzenuw. Verwijder de oogzenuw, spier en bindweefsel rond het oog. Houd het oog bij de achterste delen met het hoornvlies naar beneden gericht en maak een incisie in de sclera aan de achterkant van de oogbol met behulp van veerschaar.

Vergroot de snede om de lens te laten uitspringen en verwijder de iris met pincetten. Maak vervolgens vier tot vijf radiale incisies door vanuit het centrum naar de periferie te snijden om het hoornvlies plat te maken en verwijder vervolgens eventuele resterende delen van de iris met een dunne, platte spatel. Snijd ten slotte het overtollige perifere weefsel rond de limbus om het hoornvlies te fixeren.

Breng het gedissekteerde weefsel over naar een 12-wellsplaat en incubeer het gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde. Was vervolgens het weefsel kort in PBS om de celkernen te kleuren. Incubeer het hoornvlies in twee microgram per milliliter DPI-oplossing gedurende 10 minuten, gevolgd door een korte wassing in PBS.

Plaats vervolgens het hoornvlies op een glasplaatje met de epitheliale zijde naar boven. Plaats vervolgens een druppel montagemiddel op het hoornvlies en bedek het met een dekglasje. Laat de plaatjes een nacht op kamertemperatuur drogen en bewaar ze bij vier graden Celsius.

Voor hoornvlisbeeldvorming gebruikt u een spectraal confocale systeem dat de scheiding van R-F-P-Y-F-P-G-F-P en CFP emissie mogelijk maakt. Stel eerst de fluorescentie, excitatie en emissiegolflengten in afhankelijk van de fluorescerende eiwitten van de brain. Bo cassette, zorg ervoor dat er geen kruisexcitatatie of overlapping van emissiesignalen optreedt.

Vervolgens worden getilede beelden verkregen om het hele hoornvlies in hoge resolutie te visualiseren. Hier verkrijgt u een matrix van 12 bij 12 beelden in alle vier de fluorescerende kanalen. Ten slotte worden de beelden samengevoegd om een samengesteld lijnage te maken.

Traceringsexperimenten met R 26 R confetti muizen werden uitgevoerd om het lot van limbale en hoornvlies epitheel voorlopercellen te volgen. Onder constante omstandigheden werden kleine clusters van fluorescerende cellen waargenomen 10 dagen na inductie zoals verwacht. Na vier maanden ontwikkelden zich strepen van de limbus naar het centrum van het hoornvlies, wat suggereert dat cellen van de limbus naar het hoornvlies migreren om het hoornvlies te regenereren na hoornvliesletsel.

Het werd waargenomen dat migratie van de limbus snel plaatsvond met lange, dikke limbale strepen die binnen zeven dagen ontstonden. Dit model is waardevol voor het volgen en bestuder