Name: Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Leer een FACS-gebaseerde methode om muizen dermale fibroblasten te isoleren zonder in vitro cultuur. Dit behoudt het native fenotype en helpt onderzoekers subtypen te identificeren die betrokken zijn bij littekenvorming en fibrose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund in het kader van een subsidie ​​van de NIH-subsidie ​​R01 GM087609 (tot HPL), een geschenk van Ingrid Lai en Bill Shu ter ere van Anthony Shu (tot HPL), NIH-subsidie ​​U01 HL099776 (tot MTL), de Hagey Laboratorium voor Pediatric Regenerative Medicine en The Oak Foundation (naar MTL, GCG en HPL). GGW werd gesteund door de Stanford School of Medicine, de Stanford Medical Scientist Training Program, en NIGMS training subsidie ​​GM07365. Znm werd gesteund door de Plastic Surgery Research Foundation Fellowship Grant en de Hagey Family Fund. MSH werd ondersteund door het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Klinische Fellow training subsidie ​​TG2-01159, de American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS) / kaakchirurgen Foundation (MSF) Research Grant Award en de Transplant en Tissue Engineering Fellowship Award.

Dit protocol volgt methoden door de Stanford University administratieve Panel on Laboratory Animal Care goedgekeurd. 1. Spijsvertering van Muriene Dermis <ol><li> Euthanaseren muizen door cervicale dislocatie na anesthesie met een intraperitoneale injectie van ketamine 100 mg / kg + xylazine 20 mg / kg acepromazine + 3 mg / kg. Let op: verschillende leeftijden en achtergronden kunnen worden gebruikt. </li><li> Scheren en ontharen de dorsale huid. Ongeveer 100.000 cellen kunnen worden geïsoleerd uit een stuk dorsale huid 60 mm x 100 mm. </li><li> Dompel de muis in 70% ethanol en leg ze op een schone, steriele ondergrond om te drogen. </li><li> Onmiddellijk oogsten dorsale huid van muizen met steriele ontleden schaar. Bij vrouwelijke muizen, vermijd waaronder de borstweefsel. </li><li> Starten van de basis van de staart, een tang om de tent op de huid en maken een dwarse snede voordat ontleden langs de supra-fascial vlak. </li><li> Zorgvuldig te voorkomen met inbegrip van onderhuids vet tijdens het oogstende huid. Onderzoekt de geoogste huid voor een onderhuids vet en voorzichtig schraap het uit met de botte kant van een scalpel. </li><li> Spoel de geoogste huid betadine, gevolgd door 5x PBS wasbeurten op ijs. Opmerking: Het is belangrijk de huid nabij steriel mogelijk om besmetting te voorkomen houden. </li><li> Hak de huid met behulp van scheermesjes en ontleden schaar in een steriele schotel totdat het monster van een uniforme consistentie met 2-3 mm stukken. </li><li> Bereid 50 ml conische buizen met 20 ml collagenase IV bij een concentratie van 1 mg / ml in DMEM. Verdeel de dermis in de buizen aan de hand van vijf muizen per buis. </li><li> Schud krachtig monsters gedurende incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur in ofwel een waterbad of oven. </li><li> Haal monsters uit de incubator en het passeren van een injectiespuit 10 ml zonder naald 3-5x in een steriele kap. </li><li> Plaats de monsters terug in de incubator bij 37 ° C en schud krachtig gedurende nog 30 min. </li><li> In een steriele kap, Pipet de monsters op en neer 3-5x met een pipet 10 ml. Pipetteer het monster door een 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis. </li><li> Pass 20 ml 10% FBS DMEM door hetzelfde filter te celopbrengst maximaliseren en breng het totale volume op 40 ml. Centrifugeer bij 300 g gedurende 8 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof met een steriele glazen pipet, waarbij grote zorg om eerst de bovenste vetlaag voorafgaand aan de resterende supernatant te verwijderen. Opmerking: Deze stap is cruciaal voor adipocyten besmetting te verminderen. </li><li> Resuspendeer de pellets in 20 ml DMEM 10% FBS. </li><li> Passeer de cel / DMEM suspensie door een 70 pm filter. </li><li> Spoel het filter met 10 ml DMEM 10% FBS en centrifugeer de gefilterde suspensie bij 300 g gedurende 8 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof met een steriele glazen pipet, opnieuw zorg ervoor dat eerst alle resterende vetlaag te verwijderen. </li><li> Als er significante RBC verontreiniging (de pellet zichtbaar rood), resuspendeer de pelletsin 20 ml ACK lysisbuffer en incubeer gedurende 5 min bij RT. Anders gaat u naar stap 24. </li><li> Voeg een gelijk volume (20 ml) van FACS-buffer (PBS, 10% FBS, 0,1% natriumazide), meng, en houd apart een 5 ml aliquot als ongekleurde control. Centrifugeer het resterende monster bij 300 g gedurende 8 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant en zet pellet op ijs. De cellen mogen worden ingevroren op dit punt als FACS moment niet beschikbaar. </li></ol> 2. Isolatie van fibroblasten door FACS <ol><li> Voeg 500 ul lineage antilichaam incubatie mix voor elke korrel. Doe dit door eerst 475 ui FACS-buffer bevattende DNase (10 ug / ml) tot een buis en vervolgens het toevoegen fluorofoor geconjugeerde CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (01:50), Ter -119 (1: 200), en EpCAM (1: 100) antilichamen tegen de respectievelijke verdunning van elk antilichaam te realiseren. </li><li> Re-schorten elke pellet in 500 ui van lijn antilichaam incubatie mix en incubeer deze opschorting op ijs gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 5ml FACS buffer met DNase (10 ug / ml) aan het monster en meng. Centrifugeer bij 300 g gedurende 8 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de supernatant en was de celpellet met 5 ml FACS-buffer bevattende DNase (10 ug / ml) en gecentrifugeerd onder dezelfde omstandigheden als in stap 26. </li><li> Resuspendeer de pellet in 500 ui FACS-buffer bevattende DNase (10 ug / ml) en zet opzij een 50 pi aliquot als levensvatbaarheid kleurstof control. </li><li> Voeg levensvatbaarheid kleurstof gekozen om de resterende monster in de voor de gekozen kleurstofconcentratie. </li><li> FACS-analyse uit te voeren 31 en sorteren voor levensvatbaarheid dye / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- cellen (zie figuur 2A). Sorteer direct in FACS buffer. </li></ol>

<ol><li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+diverse+population+at+the+center+of+it+all%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a diverse population at the center of it all.</a> International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts.+I.+Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease.</a> The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).</li>
<li>Wilson, M. S., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+fibrosis%3A+pathogenesis%2C+etiology+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation.</a> Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).</li>
<li>Hinz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblast%3A+one+function%2C+multiple+origins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The myofibroblast: one function, multiple origins.</a> The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).</li>
<li>Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts+in+wound+healing%3A+force+generation+and+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Viability%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement.</a> J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).</li>
<li>Wong, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+oral+mucosa+results+in+reduced+scar+formation+as+compared+with+skin%3A+evidence+from+the+red+Duroc+pig+model+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+regeneration+%3A+official+publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans.</a> Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).</li>
<li>Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+injury+responses+in+oral+mucosal+and+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds.</a> Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).</li>
<li>Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+fetal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Adult and fetal wound healing.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).</li>
<li>Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+skin+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fetal skin wound healing.</a> Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors%3A+wounds+that+do+not+heal.+Similarities+between+tumor+stroma+generation+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing.</a> The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).</li>
<li>Dumont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+fibroblasts+modulate+early+dissemination%2C+tumorigenesis%2C+and+metastasis+through+alteration+of+extracellular+matrix+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics.</a> Neoplasia. 15, 249-262 (2013).</li>
<li>Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sentinel+cells+to+inflammatory+culprits%3A+cancer-associated+fibroblasts+in+tumour-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation.</a> The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+cancer-stroma+interaction%3A+a+potential+approach+for+pancreatic+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+pharmaceutical+design%22%5BJournal%5D)">Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment.</a> Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).</li>
<li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity%3A+more+than+skin+deep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity: more than skin deep.</a> Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).</li>
<li>Cormack, D. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCormack%2C+DH+%22Ham%27s+Histology%22">Ham's Histology</a>. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).</li>
<li>Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal-epidermal+interactions.+Adult+follicle-derived+cell+populations+and+hair+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+clinics%22%5BJournal%5D)">Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth.</a> Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).</li>
<li>Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+dermal+sheath+cells%3A+unsung+participants+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing.</a> Lancet. 358, 1445-1448 (2001).</li>
<li>Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+bilayered+dermal+equivalent+containing+human+papillary+and+reticular+dermal+fibroblasts%3A+use+of+fluorescent+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes.</a> Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).</li>
<li>Harper, R. A., Grove, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+fibroblasts+derived+from+papillary+and+reticular+dermis%3A+differences+in+growth+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro.</a> Science. 204, 526-527 (1979).</li>
<li>Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+observation+of+fibroblasts+derived+from+the+papillary+and+reticular+dermis+of+infants+and+adults%3A+growth+kinetics%2C+packing+density+at+confluence+and+surface+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology.</a> Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).</li>
<li>Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-matched+papillary+and+reticular+human+dermal+fibroblasts+differ+in+their+release+of+specific+growth+factors%2Fcytokines+and+in+their+interaction+with+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes.</a> Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425(2013).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
<li>Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+a+Dermal+Lineage+with+Intrinsic+Fibrogenic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature protocols. 3, 799-810 (2008).</li>
<li>Klein, M., Fitzgerald, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+separation+of+intact+epidermal+sheets+from+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin.</a> The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).</li>
<li>Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((yThree+blocks+are+not+enough+-+Blocking+of+the+murine+IgG+receptor+FcgammaRIV+is+crucial+for+proper+characterization+of+cells+by+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis.</a> European journal of immunology. , (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De in dit manuscript beschreven protocol biedt een middel om fibroblasten geïsoleerd door FACS gebaseerde sortering, vergeleken met bestaande methoden, die hetzij selecteren voor een subpopulatie of tijd in celkweek vereisen voordat verdere analyses. De tijd vereist vanaf de oogst van de huid om het sorteren van fibroblasten ongeveer 6 uur; echter zal het aantal muizen gebruikt bij de oogst van deze schatting beïnvloeden. Een aantal punten in het protocol vereist bijzondere zorg. De eerste i...

Fibroblasten zijn dikwijls morfologisch gedefinieerd als spoelvormige cellen die hechten aan plastic substraten. Fibroblasten het principe soort cel verantwoordelijk voor het synthetiseren en remodeling de extracellulaire matrix in embryonale en volwassen organen 1. Fibroblasten zijn derhalve cruciaal voor de ontwikkeling van zoogdieren en substantieel bijdragen aan het extracellulaire milieu die het gedrag van naburige celtypen in elk weefsel en orgaan beïnvloedt. Fibroblasten zijn ook de belangrijkste celtype achter een gevarieerde set van medische aandoeningen die enorme ziektelast veroorzaken. Pathologische fibroblast activiteit belemmert normaal weefsel functie en omvat weefsels en organen fibrose (zoals de longen en lever), littekenvorming na cutane wondgenezing, atherosclerose, systemische sclerose, en de vorming van atheroomplaques na bloedvat letsel 2-5. Wondgenezing in het bijzonder, zowel acuut als chronisch, gaat deposition van littekenweefsel dat noch lijkt op noch functies zoals het normale weefsel eromheen, en leidt tot aanzienlijke morbiditeit in diverse pathologische toestanden. Na verwonding, er een overgang van fibroblasten naar myofibroblasten, die vervolgens afscheiden structurele ECM componenten uitoefenen paracriene effecten op naburige celtypen en mechanische stabiliteit te herstellen door het afzetten van littekenweefsel 6. In cutane weefsel bestaat er aanzienlijke variatie in de kwaliteit van wondherstel over ontwikkelingstijd en tussen anatomische plaatsen. In de eerste twee trimesters van het leven geneest de foetus zonder littekens; echter, het derde trimester aan en op volwassen leeftijd, mensen genezen een litteken. Site-specifieke, naast leeftijdsspecifieke verschillen in wondgenezing bestaan. Wonden in de mondholte verbouwen met minimale littekenvorming 7,8, terwijl littekenweefsel afzetting binnen cutane wonden significant is 9. Controverse blijft concerning de relatieve invloed van de omgeving ten opzichte van de intrinsieke eigenschappen van lokale fibroblasten van de uitkomst van wondgenezing met betrekking tot zowel leeftijd als locatie 10,11. Gezien de aanzienlijke verschillen in de genezing van muis orale vs. cutane dermis en minder embryonale (E15) vs. latere embryonale (E18) dermis, is het waarschijnlijk dat de intrinsieke verschillen in de populaties van fibroblasten op bepaalde ontwikkelingsleeftijd en over verschillende anatomische plaatsen bestaan . In 1986 Harold F. Dvorak geponeerd tumoren zijn wonden die niet genezen 12. Dvorak geconcludeerd dat tumoren gedragen als wonden in het lichaam induceren hun stroma door activering van de wondheling respons van de gastheer. Talrijke studies hebben sindsdien onderzocht de bijdrage van fibroblasten om de progressie van carcinomen 13-15, maar zoals bij wondgenezing, de identiteit en embryonale oorsprong van de fibroblasten die bijdragen aan het stromale compartiment van cutane carcinomas is niet voldoende gedefinieerd. Het antwoord op deze vraag draagt ​​medisch belang aangezien recente studies blootstellen van de tumor-geassocieerde fibroblasten als een potentieel effectieve doelwit voor anti-kankertherapie 16. Identificeren en prospectief het isoleren van de fibroblast geslachten begiftigd met fibrogene potentieel in vivo is een essentiële stap op weg naar effectief manipuleren hun reactie op letsel in een breed scala van acute en chronische ziekten. In 1987, Cormack aangetoond twee subpopulaties van fibroblasten, één die binnen de papillaire en één in de reticulaire dermis 17,18. Een derde subpopulatie bleek geassocieerd met haarfollikels in de huidpapilla regio van de follikel 19,20. Wanneer gekweekt, deze fibroblast subtypen vertonen verschillen in groeipotentieel, morfologie en groeifactor / cytokinen profielen 21-24. Tot op heden, studies naar fibroblast hijterogeneity zijn grotendeels gefaald om adequaat te typeren ontwikkelings- en functionele diversiteit onder fibroblasten in vivo. Dit is deels het gevolg van een afhankelijkheid van gekweekte fibroblasten populaties en homogeniseren effect van celkweek of positieve selectie op basis van een zelf oppervlaktereceptor niet alle fibroblasten 25 uitgedrukt. Een recente studie van ons laboratorium aangetoond een diepe oppervlak marker en transcriptie verschuiving in gekweekte versus onbeschaafde fibroblasten geïsoleerd door de FACS gebaseerde isolatie methodiek die in dit manuscript 26. Vervolgens identificeerden we een specifiek fibroblast geslacht binnen de muriene dorsale dermis en vastgesteld dat deze lijn, gedefinieerd door embryonale expressie van Engrailed-1, primair verantwoordelijk bindweefsel vormen in de dorsale huid. De lineage functies tijdens zowel acute als chronische vormen van fibrose waaronder wondheling, kanker stroma vorming enstraling veroorzaakte fibrose 27. De karakterisering van verschillende fibroblast geslachten heeft kritieke implicaties voor therapieën die gericht zijn op het moduleren fibrogene gedrag. In plaats van bestaande protocollen die berusten op in vitro manipulatie celisolatie 28,29 verwezenlijken, zal de oogst protocol (figuur 1) hier beschreven opbrengst informatieve analyses van fibroblasten die nauwkeuriger fenotype en gedrag in vivo te vangen.

<table><tbody><tr><td>Surgical Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>Micro-scissors</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine Prep Solution</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair (depilatiecrème)</td><td>Church and Dwight Co.</td><td>22600267058</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Abcam</td><td>ab95133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysering buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>propidium jodide (PI levensvatbaarheidskleuring)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

muizen dermaal fibroblast isolation door facs

 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasten zijn het principe celtype belast afscheiden extracellulaire matrix en zijn een kritische component van vele organen en weefsels. Fibroblast fysiologie en pathologie grondslag een spectrum van klinische entiteiten, zoals fibrose in meerdere organen, hypertrofische littekenvorming na brandwonden, verlies van hartfunctie na ischemie en de vorming van kanker stroma. Echter, fibroblasten blijft een slecht gekarakteriseerde type cel, grotendeels te wijten aan hun inherente heterogeniteit. Bestaande werkwijzen voor het isoleren van fibroblasten tijd nodig in celcultuur die diep beïnvloedt celfenotype en gedrag. Bijgevolg, veel onderzoeken naar fibroblast biologie vertrouwen op in vitro manipulatie en niet nauwkeurig fibroblast gedrag in vivo vast te leggen. Om dit probleem te overwinnen, ontwikkelden we een op FACS gebaseerde protocol voor de isolatie van fibroblasten uit de dorsale huid van volwassen muizen die celkweek niet vereist, waardoor preserving de fysiologische transcriptie en proteomics profiel van elke cel. Onze strategie zorgt voor uitsluiting van niet-mesenchymale lijnen via een geslacht negatieve gate (Lin -) in plaats van een positieve selectie strategie om de pre-selectie of verrijking van een subpopulatie van fibroblasten voorkomen expressie van specifieke oppervlakte markers en zo inclusief mogelijk over dit heterogene celtype.

De geldigheid van deze benadering (figuur 1) is geverifieerd in een aantal manieren, die in detail kunnen worden onderzocht in onze recente publicatie 27. Deze omvatten immunocytochemie van gesorteerde cellen en massa-cel en enkele cel transcriptie analyse van vers gesorteerde cellen. Sorteren fibroblasten direct plaats van te vertrouwen op de cultuur beter vangt hun in vivo fenotype. Met behulp van een lineage negatieve uitputting aanpak (Figuur 2A) in plaats van een positieve selectie ...

Fibroblastgedrag ligt ten grondslag aan een spectrum van klinische entiteiten, maar ze blijven slecht gekarakteriseerd, grotendeels vanwege hun inherente heterogeniteit. Traditioneel fibroblastenonderzoek is afhankelijk van in vitro manipulatie, waardoor in vivo fibroblastgedrag wordt gemaskeerd. We beschrijven een FACS-gebaseerd protocol voor de isolatie van muishuidfisbroblasten dat geen celcultuur vereist.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Het algemene doel van deze procedure is om fibroblasten te isoleren met behulp van FACS, waardoor in vitro culturen worden vermeden, waarvan is aangetoond dat ze een fenotypische verandering in deze cellen veroorzaken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie en wondgenezing, zoals het identificeren van fibroblast-subtypes die betrokken zijn bij littekenvorming en fibrose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat in vitro experimenten worden vermeden, aangezien hechting aan plastic leidt tot een verandering in het fenotype van de fibroblast.Deze methode kan niet alleen inzicht verschaffen in dermale fibroblasten, maar kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals peritoneale fibroblasten en abdominale adhesies. Begin met het scheren en ontharen van de dorsale huid van de betreffende muis. Dompel de onthaarde muis vervolgens onder in 70% ethanol en plaats het dier op een schoon, steriel oppervlak om te drogen.Gebruik vervolgens, beginnend bij de basis van de staart, een pincet om de huid op te tillen en maak met een dissectieschaar een transversale snede. Disseceer daarna langs het suprafasciale vlak om het dorsale weefsel te oogsten. Wanneer er een stuk huid van 60 bij 100 millimeter is verwijderd, gebruikt u de stompe zijde van een scalpel om eventueel onderhuids vet voorzichtig te verwijderen.Spoel vervolgens de geoogste huid met betadine, gevolgd door vijf PBS-wasbeurten op ijs. Versnij de stukken dermis met scheermesjes en dissectiescharen in een steriele schaal totdat de monsters uniform ongeveer twee tot drie millimeter groot zijn. Draag vervolgens weefselfragmenten van maximaal vijf muizen over naar het juiste aantal individuele conische buizen van 50 milliliter die 20 milliliter collagenase 4 in dmem bevatten.Schud de monsters krachtig bij 37 °C. Na één uur worden de buisjes naar een steriele zuigenkast overgebracht en worden de weefselvlokken drie tot vijf keer door een naaldloze spuit van 10 mL geperst. Plaats de monsters opnieuw in de schudmachine voor nog 30 minuten, gevolgd door nog drie tot vijf keer pipetteren met een spuit van 10 mL.Filter de monsters vervolgens door een zeef van 100 micron in een nieuwe buis van 50 milliliter en was het gaas met 20 milliliter dmem, aangevuld met FBS om het totale volume op 40 milliliter te brengen. Centrifugeer daarna de cellen en gebruik een steriele glaspipet om de bovenste vetlaag af te zuigen. Wanneer de verontreinigende vetresten zijn verwijderd, gebruikt u een nieuwe glaspipet om de rest van het supernatant te verwijderen en resuspendeert u de pellets in 20 milliliter dmem plus FBS.Filter de cellen nu door een zeef van 75 micron en spoel het gaas af met 10 milliliters DMEM plus FBS. Centrifugeer de cellen vervolgens opnieuw en verwijder het vet en het supernatant zoals zojuist gedemonstreerd. Resuspendeer het pellet in 20 milliliters FACS-buffer en zet een aliquot van vijf milliliter apart voor de ongekleurde controle.Centrifuge vervolgens het resterende monster, verwijder het supernatant en plaats de pellet op ijs. Om de fibroblasten via FACS te isoleren, worden de pellets op ijs resuspendeerd in 500 µL incubatiemix voor lineage-antilichamen. Meng na 20 minuten voorzichtig vijf milliliter FACS-buffer, aangevuld met DNase, met de cellen en centrifugeer deze.Was het pellet in een tweede volume van vijf milliliter DNase. Resuspendeer de cellen vervolgens in 500 µL FACS-buffer en DNase, waarbij een aliquot van 50 µL cellen wordt gereserveerd voor de controle van de levensvatbaarheidsmeting. Voeg tot slot de levensvatbaarheidskleurstof toe aan de resterende monsterinhoud en sorteer de cellen volgens het diagram.Door gebruik te maken van een lineage-negatieve depletie-aanpak in plaats van een positieve selectie-aanpak, wordt voorkomen dat er vooraf wordt geselecteerd op specifieke subpopulaties. Pull-transcriptoom microarray-analyse onthult dat gekweekte fibroblasten, geïsoleerd via de methodieken van live oogst en weefsel-explantaten, een hoge mate van overeenkomst vertonen op transcriptoom-breed niveau, met een Pearson-product-moment-correlatiecoëfficiënt van 0,92. In vergelijking hiermee verschilden gekweekte fibroblasten significant van een live geoogste ongekweekte fibroblast, wat het belang onderstreept van het analyseren van live geoogste fibroblasten boven gekweekte fibroblasten.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van ontwikkelingsbiologie en wondgenezing om de heterogeniteit van fibroblasten te bevestigen en subpopulaties te identificeren die verantwoordelijk zijn voor littekenvorming en andere vormen van fibroses.

murine-dermal-fibroblast-isolation-by-facs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Cancer Associated Fibroblasten (CAF) te vergemakkelijken tumorinitiatie, groei en progressie door te geven dat bevordert de proliferatie, angiogenese en ontsteking. Hier beschrijven we een methode om pure populaties van normale fibroblasten en CAF isoleren van verse muis en humane weefsels door celsortering, met PDGFRα als oppervlaktemerker.

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

This video describes the rapid method to isolate and culture the melanocytes and fibroblast simultaneously from the postnatal mouse pup’s skin. These cells can be maintained and manipulated in vitro to study skin cell biology, wound healing, and melanoma.

Rapid Culturing of Primary Murine Melanocytes and Fibroblasts: Isolating Melanocytes and Fibroblasts from Whole Murine Skin Sample

Een ideaal model voor het bestuderen van de biologie van volwassen stamcellen is de muis haarfollikel. Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van verschillende populaties van haarfollikelstamcellen en epidermale keratinocyten, met behulp van enzymatische vertering van de dorsale muishuid gevolgd door FACS-analyse.

Isoleren haarfollikel stamcellen en epidermale keratinocyten van Dorsale Mouse Skin

Dit manuscript beschrijft een FACS-gebaseerd protocol voor isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid. Het omzeilt in vitro cultuur die onvermijdelijk was met de algemeen gebruikte isolatie protocol via explant culturen. De afkomstige fibroblast subsets zijn functioneel onderscheiden en display differentieel genexpressie en lokalisatie binnen de dermis.

Isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid door fluorescentie-geactiveerde cel het sorteren

Dit protocol schetst een snelle methode voor het gelijktijdig genereren van melanocyt en fibroblast culturen uit de huid van 0-4 dag oude muizen. Deze primaire culturen kunnen in vitro worden gehandhaafd en gemanipuleerd om een verscheidenheid aan fysiologisch relevante processen te bestuderen, waaronder huidcelbiologie, pigmentatie, wondgenezing en melanoom.

Snelle aanmaak van primaire Murine melanocyten en fibroblast-culturen

We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Het verkrijgen van een zuivere populatie van fibroblasten is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in wondherstel en fibrose. Hier beschreven is een gedetailleerde methode om fibroblasten en myofibroblasten te isoleren van niet gewonde en gewonde muisharten, gevolgd door karakterisering van hun zuiverheid en functionaliteit door immunofluorescentie, RTPCR, fluorescentie-ondersteunde cel sorteren, en collageen gel contractie.

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

Dit artikel beschrijft een op explantcultuur gebaseerde methode voor de isolatie en kweek van primaire, patiëntspecifieke menselijke aorta gladde spiercellen en dermale fibroblasten. Verder wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor het meten van celcontractie en daaropvolgende analyse, die kan worden gebruikt om patiëntspecifieke verschillen in deze cellen te bestuderen.

Isolatie van primaire patiëntspecifieke gladde spiercellen van aorta en semikwantitatieve real-time contractiemetingen in vitro

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om verouderde muistraanklieren te dissociëren om levensvatbare individuele cellen te verkrijgen voor single-cell RNA-sequencing. Sequentiële enzymatische vertering en voorzichtige behandeling behouden de celintegriteit, wat hoogwaardige suspenties oplevert die geschikt zijn voor celtype-specifieke isolatie en transcriptomische analyse van verouderingsgerelateerde veranderingen in traanklierpopulaties.

Protocol voor single-cel dissociatie, RNA-sequencing en isolatie van myoepitheelcellen en fibroblasten uit de verouderde klieren van het klieren van het lakcrimale en speeksel.

Leer een FACS-gebaseerde methode om muizen dermale fibroblasten te isoleren zonder in vitro cultuur. Dit behoudt het native fenotype en helpt onderzoekers subtypen te identificeren die betrokken zijn bij littekenvorming en fibrose.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Meer video's verkennen