De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy
1 maart 2016
Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.
Het algemene doel van deze procedure is om menselijk geëngend hartweefsel van een gedefinieerde cellulaire samenstelling te creëren. Deze methode kan sleutel uitdagingen in het veld van hartweefsel engineering aanpakken, inclusief het beheersen van variabiliteit en efficiëntie van hartdifferentiatie en het begrijpen hoe specifieke celtypen de hartcontractiele functie beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eindresultaat menselijk geëngend hartweefsel is met een gecontroleerde en gedefinieerde samenstelling.
Replicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken naar therapie voor hartziekten omdat gedefinieerde weefsels een nieuwe, biologisch relevante en biomedische screeningsplatform kunnen bieden die therapeutische interventies kan evalueren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in nieuwe harttherapieën, kan het menselijk geëngend hartweefsel systeem ook worden gebruikt om mechanismen van hartceltherapie te begrijpen. Begin met menselijk embryonaal stamcel-afgeleide cardiomyocyten culturen, was de cellen één keer met PBS en voeg één milliliter van 0,04% trypsin-EDTA toe.
Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Wanneer de cellen incuberen, voeg 12 microliters van ROCK-remmer toe aan zes milliliter trypsineneutralisatieoplossing. Verwijder de platen uit de incubator en voeg één milliliter van de neutralisatieoplossing toe aan elke put van de zes-welplate.
Breng alle cellen van elke put over in een enkele 15-milliliter centrifugeerbuis. Was alle zes putten met één drie-milliliter volume PBS en combineer deze was met de cellen in de buis. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 300 keer G bij vier graden Celsius om de cellen te pelleten.
Om de cellen voor te bereiden op live celsortering door FACS, bereid de kleuringsbuffer voor door vijf milliliter FBS en 50 microliters ROCK-remmer toe te voegen aan 45 milliliter PBS op ijs. Verwijder het supernatant van de gepelletiseerde cellen en suspendeer ze in 1,2 milliliter kleuringsbuffer. Breng 200 microliters van de gesuspendeerde cellen over in een nieuwe voorgekoelde 50-milliliter centrifugeerbuis op ijs.
Breng vervolgens het resterende één milliliter van de celsuspensie over in een nieuwe voorgekoelde 50-milliliter centrifugeerbuis op ijs en voeg twee microliters van SIRP alpha-PE/Cy7 en vier microliters van CD90-FITC antilichamen toe. Meng de celsuspensie voorzichtig met een overdrachtpipet en plaats de buis op ijs. Incubeer de twee 50-milliliter buizen die de negatieve controle en het monster bevatten op een roerder op ijs bij vier graden Celsius gedurende één uur.
Terwijl de cellen incuberen, breng drie milliliter differentiatiemedium twee keer over in elk van twee 15-milliliter centrifugeerbuizen. Voeg vervolgens drie microliters ROCK-remmer toe en bewaar deze FACS-opvangbuizen op ijs voor gebruik. Pellet vervolgens de gekleurde cellen bij 300 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
En was ze twee keer met 10 milliliter ijskoud PBS. Resuspendeer voorzichtig het monsterspellet met een tot drie milliliter kleuringsbuffer met DAPI. Voeg 500 microliters kleuringsbuffer zonder DAPI toe aan het negatieve controlepellet.
Filter beide celsuspensies door een 40-micron celzeef om celklonten te verwijderen en breng ze vervolgens over in polystyreen FACS-buizen op ijs. Breng de monsters onmiddellijk naar de celsorteerder. Begin met het negatieve kleuringscontrolemonster om de gatingparameters vast te stellen.
Selecteer vervolgens, terwijl u de monstercellen laat lopen, voor de DAPI-negatieve levende celpopulatie. Verzamel zowel de FITC-positieve als PE/Cy7-positieve celpopulaties onafhankelijk bij 20 PSI. Na het kweken en reaggregatie van cellen, zoals aangegeven in het tekstprotocol, verwijder de celcultuurplaten uit de incubator en breng het medium over in een 50-milliliter centrifugeerbuis.
Was de platen met drie milliliter PBS en breng de was naar dezelfde 50-milliliter centrifugeerbuis. Voeg vervolgens drie milliliter van 0,04% trypsin-EDTA toe aan de platen en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Controleer na vijf minuten de platen op celafscheiding met een microscoop.
Zodra alle cellen zijn losgelaten, voeg drie milliliter trypsineneutralisatieoplossing toe aan de platen. Meng voorzichtig en breng de cellen over in de originele 50-milliliter centrifugeerbuis. Was de platen met vijf milliliter PBS en voeg deze was toe aan de buis.
Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en suspendeer het pellet in één milliliter neonataal bovien serum of NBS-medium. Breng vervolgens de cellen over in een 1,5-milliliter microcentrifugebuis.
Pellet de cellen bij 300 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Om de zes geëngde hartweefsels te beginnen genereren, verdun 60,0 microliters van de vijf milligram per milliliter collageenstock tot 3,125 milligram per milliliter met 1,5 microliters van één molaire natriumhydroxide, 9,6 microliters van 10X PBS en 24,9 microliters steriele ultrapure water. Hierbij is het van cruciaal belang om de introductie van luchtbellen in de collageenmix te vermijden, aangezien de luchtbellen langzaam vrijkomen uit de viskeuze oplossing en kunnen interfereren met weefselvorming tijdens weefselcompactie.
Pipet de zijkant van de 15-milliliter buis af om 12,0 microliters van 10X MEM en 0,2 normale hoop op pH 9 toe te voegen om het collageenmengsel te verdunnen. Voeg vervolgens de basement membraanmatrix toe aan het collageenmengsel tot een eindconcentratie van 0,9 milligram per milliliter en meng voorzichtig. Bewaar deze laatste weefselmix op ijs.
Breng vervolgens de volledige weefselmix over naar de cellenpellet en voeg aanvullende cellen toe zoals aangegeven in het tekstprotocol. Vul de buis tot een eindvolume van 150 microliters met celvrij NBS-medium en meng voorzichtig. Pipet voorzichtig 25 microliters van de celsuspensie in elk van de zes
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde, genetisch gemodificeerde hartweefsels met behulp van oppervlaktemarkerexpressie en cel sortering. Deze weefsels kunnen worden gebruikt in een multi-weefselbioreactor om mechanismen van cardiale celtherapie te onderzoeken, wat een functioneel en gecontroleerd model van het menselijk hart biedt.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Hartweefseltechniek
- Cel sorteertechnieken
- Cardiale celtherapie
Achtergrond
- Uitdagingen bij cardiac tissue engineering omvatten variabiliteit en differentiatie-efficiënties.
- Het begrijpen van de impact van specifieke celtypen op de hartfunctie is cruciaal.
- Door de mens ontworpen hartweefsels kunnen dienen als een biologisch relevant screeningsplatform.
- Dit onderzoek heeft tot doel therapeutische interventies voor hartaandoeningen te verbeteren.
Doel van de studie
- Creëer door mensen ontworpen hartweefsels met een gedefinieerde cellulaire samenstelling.
- Evalueer therapeutische interventies voor hartaandoeningen.
- Begrijp de mechanismen van cardiale celtherapie.
Gebruikte methoden
- Begin met cardiomyocyte-culturen afgeleid van menselijke embryonale stamcellen.
- Was de cellen met PBS en behandel deze met trypsine-EDTA.
- Gebruik de expressie van oppervlaktemarkers voor cel sortering.
- Implementeer een multi-weefsel bioreactor voor functionele analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvol gemanipuleerde hartweefsels gecreëerd met een gecontroleerde samenstelling.
- Het vermogen aangetoond om de contractiele hartfunctie te evalueren.
- Inzichten verschaft in nieuwe cardiale therapeutica.
- Een platform opgezet voor het begrijpen van de mechanismen van cardiale celtherapie.
Conclusies
- De gedefinieerde engineered cardiac tissues vertegenwoordigen een significante vooruitgang in de cardiac tissue engineering.
- Deze methode kan helpen bij het aanpakken van variabiliteit in studies naar hartweefsel.
- Toekomstige toepassingen kunnen therapeutische strategieën voor hartaandoeningen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode stelt biopharma R&D in staat om menselijke hartweefsels te genereren met een nauwkeurig gecontroleerde cellulaire samenstelling, waardoor een kritisch tekort in de getrouwheid van preklinische modellen wordt opgelost. Door de verhouding tussen cardiomyocyten en fibroblasten te definiëren en therapeutische celtypen zoals hMSCs op te nemen, ondersteunt het systeem het mechanistische risicobeheer van hypothesen over celtherapie. Het biedt een translationeel relevant platform voor het evalueren van paracriene effecten en heterocellulaire interacties voorafgaand aan kostbare in vivo studies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door variabelen, zoals de hMSC-concentratie, te isoleren in een gedefinieerd menselijk myocardmodel.
- Operationele waarde: Vermindert biologische ruis van ongedefinieerde celpopulaties, waardoor het vertrouwen in de validatie van targets wordt vergroot.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door reacties van engineered weefsels te koppelen aan mechanistische werkingsmechanismen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief contractiele weefsels met meetbare twitch-krachtoutputs voor screening van verbindingen of cellen.
- Operationele waarde: Het bioreactorformaat maakt parallelle kweek van zes weefsels mogelijk, wat de doorvoer en reproduceerbaarheid verhoogt.
- Assay-gereedheid: Produceert gestandaardiseerde, matrix-gedefinieerde weefsels die geschikt zijn voor longitudinale functionele monitoring.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Maakt gebruik van klinisch relevante hMSC's om paracriene mechanismen te modelleren die worden onderzocht in proeven met cardiale celtherapie.
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt hoe specifieke celtypen de contractiele functie verbeteren, wat bijdraagt aan beslissingen over dosering en timing.
- Ziekte-relevant Systeem: Recapituleert belangrijke aspecten van de biofideliteit van het menselijk myocard voor preklinische effectiviteitstests.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische mechanistische studies, in het bijzonder voor celtherapiemodaliteiten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over hoe stromale cellen of stamcellen de functie van cardiomyocyten moduleren in een menselijke context.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde beoordeling van de contractiele functie mogelijk als functionele readout voor bioactieve agentia.
- Analytica: Levert metingen van de twitchkracht (5–15 µN) als kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor het vergelijken van condities.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van hMSC's bij een supplementatie van 10% om verkennende ratio's in mechanismen van celtherapie te spiegelen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Het gedefinieerde weefselformaat kan worden aangepast voor projecten die verschillende cel-celinteracties of therapeutische modaliteiten bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in heterocellulaire interacties te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door een exacte definitie van de cellulaire en extracellulaire matrix.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige, mens-relevante functionele gegevens over celtherapiemechanismen te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door non-responders of synergetische combinaties te identificeren voorafgaand aan dierstudies.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamceldifferentiatie, flowcytometrie en tissue engineering.
- Afhankelijk van toegang tot FACS-instrumentatie, collageenmatrices en bioreactorsystemen met krachtsensoren.
- Vereist standaardisatie van gating-strategieën voor cel sorteren en weefselmengprotocollen tussen teams.
- Aanpassing aan andere celtypen kan validatie van oppervlaktemarkers en matrixcompatibiliteit vereisen.
- De tijdlijn voor weefselrijping (~10 dagen na constructie) moet worden meegenomen in de experimentele planning.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Cell Culture and Sorting of Differentiated Cardiomyocytes
4:50
Collection of Reaggregated Cardiac Cells
6:32
Generation of Human Engineered Cardiac Tissues
9:45
Results: Contractile Force Measurement Using Human Engineered Cardiac Tissues
11:05
Conclusion
