De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy
March 1st, 2016
Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.
Het algemene doel van deze procedure is om menselijk geëngend hartweefsel van een gedefinieerde cellulaire samenstelling te creëren. Deze methode kan sleutel uitdagingen in het veld van hartweefsel engineering aanpakken, inclusief het beheersen van variabiliteit en efficiëntie van hartdifferentiatie en het begrijpen hoe specifieke celtypen de hartcontractiele functie beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eindresultaat menselijk geëngend hartweefsel is met een gecontroleerde en gedefinieerde samenstelling.
Replicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken naar therapie voor hartziekten omdat gedefinieerde weefsels een nieuwe, biologisch relevante en biomedische screeningsplatform kunnen bieden die therapeutische interventies kan evalueren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in nieuwe harttherapieën, kan het menselijk geëngend hartweefsel systeem ook worden gebruikt om mechanismen van hartceltherapie te begrijpen. Begin met menselijk embryonaal stamcel-afgeleide cardiomyocyten culturen, was de cellen één keer met PBS en voeg één milliliter van 0,04% trypsin-EDTA toe.
Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Wanneer de cellen incuberen, voeg 12 microliters van ROCK-remmer toe aan zes milliliter trypsineneutralisatieoplossing. Verwijder de platen uit de incubator en voeg één milliliter van de neutralisatieoplossing toe aan elke put van de zes-welplate.
Breng alle cellen van elke put over in een enkele 15-milliliter centrifugeerbuis. Was alle zes putten met één drie-milliliter volume PBS en combineer deze was met de cellen in de buis. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 300 keer G bij vier graden Celsius om de cellen te pelleten.
Om de cellen voor te bereiden op live celsortering door FACS, bereid de kleuringsbuffer voor door vijf milliliter FBS en 50 microliters ROCK-remmer toe te voegen aan 45 milliliter PBS op ijs. Verwijder het supernatant van de gepelletiseerde cellen en suspendeer ze in 1,2 milliliter kleuringsbuffer. Breng 200 microliters van de gesuspendeerde cellen over in een nieuwe voorgekoelde 50-milliliter centrifugeerbuis op ijs.
Breng vervolgens het resterende één milliliter van de celsuspensie over in een nieuwe voorgekoelde 50-milliliter centrifugeerbuis op ijs en voeg twee microliters van SIRP alpha-PE/Cy7 en vier microliters van CD90-FITC antilichamen toe. Meng de celsuspensie voorzichtig met een overdrachtpipet en plaats de buis op ijs. Incubeer de twee 50-milliliter buizen die de negatieve controle en het monster bevatten op een roerder op ijs bij vier graden Celsius gedurende één uur.
Terwijl de cellen incuberen, breng drie milliliter differentiatiemedium twee keer over in elk van twee 15-milliliter centrifugeerbuizen. Voeg vervolgens drie microliters ROCK-remmer toe en bewaar deze FACS-opvangbuizen op ijs voor gebruik. Pellet vervolgens de gekleurde cellen bij 300 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
En was ze twee keer met 10 milliliter ijskoud PBS. Resuspendeer voorzichtig het monsterspellet met een tot drie milliliter kleuringsbuffer met DAPI. Voeg 500 microliters kleuringsbuffer zonder DAPI toe aan het negatieve controlepellet.
Filter beide celsuspensies door een 40-micron celzeef om celklonten te verwijderen en breng ze vervolgens over in polystyreen FACS-buizen op ijs. Breng de monsters onmiddellijk naar de celsorteerder. Begin met het negatieve kleuringscontrolemonster om de gatingparameters vast te stellen.
Selecteer vervolgens, terwijl u de monstercellen laat lopen, voor de DAPI-negatieve levende celpopulatie. Verzamel zowel de FITC-positieve als PE/Cy7-positieve celpopulaties onafhankelijk bij 20 PSI. Na het kweken en reaggregatie van cellen, zoals aangegeven in het tekstprotocol, verwijder de celcultuurplaten uit de incubator en breng het medium over in een 50-milliliter centrifugeerbuis.
Was de platen met drie milliliter PBS en breng de was naar dezelfde 50-milliliter centrifugeerbuis. Voeg vervolgens drie milliliter van 0,04% trypsin-EDTA toe aan de platen en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Controleer na vijf minuten de platen op celafscheiding met een microscoop.
Zodra alle cellen zijn losgelaten, voeg drie milliliter trypsineneutralisatieoplossing toe aan de platen. Meng voorzichtig en breng de cellen over in de originele 50-milliliter centrifugeerbuis. Was de platen met vijf milliliter PBS en voeg deze was toe aan de buis.
Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en suspendeer het pellet in één milliliter neonataal bovien serum of NBS-medium. Breng vervolgens de cellen over in een 1,5-milliliter microcentrifugebuis.
Pellet de cellen bij 300 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Om de zes geëngde hartweefsels te beginnen genereren, verdun 60,0 microliters van de vijf milligram per milliliter collageenstock tot 3,125 milligram per milliliter met 1,5 microliters van één molaire natriumhydroxide, 9,6 microliters van 10X PBS en 24,9 microliters steriele ultrapure water. Hierbij is het van cruciaal belang om de introductie van luchtbellen in de collageenmix te vermijden, aangezien de luchtbellen langzaam vrijkomen uit de viskeuze oplossing en kunnen interfereren met weefselvorming tijdens weefselcompactie.
Pipet de zijkant van de 15-milliliter buis af om 12,0 microliters van 10X MEM en 0,2 normale hoop op pH 9 toe te voegen om het collageenmengsel te verdunnen. Voeg vervolgens de basement membraanmatrix toe aan het collageenmengsel tot een eindconcentratie van 0,9 milligram per milliliter en meng voorzichtig. Bewaar deze laatste weefselmix op ijs.
Breng vervolgens de volledige weefselmix over naar de cellenpellet en voeg aanvullende cellen toe zoals aangegeven in het tekstprotocol. Vul de buis tot een eindvolume van 150 microliters met celvrij NBS-medium en meng voorzichtig. Pipet voorzichtig 25 microliters van de celsuspensie in elk van de zes
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van oppervlaktemarkerexpressie en celsortering. Deze weefsels kunnen worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken, waardoor een functioneel en gecontroleerd model van het menselijk hart wordt geboden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hartweefsel engineering
- Celsorteringstechnieken
- Hartceltherapie
Achtergrond
- Uitdagingen in hartweefsel engineering omvatten variabiliteit en differentiatie-efficiënties.
- Begrip van de impact van specifieke celtypen op hartfunctie is cruciaal.
- Geëngineerde menselijke hartweefsels kunnen dienen als een biologisch relevant screeningplatform.
- Dit onderzoek heeft tot doel therapeutische interventies voor hartziekten te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Menselijke geëngineerde hartweefsels creëren met gedefinieerde cellulaire samenstelling.
- Therapeutische interventies voor hartziekten evalueren.
- Mechanismen van hartceltherapie begrijpen.
Gebruikte methoden
- Begin met humane embryonale stamcel-afgeleide cardiomyocyten culturen.
- Was cellen met PBS en behandel met trypsin-EDTA.
- Gebruik oppervlaktemarkerexpressie voor celsortering.
- Implementeer een multi-weefsel bioreactor voor functionele analyse.
Belangrijkste resultaten
- Met succes geëngineerde hartweefsels gecreëerd met gecontroleerde samenstelling.
- De mogelijkheid aangetoond om hartcontractiele functie te evalueren.
- Inzichten geboden in nieuwe harttherapieën.
- Een platform gevestigd voor het begrijpen van mechanismen van hartceltherapie.
Conclusies
- De gedefinieerde geëngineerde hartweefsels vertegenwoordigen een belangrijke vooruitgang in hartweefsel engineering.
- Deze methode kan helpen om variabiliteit in hartweefselstudies aan te pakken.
- Toekomstige toepassingen kunnen therapeutische strategieën voor hartziekten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to generate human cardiac tissues with precisely controlled cellular composition, addressing a critical gap in preclinical model fidelity. By defining the cardiomyocyte-to-fibroblast ratio and incorporating therapeutic cell types such as hMSCs, the system supports mechanistic de-risking of cell therapy hypotheses. It provides a translationally relevant platform for evaluating paracrine effects and heterocellular interactions prior to costly in vivo studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating variables such as hMSC concentration in a defined human myocardium model.
- Operational Value: Reduces biological noise from undefined cell populations, improving target validation confidence.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking engineered tissue responses to mechanistic mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively contractile tissues with measurable twitch force outputs for compound or cell-based screening.
- Operational Value: The bioreactor format allows parallel culture of six tissues, increasing throughput and reproducibility.
- Assay Readiness: Produces standardized, matrix-defined tissues suitable for longitudinal functional monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses clinically relevant hMSCs to model paracrine mechanisms under investigation in cardiac cell therapy trials.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how specific cell types enhance contractile function, informing dose and timing decisions.
- Disease-Relevant System: Recapitulates key aspects of human myocardium biofidelity for preclinical efficacy testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical mechanistic studies, particularly for cell therapy modalities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how stromal or stem cells modulate cardiomyocyte function in a human context.
- Screening: Enables standardized assessment of contractile function as a functional readout for bioactive agents.
- Analytics: Provides twitch force measurements (5–15 µN) as quantitative, replicable outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Uses hMSCs at 10% supplementation to mirror exploratory ratios in cell therapy mechanisms.
- Enterprise Reuse: The defined tissue format can be adapted across projects studying different cell-cell interactions or therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in heterocellular interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through exact cellular and extracellular matrix definition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant functional data on cell therapy mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying non-responders or synergistic combinations prior to animal studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell differentiation, flow cytometry, and tissue engineering.
- Depends on access to FACS instrumentation, collagen matrices, and force-sensing bioreactor systems.
- Necessitates standardization of cell sorting gating strategies and tissue mixing protocols across teams.
- Adaptation to other cell types may require validation of surface markers and matrix compatibility.
- Tissue maturation timeline (~10 days post-construction) must be factored into experimental scheduling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Cell Culture and Sorting of Differentiated Cardiomyocytes
4:50
Collection of Reaggregated Cardiac Cells
6:32
Generation of Human Engineered Cardiac Tissues
9:45
Results: Contractile Force Measurement Using Human Engineered Cardiac Tissues
11:05
Conclusion
