Name: Laterale Root Induceerbare System in Arabidopsis En maïs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer het Laterale Wortel Induceerbare Systeem voor plantenbiologie met Arabidopsis thaliana en maïs. Deze methode maakt synchrone inductie van laterale wortels mogelijk voor onderzoek naar wortelontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Davy Opdenacker voor technische assistentie en fotografie. We danken Dr. Annick Bleys enorm voor nuttige suggesties om het manuscript te verbeteren. Dit werk werd gefinancierd door het Interuniversitair Attractiepolen Programma IUAP P7/29 'MARS' van het Belgisch Federaal Wetenschapsbeleidskantoor, door de FWO-beurs G027313N en door de Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, IWT (IR).

1. Arabidopsis LRIS Protocol Opmerking: De tekst verwijst naar &quot;kleine&quot; of &quot;grote&quot; grootschalige experimenten. Kleinschalige experimenten, zoals marker line analyse en histologische kleuring 6, 14, vereisen slechts een paar voorbeelden. Grootschalige experimenten, zoals kwantitatieve real-time qRT-PCR, micro-arrays 11/09 of RNA sequentie, vereist een groter aantal monsters. Als zodanig een hoeveelheid van ~ 1000 zaailingen per monster werd door Vanneste et al. 11 microarray experiment voeren na wortel segment dissectie. DAG 1 <ol><li> Sterilisatie van Arabidopsis zaden Opmerking: Selecteer een van de volgende procedures voor zaad sterilisatie. Een van hen is geschikt voor de volgende stappen van het protocol. Gas sterilisatie (1.1.2) biedt twee belangrijke voordelen ten opzichte van vloeibare sterilisatie (1.1.1): het kost minder tijd bij het hanteren van een grote gevoellozeer zaden, aangezien geen pipetteren te treden voor de individuele monsters; en de gesteriliseerde zaden worden opgeslagen gedurende langere tijd. Het vereist echter een exsiccator en zorgvuldige behandeling. <ol><li> Vloeibare sterilisatie <ol><li> Giet het gewenste aantal zaden in de micro-centrifuge buizen. Gebruik maximaal 20 mg (~ 800 zaden) in een 1,5 ml buis of 40 mg (~ 1600 zaden) in een 2 ml micro-centrifugebuizen. </li><li> Voeg 1 ml van 70% ethanol. Omkeren of schud gedurende 2 minuten. </li><li> Vervang de 70% ethanol met 1 ml sterilisatie oplossing 15 min. (Bereid verse sterilisatie oplossing: 3,85 ml natriumhypochloriet (NaOCl) voorraad (12%) (LET OP: Gebruik zuurkast), 5 ul Tween 20, tot 10 ml met water Inverteer de buizen meerdere malen om ervoor te zorgen dat alle zaden komen. in contact met de oplossing. </li><li> In een laminaire luchtstroom kabinet, vervang de sterilisatie-oplossing met 1 ml steriel gedestilleerd water en spoel de zaden 5 keer gedurende 5 minuten door herhaaldelijkly vervangen door 1 ml vers steriel gedistilleerd water. </li></ol></li><li> Gas Sterilisatie <ol><li> Giet het gewenste aantal zaden in een 2 ml micro-centrifugebuis. Gebruik afzonderlijke buizen bij het werken met verschillende onafhankelijke lijnen, en schik ze geopend in een plastic micro-centrifuge buizen doos of houder. Als het aantal zaden in één buis dan 500 (12,5 mg), verdelen de zaden in het juiste aantal buizen succesvolle sterilisatie te verzekeren. Zorg ervoor dat de doppen van de naburige buizen hebben geen betrekking op elkaar. Breng samen het deksel van de doos aan de onderzijde, aangezien hiervoor in de exsiccator ook voor sterilisatie. </li><li> Plaats de doos in de kom van een exsiccator, samen met een bekerglas (LET OP: Gebruik zuurkast). </li><li> Vul de beker met 100 ml 12% NaOCl (LET OP: Gebruik zuurkast). Doe de deksel op de exsiccator, maar laat een kleine opening waar de beker wordt geplaatst. </li><li> Voeg 3 ml 37% zoutzuur (rokend) (CAUTIE: Gebruik zuurkast) aan de beker door de kleine opening en snel te sluiten de exsiccator. De oplossing zal bubbel voor enige tijd als gevolg van Cl 2 -gas formatie. Laat het systeem gesloten O / N (of tenminste 8 uur). </li><li> Verwijder het deksel van de exsiccator. Neem de doos en bedek het met de deksel om besmetting tijdens het transport te voorkomen. </li><li> Zet de doos in een laminaire luchtstroom kabinet, verwijder het deksel en laat de zaden gedurende ongeveer 1 uur bij RT om gas vrijlating toe te staan. Opmerking: Zaden kan veilig droog in gesloten micro-centrifuge buizen worden opgeslagen voor maximaal 2 weken bij 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Laterale Root inductie in Arabidopsis <ol><li> Laterale Root Remming (NPA Treatment) <ol><li> Bereid groeimedium voor in vitro groei. Het medium bevat halve sterkte Murashige en Skoog zoutmengsel 15, 0,1 g / L myo-inositol, 10 g / l sucrose, en gebufferd met 0,5g / L 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES). </li><li> Breng de pH op 5,7 met 1 M KOH. Voeg 8 g / l agar plantenweefsel autoclaaf en het medium 20 minuten bij 121 ° C. </li><li> Bereid een 25 mM voorraad oplossing van NPA in dimethylsulfoxide (DMSO) (LET OP: Gebruik handschoenen). In een laminaire flowkast Koel de geautoclaveerde medium tot ca. 65 ° C (dat is de temperatuur waarbij de fles kan worden vastgehouden met de hand) en voeg 25 mM NPA voorraadoplossing om een ​​eindconcentratie van 10 uM NPA verkrijgen. </li><li> Homogeniseren na toevoeging door voorzichtig schudden van de fles voor 10 sec. Giet 50 ml medium per vierkante petrischaal (12 cm x 12 cm). Opmerking: In het geval van grootschalige experiment, breng dan een nylon mesh (20 micrometer) om gemakkelijke overdracht te waarborgen. Bereid een maas (9 cm x 9 cm) voor autoclaaf (Figuur 1A). Bij geautoclaveerd Breng het gaas aan het groeimedium met steriele pincet (Figuur 1B). Duw het gaas aan het groeimedium met een sterilized drigalsky om ervoor te zorgen dat het in goed contact met het groeimedium (Figuur 1B) (LET OP: Werk in steriele omstandigheden). </li><li> Zaai de zaden op de NPA-platen. Opmerking: In het geval van een grootschalig experiment is gepland, zaaien 2 dichte en goed uitgelijnd rijen van 50 zaden van de bemonstering te vergemakkelijken (zie 1.2.2.3). <ol><li> In het geval van vloeibare sterilisatie, zaaien de zaden op NPA-platen met behulp van een 200 ul pipet. Snij 3 - 4 mm van het uiteinde van de tips pipetteren in steriele omstandigheden (of vóór sterilisatie van de uiteinden) om te kunnen de zaden pipetteren. Pipet op en neer een paar keer opnieuw op te schorten de zaden, dan pipet ongeveer 150 ul steriel water met 10-20 zaden en wacht tot de zaden sediment aan de onderkant van de tip. (LET OP: Werk in steriele omstandigheden) Opmerking: Bij het ​​aanraken van de agar of het gaas voorzichtig met de punt, zal een druppel water met een zaadje worden vrijgesteld van deze (figuur 1C). </li> &lt;li&gt; In het geval van gas sterilisatie, zaaien met behulp van een autoclaaf toothpicks.Pinch de tandenstoker in het agar voordat de zaden tot een kleverige oppervlak te garanderen. Pick-up van de zaden één voor één met de tandenstoker en verdeel de zaden op de platen (figuur 1D). Als alternatief, voeg steriel water om de zaden en zaaien, zoals beschreven in 1.2.1.5.1 (LET OP: Werk in steriele omstandigheden). </li></ol></li><li> Dicht de platen met ademende plakband en opslaan platen bij 4 ° C in het donker gedurende minstens 2 dagen en ten hoogste één week. Dit is nodig voor stratificatie en garandeert gesynchroniseerd en efficiënter kieming. Opmerking: Als alternatief kan zaden worden gestratificeerd voor het zaaien, ondergedompeld in gedestilleerd water in de micro-centrifuge buizen, die minder koelkast ruimte vereist. In dit geval slaan de buizen gedurende ten minste één week bij 4 ° C, en zet de platen om de groeikast onmiddellijk na het zaaien (zie 1.2.1.7). DAG 3 </li&gt; <li> Verplaats de platen om de groei kast (continu licht (110 uE m -2 s -1), 21 ° C) gedurende 5 dagen (2 dagen na kieming en 3 dagen groei) in een nagenoeg verticale positie (80 tot 90 °) root groei, en niet in het medium te verzekeren. DAG 8 </li></ol></li><li> Laterale Root Inductie (NAA Treatment) <ol><li> Bereid hetzelfde groeimedium zoals beschreven in 1.2.1.1 en 1.2.1.2. Bereid een 50 mM voorraad oplossing van NAA in DMSO (LET OP: Gebruik handschoenen). Koel het geautoclaveerde medium tot aan 65 ° C en voeg NAA oplossing aan het medium tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM NAA verkrijgen (LET werkzaamheden steriele omstandigheden). <ol><li> Homogeniseren na toevoeging door voorzichtig schudden van de fles voor 10 sec. Giet 50 ml medium per vierkante petrischaal (12 cm x 12 cm). </li></ol></li><li> Breng de zaailingen van de platen met kweekmedium, aangevuld met 10 pM NPA die supvuld met 10 uM NAA. <ol><li> Haak de armen van gebogen pincet onder de zaadlobben van de zaailingen en verwijder het voorzichtig van de plaat. Slechts overdracht zaailingen waarvan de wortels gegroeid geheel in contact met de NPA-groeimedium bij voorkeur beneden. </li><li> Schep de wortel over de NAA-bevattend groeimedium oppervlak over een kleine afstand. Zorg ervoor dat de plantenwortels in goed contact met het groeimedium. Indien nodig, druk op de wortel zachtjes aan het groeimedium oppervlak met de pincet. Opmerking: Bij een grootschalig experiment, verwijder alle zaailingen die niet in contact met de maas en de overdracht door het opheffen van de maas bij de twee bovenhoeken met een pincet. Zorg ervoor dat het gaas is in goed contact met de NAA-bevattend medium door het afromen van de mazen in de agar oppervlak over een kleine afstand (figuur 1E). </li></ol></li><li> Verzegeling van de nieuwe platen met ademende tape en plaats ze in de groei kast (concontinu licht (110 uE m -2 s -1), 21 ° C) in een verticale positie voor de gewenste na inductie tot bemonstering. Opmerking: Bij een grootschalig experiment gebruikt een scalpel om de wortelsegmenten ineens direct aan de maas gesneden en proeven ze door voorzichtig schrapen van het oppervlak van het gaas. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. LRIS Maïs Protocol <ol><li> Gelaagdheid van maïskorrels <ol><li> Incubeer de maïskorrels bij 4 ° C in het donker gedurende ten minste 1 week. Opmerking: Dit protocol is ontwikkeld met behulp van de B73 maïs inteeltlijn. </li></ol></li><li> Sterilisatie van maïskorrels DAG 1 Noot: Hoewel maïszaailingen niet te worden gekweekt in steriele omstandigheden, wordt aanbevolen de maïskorrels steriliseren en met steriel materiaal schimmelgroei in de papierrol te voorkomensysteem. <ol><li> De nodige aantal maïskorrels in een gesteriliseerde glazen beker. </li><li> Voeg 100 ml van de sterilisatie-oplossing (6% NaOCl in water) (LET OP: Gebruik zuurkast). </li><li> Voeg een magnetische roerstaaf en plaats de beker op een magnetische roerder bij lage roersnelheid (ongeveer 250 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Spoel vijf keer gedurende 5 min door vervanging van de oplossing met 100 ml vers steriel water. </li></ol></li><li> Zaaien maïskorrels <ol><li> Doe handschoenen om de kans op besmetting te verminderen, en neem een ​​rol papier handdoeken. </li><li> Scheur twee stukken van de handdoek papier met een totale lengte van twee bladen (ongeveer 92 cm x 24 cm) en leg ze op de top van elkaar op een schoon oppervlak (Figuur 2A). </li><li> Vouw de vellen verdubbelen over de lengte (ongeveer 92 cm x 12 cm) (Figuur 2A). </li><li> Gebruik een pincet om 10 pitten verspreiden op ongeveer 2 cm van de top over tHij gehele lengte van het papier, terwijl bij beide uiteinden (figuur 2B) houden een tussenruimte van 8 cm tussen elke korrel en 8 cm. Zorg ervoor dat het worteltje van de kernel wordt naar beneden en in de richting van het papier (Figuur 2B). </li><li> Schud het papier over de lengte, terwijl de zaden in plaats (Figuur 2B). Om de rollen te vergemakkelijken, is het optioneel om eerst spuiten het papier met steriel water. </li><li> Plaats de papierrollen in gesteriliseerde glazen buizen van ongeveer 6 cm diameter en 14 cm hoogte (bijvoorbeeld 250 ml centrifugebuizen) en plaats ze in een rek (figuur 2C). </li></ol></li><li> Laterale Root Inductie in Maize <ol><li> Bereid een 50 mM NPA stockoplossing (opgelost in DMSO) (LET OP: Gebruik handschoenen). </li><li> Voor elke buis, maken 50 uM NPA door toevoeging van 125 ul van de 50 mM voorraadoplossing NPA aan 125 ml steriel water in een gesteriliseerde glazen beker. </li><li> Meng goed enGiet 125 ml van de 50 uM NPA oplossing over de papierrol in de buis. De papierrol zal de oplossing te absorberen en wordt volledig doorweekt. Opmerking: Bij het ​​gebruik van papierrollen en buizen met andere dimensies, het volume aanpassen dienovereenkomstig. De vloeistof moet halverwege de buis te bereiken om voldoende opname te garanderen. </li><li> Plaats de papierrol systeem een ​​groeikast drie dagen (27 ° C, continu licht, 70% relatieve vochtigheid). Zorg ervoor dat de papierrollen blijven doorweekt door het toevoegen van extra 50 uM NPA oplossing, omdat de oplossing verdampt in de tijd (Figuur 2D). DAG 4 </li><li> Bereid een 50 mM NAA stockoplossing (opgelost in DMSO) (LET OP: Gebruik handschoenen). </li><li> Voor elke buis, bereiden een 50 uM NAA oplossing door het toevoegen van 125 pi van de 50 mM NAA voorraad tot 125 ml steriel water in een gesteriliseerde glazen beker. </li><li> Knijp het grootste deel van de resterende NPA oplossing uit de papierrollen en plaats dem in steriel water gedurende 5 minuten om het te wassen (LET OP: Gebruik handschoenen). Knijp het grootste deel van het water uit de papierrollen. Herhaal deze wasstap driemaal. </li><li> Meng goed en giet de 50 uM NAA oplossing over de papierrollen in de buizen. Zorg ervoor dat ze volledig doorweekt. </li><li> Plaats de papierrol systeem de groei cabinet (27 ° C, continu licht, 70% relatieve vochtigheid) voor de gewenste tijdsduur na inductie. </li></ol></li><li> Laterale Root Inductie in Onvoorziene Kroon Wortels van maïs Opmerking: De LRIS hierboven beschreven induceert zijwortels in de primaire wortel. In maïs en andere eenzaadlobbigen, de primaire wortel en de embryonale rudimentaire wortels, samen met hun laterale wortels, zijn vooral belangrijk tijdens zaailing ontwikkeling. In een later stadium van de plantengroei, de post-embryonale bijwortels ontstaan ​​van de voor- en tevens zijwortels een nieuw wortelstelsel 16 vormen te ontwikkelen. De LRIS kan ook gebruik wordend laterale wortels op deze post-embryonale onvoorziene kroon wortels veroorzaken door het volgen van enkele kleine aanpassingen aan de IRIS zijn op de embryonale primaire wortel. <ol><li> Om de papierrollen te maken, maakt u een sandwich van documenten met respectievelijk twee lagen handdoek papier aan de buitenzijde, en twee lagen van kieming papier binnen. Plaats de gesteriliseerde kernels (zie stap 2.1 en 2.2) tussen de twee vellen papier kiemkracht. Kieming papier, tegenover handdoekpapier, zal minder snel worden gepenetreerd door wortelharen en zijwortels, die zal de opening van de papierrollen gemakkelijker later. Anderzijds zullen de twee externe lagen van handdoekpapier absorptie van de vloeistof te vergemakkelijken. </li><li> Steek de rollen in 700 ml glazen buizen en giet steriel water zonder NPA over hen. Zorg ervoor dat ze volledig doorweekt. </li><li> Ontkiemen van de gesteriliseerde pitten in de groei kast (zie stap 2.4.9). </li><li> Groeien de zaailingen tot de onvoorziene kroon wortelsbeginnen te ontstaan ​​(6 dagen voor B73). Zorg ervoor dat de papierrollen zijn te allen tijde nat gehouden door het toevoegen van steriel water wanneer dat nodig is. </li><li> Verwijzing naar een 25 pM oplossing NPA 4 dagen (zie stap 2.4.1 tot 2.4.4), gevolgd door een soortgelijke inductie van zijwortelinitiatie door vervanging van de NPA-oplossing met een 50 uM NAA oplossing na een wasstap (zie stap 2,4 0,5 tot 2.4.9). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+branch+or+not+to+branch%3A+the+role+of+pre-patterning+in+lateral+root+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation.</a> Development. 140, 4301-4310 (2013).</li>
<li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organisation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root.</a> Development. 119, 71-84 (1993).</li>
<li>Bell, J. K., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histological+study+of+lateral+root+initiation+and+development+in+Zea+mays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">A histological study of lateral root initiation and development in Zea mays.</a> Protoplasma. 70, 179-205 (1970).</li>
<li>Benkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local%2C+efflux-dependent+auxin+gradients+as+a+common+module+for+plant+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation.</a> Cell. 115, 591-602 (2003).</li>
<li>Beeckman, T., Burssens, S., Inzé, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peri-cell-cycle+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">The peri-cell-cycle in Arabidopsis.</a> J. Exp. Bot. 52, 403-411 (2001).</li>
<li>Himanen, K., Boucheron, E., Vanneste, S., de Almeida Engler, J., Inzé, D., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-mediated+cell+cycle+activation+during+early+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation.</a> Plant Cell. 14, 2339-2351 (2002).</li>
<li>Jansen, L., Parizot, B., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+system+for+lateral+roots+in+Arabidopsis+thaliana+and+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible system for lateral roots in Arabidopsis thaliana and maize.</a> Methods Mol Biol. 959, 149-158 (2013).</li>
<li>Casimiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+transport+promotes+Arabidopsis+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation.</a> Plant Cell. 13, 843-852 (2001).</li>
<li>Himanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+profiling+of+early+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcript profiling of early lateral root initiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 5146-5151 (2004).</li>
<li>De Smet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-like+kinase+ACR4+restricts+formative+cell+divisions+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-like kinase ACR4 restricts formative cell divisions in the Arabidopsis root.</a> Science. 322, 594-597 (2008).</li>
<li>Vanneste, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+progression+in+the+pericycle+is+not+sufficient+for+SOLITARY+ROOT%2FIAA14-mediated+lateral+root+initiation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 17, 3035-3050 (2005).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+root+cap+in+root+branching+revealed+by+the+non-auxin+probe+naxillin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin.</a> Nat. Chem. Biol. 8, 798-805 (2012).</li>
<li>Jansen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+as+a+tool+for+the+identification+of+root+branching+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics as a tool for the identification of root branching genes in maize.</a> Plant Biotechnol. J. 11, 1092-1102 (2013).</li>
<li>Parizot, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diarch+symmetry+of+the+vascular+bundle+in+Arabidopsis+root+encompasses+the+pericycle+and+is+reflected+in+distich+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation.</a> Plant Physiol. 146, 140-148 (2008).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitious+roots+and+lateral+roots%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences.</a> Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).</li>
<li>Grunewald, W., Parizot, B., Inzé, D., Gheysen, G., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+roots%3A+One+common+pathway+for+all+angiosperms%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Plant+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of roots: One common pathway for all angiosperms?</a> Int. J. Plant Dev. Biol. 1, 212-225 (2007).</li>
<li>Parizot, B., Beeckman, T. Genomics of root development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParizot%2C+B+%22Root+Genomics+and+Soil+Interactions%22">Root Genomics and Soil Interactions</a>. Crespi, M. , 3-28 (2012).</li>
<li>Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting+of+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%2C+a+tool+for+the+global+analysis+of+gene+expression+in+specific+plant+cell+types%3A+identification+of+genes+expressed+differentially+in+epidermal+cells+or+vascular+tissues+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize.</a> Plant Cell. 15, 583-596 (2003).</li>
<li>Ludwig, Y., Hochholdinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of plant cells.</a> Methods Mol Biol. 1080, 249-258 (2014).</li>
<li>Beeckman, T., Engler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+technique+for+the+clearing+of+histochemically+stained+plant+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">An easy technique for the clearing of histochemically stained plant tissue.</a> Plant Mol. Biol. Rep. 12, 37-42 (1994).</li>
<li>Ditengou, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+induction+of+lateral+root+initiation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18818-18823 (2008).</li>
<li>Lucas, M., Godin, C., Jay-Allemand, C., Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+fluxes+in+the+root+apex+co-regulate+gravitropism+and+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Auxin fluxes in the root apex co-regulate gravitropism and lateral root initiation.</a> J. Exp. Bot. 59, 55-66 (2008).</li>
<li>Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+root+formation+in+rice+%28Oryza+Sativa.+L.%29%3A+differential+effects+of+indole-3-acetic+acid+and+indole-3-butyric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid.</a> Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).</li>
<li>Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li>
<li>Beyer, E. M., Morgan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ethylene+on+uptake%2C+distribution%2C+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li>
<li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2%2C4-dichlorophenoxy+acetic+acid%2C+naphthalene-1-acetic+acid%2C+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li>
<li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+genome-scale%2C+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li>
<li>Perez-Torres, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+availability+alters+lateral+root+development+in+Arabidopsis+by+modulating+auxin+sensitivity+via+a+mechanism+involving+the+TIR1+auxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor.</a> Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het Arabidopsis LRIS protocol, is het belangrijk om alleen de overdracht van de zaailingen die zijn gegroeid volledig in contact met de NPA-bevattend groeimedium. Dit zorgt ervoor dat zijwortelinitiatie geblokkeerd over de gehele wortellengte. Om te voorkomen verwonden plantjes tijdens de overdracht, kunnen de armen van de gebogen pincet worden aangesloten onder de zaadlobben van de zaailing. Bij overdracht, zorg ervoor dat de zaailing wortels liggen in voldoende contact met de NAA met agar medium. Dit kan w...

Het wortelstelsel is cruciaal voor de groei van planten, omdat het zorgt voor verankering en opname van water en voedingsstoffen uit de bodem. Door de uitbreiding van een wortelstelsel berust voornamelijk op de productie van zijwortels, de initiatie en vorming zijn uitgebreid onderzocht. Zijwortels worden geïnitieerd in een bepaalde subgroep van pericycluscellen, de zogenaamde stichter cellen 1. In de meeste tweezaadlobbigen, zoals Arabidopsis thaliana, wordt deze cellen zich aan de protoxyleem polen 2, terwijl in eenzaadlobbigen zoals maïs, worden zij vinden in het floëem polen 3. Founder cellen worden gekenmerkt door een verhoogde auxine respons 4, gevolgd door expressie van specifieke genen celcyclus (bv CYCLIN B1; 1 / CYCB1, 1), waarna zij ondergaan een eerste ronde van asymmetrische anticlinale gebieden 5. Na een reeks gecoördineerde anticlinale en periclinale divisies, wordt een laterale wortel primordium gevormd die uiteindelijk zal ontstaan ​​als eenutonomous laterale wortel. De locatie en het tijdstip van zijwortelinitiatie zijn echter niet voorspelbaar, omdat deze gebeurtenissen noch overvloedig noch gesynchroniseerd. Dit belemmert de toepassing van moleculaire methoden zoals transcriptomics dit proces te bestuderen. Om dit aan te pakken, is een zijwortelinitiatie induceren systeem (LRIS) ontwikkeld 6, 7. In dit systeem worden zaailingen eerst behandeld met N -1-naphthylphthalamic acid (NPA), die auxinetransport en accumulatie remt derhalve blokkeren zijwortelinitiatie 8. Door vervolgens de overdracht van de zaailing op medium dat de synthetische auxine 1-naftaleen azijnzuur (NAA), het hele pericyclus laag reageert op de verhoogde auxine niveaus waardoor massaal inducerende laterale wortel initiëren celdelingen 6. Als zodanig is dit systeem leidt tot een snelle, synchrone en uitgebreide zijwortels initiaties, waardoor u gemakkelijk verzamelen van wortel monsters verrijkt voor een bepaalde fase van de lateral wortelontwikkeling. Vervolgens kunnen deze monsters worden gebruikt om genoom-wijde expressie profielen tijdens zijwortelvorming bepalen. De LRIS heeft reeds aanzienlijke kennis zijwortelinitiatie in Arabidopsis en maïs 9-13, maar de noodzaak leverde dit systeem voor andere plantensoorten wordt duidelijker naarmate meer genomen worden gesequenced en er is een toenemende belangstelling kennis dragen aan economisch belangrijke species. Hier, de gedetailleerde protocollen van het Arabidopsis en maïs LRISs worden gegeven. Vervolgens wordt een voorbeeld van het gebruik van het systeem verschaft, door illustreren hoe transcriptomics data afkomstig van maïs LRIS kan worden gebruikt om functionele homologen die een geconserveerd functioneel tijdens zijwortelinitiatie in verschillende plantensoorten te identificeren. Tenslotte richtlijnen om de LRIS optimaliseren voor andere plantensoorten worden voorgesteld.

<table><tbody><tr><td>ARABIDOPSIS LRIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seeds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis seeds</td><td></td><td></td><td>Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>Gas sterilisatie van zaden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-centrifugebuizen 1,5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrifugebuizen 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifugebuizen</td></tr><tr><td>zoutzuur</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (rookloos) voor analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu</td></tr><tr><td>glasdroogkast</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>glasbeker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic micro-centrifugebuizendoos of -houder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleeksterilisatie van zaden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Ethanol, abs. 100% a.r. verdunnen tot 70%</td></tr><tr><td>natriumhypochloriet (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>steriel water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Groeimedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige en Skoog zoutmengsel</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-Sucrose Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellets voor analyse (max. 0,002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Plant Tissue Culture Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>Laterale wortelinductiechemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naftylftalamijnzuur (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>10 &micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>1-naftaleenazijnzuur (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>10 &micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Een gaas maken voor overdracht</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon gaas</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Synthetisch nylon gaas 20 &micro;m</td></tr><tr><td>Zaaien en zaailingverwerking</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vierkante petrischalen</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml DURAN-buizen</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&nbsp;50 ml centrifugebuizen</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gesneden pipettips</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universeel 200, 5 mm van de punt afsnijden voordat ze worden geautoclaveerd</td></tr><tr><td>ademende tape&nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>cat. no. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>pincet</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont pincet type a nr 5; Dumont pincet type e nr 7</td></tr><tr><td>Groeicondities</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>groeikamer</td><td></td><td></td><td>21 &deg;C, continu licht</td></tr><tr><td>Materiaal</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogus</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>MAIZE LRIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seeds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maïskorrels</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>Bleeksterilisatie van korrels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glasbeker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnetische roerder&nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>natriumhypochloriet (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>steriel water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laterale wortelinductiechemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naftylftalamijnzuur (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>50 &micro;M (maïs primaire wortel), 25 &micro;M (maïs adventieve wortel)</td></tr><tr><td>1-naftaleenazijnzuur (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>50 &micro;M (maïs)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zaaien en zaailingverwerking</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>papieren handdoeken</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Handdoeken - Rol / Wit; velformaat (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>zaadkiemingspapier</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# zaadkiemingspapier</td></tr><tr><td>pincet</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont pincet type a nr 5; Dumont pincet type e nr 7</td></tr><tr><td>250 ml (centrifuge) buizen</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>ca. 5,6 cm diameter en 14,7 cm hoogte&nbsp;</td></tr><tr><td>700 ml buizen</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cilinders, ronde voetbuis, D 60&nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rek</td><td></td><td></td><td>voor maïsbuizen, zelfgemaakt</td></tr><tr><td>steriel water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Groeicondities</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>groeikabinet</td><td></td><td></td><td>27 &deg;C

laterale root induceerbare system in<em&gt; arabidopsis</em&gt; en maïs

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Laterale wortelontwikkeling draagt aanzienlijk bij aan het wortelsysteem en is daarom cruciaal voor plantengroei. De studie van laterale wortelinitiatie is echter moeizaam, omdat het slechts in enkele cellen binnen de wortel plaatsvindt en op een onvoorspelbare manier. Om dit probleem te omzeilen, is een Lateral Root Inducible System (LRIS) ontwikkeld. Door zaailingen achtereenvolgens te behandelen met een auxine transportremmer en een synthetische auxine, vindt een sterk gecontroleerde laterale wortelinitiatie synchronisch plaats in de primaire wortel, waardoor een overvloedige bemonstering van een gewenste ontwikkelingsfase mogelijk is. De LRIS is oorspronkelijk ontwikkeld voor Arabidopsis thaliana, maar kan ook op andere planten worden toegepast. Dienovereenkomstig is het aangepast voor gebruik in maïs (Zea mays). Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van de verschillende stappen van de LRIS in beide planten. De combinatie van dit systeem met comparatieve transcriptomiek maakte het mogelijk om functionele homologen van Arabidopsis laterale wortelinitiatie genen in andere soorten te identificeren, zoals hier geïllustreerd voor het CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) celcyclusgen in maïs. Ten slotte worden de principes die in aanmerking moeten worden genomen bij het ontwikkelen van een LRIS voor andere plantensoorten besproken.

Toepassing van de LRIS te presteren Vergelijkende Transcriptomics van de zijwortelinitiatie Process Een toepassing van de LRIS de vergelijking en correlatie van genexpressieprofielen in laterale wortelvorming in verschillende soorten. Vergelijkende transcriptomics benadert maken van de mogelijkheid om orthologe genen die betrokken zijn in de laterale wortelontwikkeling proces in verschillende soorten lokaliser...

Het Lateral Root Inducible System (LRIS) maakt gelijktijdige inductie van laterale wortels mogelijk en wordt gepresenteerd voor Arabidopsis thaliana en maïs.

Laterale Root Induceerbare System in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; En maïs

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Het algemene doel van het induceerbare systeem voor zijwortels is om de initiatie van zijwortels in planten synchroon te induceren met behulp van hormoonbehandelingen. Plantenwortels zijn verborgen en staan erom bekend uiterst moeilijk te bestuderen te zijn. Wij hebben een in vitro-systeem ontwikkeld waarmee het proces van zijwortelinitiatie op cytologisch, histologisch en moleculair niveau bestudeerd kan worden.Over het algemeen kunnen wetenschappers die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren omdat de planten geen adequaat contact met het medium hebben gemaakt, wat een homogene inductie van de zijwortels verhindert. Een visuele demonstratie van deze methode helpt bij het tonen van de kritische stappen die in rekening moeten worden gebracht om een homogene inductie te waarborgen. Hoewel dit systeem oorspronkelijk is ontwikkeld voor de kleine plant Arabidopsis, kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals maïs, rijst of gerst.Breng als eerste een nylon gaas van 20 micron aan op groeimedium aangevuld met NPA met behulp van een steriele pincet. Druk het gaas voorzichtig met een drigalski-spatel op het groeimedium om ervoor te zorgen dat er een goed contact met het medium is. Druk vervolgens met een steriele tandenstoker in de agar om een kleverig oppervlak op de tandenstoker te creëren.Gebruik de tandenstoker om een batch gasgesteriliseerde zaden gelijkmatig over de voorbereide platen te verdelen. Sluit de platen af met ademende plakband en bewaar ze bij vier graden Celsius in het donker gedurende minimaal twee dagen en maximaal één week. Dit is nodig voor stratificatie en zorgt voor een gesynchroniseerde en efficiënte kieming.Verplaats op de derde dag de platen naar de groeikamer voor twee dagen kieming, gevolgd door drie dagen groei onder een hoek van 80 tot 90 graden. Identificeer op dag acht de wortels die volledig in contact met het gaas zijn gegroeid en, daarentegen, de wortels die geen contact maken met het gaas. Verwijder alle zaailingen waarvan de wortels geen contact maken met het gaas.Breng de mazen met de zaailingen over naar platen aangevuld met 10 micromolair NAA. Eens op de plaat, strijk de maas indien nodig over het oppervlak van het medium om er zeker van te zijn dat er een goed contact is met het groeimedium. Om een homogene inductie in alle zaailingen te waarborgen, is het belangrijk om de zaailingen te verwijderen die op het NPA-aangevulde medium niet in contact met de maas zijn gegroeid en de maas op het NAA-aangevulde medium indien nodig correct glad te strijken.Verzegel de nieuwe platen met ademende tape en plaats ze in een verticale positie in de groeikamer gedurende de gewenste tijd na inductie. Gebruik een scalpel om de wortelsegmenten in één keer direct op het gaas door te snijden wanneer de monsters verzameld moeten worden, en neem de monsters af door voorzichtig over het oppervlak van het gaas te schrapen. We zullen nu enkele stappen van het induceerbare zijwortelsysteem in maïs laten zien.Begin met het steriliseren van de maïskorrels door eerst het benodigde aantal korrels in een steriel glazen bekerglas te plaatsen. Voeg vervolgens 100 milliliters 6% natriumhypochloriet in water toe aan het bekerglas en voeg een magnetische roerstaaf toe. Plaats het bekerglas op een magnetische roerder en roer vijf minuten op een lage snelheid bij kamertemperatuur.Verwijder de bleekoplossing voorzichtig. Vervang deze door 100 milliliters vers steriel water en spoel de zaden gedurende vijf minuten. Herhaal deze stap vijf keer.Trek een paar handschoenen aan en scheur twee stukken keukenpapier af, die u op elkaar op een schoon oppervlak plaatst. Vouw de vellen vervolgens dubbel over de lengte. Gebruik een pincet om 10 zaden te verdelen op ongeveer twee centimeter van de bovenkant over de gehele lengte van het papier, waarbij een tussenruimte van acht centimeter tussen elk zaadje wordt aangehouden en aan beide uiteinden acht centimeter vrij blijft.Zorg ervoor dat de wortel van de kiem naar beneden en naar het papier is gericht. Rol het papier voorzichtig over de lengte terwijl de zaden op hun plaats worden gehouden. Indien nodig kan het besproeien van het papier met steriel water deze stap vergemakkelijken.Plaats de rollen in gesteriliseerde glazen buizen en zet extra buizen in het rek. Giet 125 milliliters van een 50 micromolar NPA-oplossing over de papieren rol in de buis. De papieren rol zal de oplossing absorberen en volledig doordrenkt raken.Plaats het papierenrolsystem in een groeikast voor drie dagen. Zorg ervoor dat de papieren rollen tijdens de incubatie vochtig blijven door indien nodig extra NPA-oplossing toe te voegen. Om een homogene inductie van de initiatie van zijwortels te waarborgen, is het belangrijk om te controleren of de papieren rollen vochtig blijven in de NPA-oplossing, maar dat de wortels niet volledig in de vloeistof zelf zijn ondergedompeld.Na drie dagen op NPA heeft de maïszaailing een kleine scheut en een wortel van ongeveer twee tot drie centimeter. Knijp op dag vier voorzichtig het grootste deel van de resterende NPA-oplossing uit de papieren rollen en plaats de rollen in steriel water totdat ze verzadigd zijn. Knijp na ongeveer vijf minuten voorzichtig het grootste deel van het water uit de papieren rollen.Herhaal de wasstap drie keer. Knijp na de laatste spoeling het meeste water uit en plaats het terug in de buis. Giet een 50 µM oplossing van NAA over de papieren rolletjes in de buisjes tot ze volledig verzadigd zijn.Plaats vervolgens het papierrolsystem in de groeikast voor de gewenste duur na inductie. In vergelijking met pDR5-GUS zaailingen van de auxin-responsmarkerlijn die niet op NAA zijn gegroeid of één uur op NAA zijn gegroeid, vertonen de zaailingen die twee uur op NAA zijn gegroeid een auxin-respons, wat een van de eerste gebeurtenissen is die de initiatie van zijwortels triggert. Deze delingen beginnen vanaf de punt naar boven te bewegen vanaf ongeveer twee uur, en nemen toe bij langere blootstelling aan NAA.Met behulp van de celcyclusmarkerlijn pCYCB1;1-Gus kunnen de eerste celdelingen die leiden tot de vorming van zijwortels worden waargenomen vanaf ongeveer zes uur na het begin van de NAA-behandeling. Microarrays en kwantitatieve rt-PCR kunnen worden gebruikt om de expressie van verschillende genen te evalueren in de diverse regio's van de Arabidopsis- en maïs-wortels tijdens de inductie van zijwortels. Zowel bij Arabidopsis als bij maïs zullen, wanneer de planten gedurende een langere periode groeien, de geïnduceerde delingen leiden tot de ontwikkeling en uitgroei van zijwortels.Als bewijs van concept voor het systeem bij maïs worden hier zaailingen getoond die onder verschillende omstandigheden zijn gekweekt ter vergelijking. Zaailingen die 10 dagen op water zijn gekweekt, hebben zijwortels die niet synchroon zijn geïnitieerd en ruim verspreid over de as liggen. Zaailingen die 10 dagen op NPA zijn gekweekt, bevatten helemaal geen zijwortels.Zaailingen die drie dagen op NPA zijn gekweekt, gevolgd door een behandeling met NAA, vertonen een massale en gesynchroniseerde inductie van zijwortels. In deze video hebben we laten zien hoe u een induceerbaar systeem voor zijwortels opzet, dat essentieel is gebleken bij de ontdekking van fundamentele nieuwe inzichten in het proces van worteltakking. We hebben gedemonstreerd hoe dit werkt voor Arabidopsis en maïs, maar het kan eenvoudig worden aangepast aan andere plantensoorten naar keuze.Veel succes.

lateral-root-inducible-system-in-arabidopsis-and-maize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren de procedure om een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) monteren van Arabidopsis thaliana zaden. De MKBA bleek een krachtig instrument genetisch en in vitro onderzoeken worden hoe het endosperm controles zaadkieming slapende zaden en in reactie op licht signalen. De MKBA is in beginsel van toepassing onder elke situatie waar het endosperm wordt vermoed dat de embryonale groei beïnvloeden.

Een zaadhuid Bedding Assay om Genetisch Explore<em&gt; In Vitro</em&gt; Hoe de Endosperm Controls zaadontkieming in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek wordt toegepast om down-reguleren van de maïs cinnamoyl co-enzym A-reductase (ZmCCR1) gen tot lagere planten ligninegehalte. Lignine down-regulatie van de celwand wordt gevisualiseerd door microscopische analyses en gekwantificeerd door de Klason methode. Compositionele veranderingen in hemicellulose en cellulose geanalyseerd.

Lignine Neerregeling van<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi en Klason Lignine Analyse

Veel ontwikkelingsbelangrijke genen hebben cel- of weefselspecifieke expressiepatronen. Dit artikel beschrijft LM RNA-seq experimenten om genen te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht op de grens tussen het blad en de schede van maïs en in lg1-R mutanten in vergelijking met het wildtype. De experimentele overwegingen die hier worden besproken, zijn van toepassing op transcriptomische analyses van andere ontwikkelingsverschijnselen.

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

Dit protocol toont een methode voor de bereiding van plantenmonsters voor lichtbladmicroscopie. De opstelling wordt gekenmerkt door het verticaal monteren van de plant op het oppervlak van een gel en het laten groeien in gecontroleerde lichte omstandigheden. Dit maakt langdurige observatie van de ontwikkeling van plantenorganen mogelijk in gestandaardiseerde omstandigheden.

Lichtwaaier fluorescentiemicroscopie van plantenwortels Kweken op het oppervlak van een gel

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Een verbeterde protocol wordt gepresenteerd voor de meting van voorbijgaande genexpressie van verslaggever constructies in gerst aleurone cellen na deeltje bombardement. De combinatie van geautomatiseerde graan malen met 96-wells-plaat enzym testen biedt hoge doorvoer voor de procedure.

Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

Hier beschrijven we de generatie en toepassing van een geheel van transgene Arabidopsis thaliana lijnen inschakelen afleidbare, weefsel-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems, het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en het cambium.

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Plant morfogene genen kunnen worden gebruikt om de genetische transformatie van recalcitrante genotypes te verbeteren. Hier beschreven is een Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie (QuickCorn) protocol voor drie belangrijke openbare maïs inteelt lijnen.

Agrobacterium-Gemedeerde onrijpe embryotransformatie van recalcitrante maïsinteeltlijnen met behulp van morfogene genen

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

Dit protocol presenteert een gedetailleerde samenvatting van strategieën om plantenwortels te enten met bodemmicroben. Voor de schimmels Verticillium longisporum en Verticillium dahliae worden drie verschillende wortelinfectiesystemen beschreven. Mogelijke toepassingen en mogelijke downstream analyses worden belicht en voor- of nadelen worden per systeem besproken.

Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen

We gebruiken eenvoudige laboratoriumtools om de wortelsysteemarchitectuur (RSA) van Arabidopsis en Medicago te onderzoeken. De plantjes worden hydroponisch over gaas gekweekt en verspreid met behulp van een kunstkwast om de RSA te onthullen. Foto's worden gemaakt met behulp van scannen of een camera met hoge resolutie en vervolgens geanalyseerd met ImageJ om eigenschappen in kaart te brengen.

Een eenvoudig protocol voor het in kaart brengen van de eigenschappen van de plantwortelsysteemarchitectuur

Leer het Laterale Wortel Induceerbare Systeem voor plantenbiologie met Arabidopsis thaliana en maïs. Deze methode maakt synchrone inductie van laterale wortels mogelijk voor onderzoek naar wortelontwikkeling.

Laterale Root Induceerbare System in

Meer video's verkennen