Ontbinding Dynamic Nuclear Polarisatie Instrumentatie voor Real-time enzymatische reactie snelheidsmetingen door NMR

Het algemene doel van dit experiment is om enzymatische processen in real-time te volgen middels nucleaire magnetische resonantie versterkt door dynamische nucleaire polarisatie. Magnetische resonantie in vloeibare fase, versterkt door dynamische nucleaire polarisatie (DNP), kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen: hoe men bijvoorbeeld de snelheden van enzymatische transformatie van een paar moleculen in een cel of in vivo kan bepalen zonder dit paar moleculen op welke wijze dan ook te hoeven wijzigen. De installatie van onze dissolution DNP-apparatuur in ons laboratorium en de komst van Dr. Riccardo Balzan, PhD van het laboratorium van Arnaud Comment in Lausanne, is een grote stap voorwaarts voor ons onderzoek.

DNP verhoogt de gevoeligheid van de experimenten die we kunnen uitvoeren op onze 500 megahertz NMR-spectrometers aanzienlijk. Deze DNP-apparatuur was de eerste die in Frankrijk werd geïnstalleerd en ik wil vermelden dat alle leden van ons NMR-team betrokken waren bij het functioneel maken van deze apparatuur; in het bijzonder wil ik Gildas Bertho, onze onderzoeksingenieur, en Fatiha Kateb, onze maitre de conferences, noemen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een directe, real-time kwantificering van het substraat en de endogene derivaten mogelijk maakt met een tijdsresolutie van seconden.

Bereid voor de polariserende oplossing twee milliliter van een 1,12 molaire, koolstof-13 gelabelde natriumpyruvaatoplossing, gedoteerd met 33 millimolaire TEMPO-radicalen in een volumeverhouding van twee op één gedeutereerd water tot gedeutereerde ethanol voor koolstof-13 waarnemingen. Verlaag de temperatuur van de dynamic nuclear polarization (DNP) cryostaat via de afkoelingsprocedure door op de cooldown-knop in de software-interface van de cryostaat te klikken. Vul de DNP cryostaat met vloeibaar helium via de vulprocedure.

Klik op de vulknop in de softwareinterface van de cryostaat. Plaats vervolgens 300 µL van de geoptimaliseerde polarisatieloplossing in de monstercontainer die bij de DNP-polarisator is geleverd. Vries de monstercontainer met het monster erin door deze voorzichtig in een bad van vloeibare stikstof te dompelen.

Verwijder de vloeibare stikstof die na de vriesprocedure in de monsterhouder aanwezig kan zijn door de monsterhouder uit het vloeibare stikstofbad te halen en deze ondersteboven te draaien. Plaats vervolgens het monster in de cryostaat door eerst de monsterhouder in de monsterhouderinzet te plaatsen. Plaats daarna de monsterhouderinzet in de hoofdinsert van de cryostaat voordat de golfgeleider van de magnetron in de monsterhouder wordt geplaatst.

Verlaag de temperatuur van de cryostaat door de koelprocedure van één Kelvin te starten. Klik op de knop voor koeling van één Kelvin in de software-interface van de cryostaat. Zet de microgolfbron aan en bestraal het monster door op de knop 'microwaves on' te klikken in de software-interface van de cryostaat.

Koppel de coaxiaalkabel van het detectiekanaal van de NMR-console los van de spoel van de spectrometer door de connector 90 graden tegen de klok in te draaien en deze weg te trekken. Sluit de coaxiaalkabel van het detectiekanaal aan op de coaxiale connector van de cryostaat-NMR-spoel. Steek vervolgens de mannelijke connector van de NMR-consolekabel in de vrouwelijke connector van de cryostaat-NMR-spoel, waarbij u rekening houdt met de oriëntatiepen.

Druk stevig en draai de connector 90 graden met de klok mee. Meet het NMR-thermalsignaal in de vaste fase op de locatie van de cryostaat met een eenvoudige pulse-acquire sequentie met ongekalibreerde pulsen met een lage fliphoek, herhaald met een interval van t equals vijf minuten. Typ na het instellen van de meting zg in de opdrachtregel van de software en druk op enter op het toetsenbord.

Nadat de polarisatieprocedure is gestart, wordt het door DNP versterkte NMR-signaal in de vaste fase gemeten met dezelfde procedure en condities als die voor de meting van het thermische signaal. Koppel de coaxiale kabel van het detectiekanaal van de NMR-console los van de NMR-spoel van de cryostaat door de connector 90 graden tegen de klok in te draaien en deze vervolgens weg te trekken. Sluit daarna de coaxiale kabel van het detectiekanaal aan op de coaxiale connector van de spectrometerspoel.

Steek de mannetjesconnector van de NMR-consolekabel in de vrouwelijke connector van de spectrometerspoel, waarbij u let op de oriëntatiepen. Duw stevig en draai de connector 90 graden met de klok mee. Bereid een verse rabbit muscle LDH-oplossing ter waarde van één unit per milliliter in reactiebuffer met 20 µg/mL bovine serum albumin.

Meng vervolgens 478 microliter reactiebuffer, 2 microliter LDH-oplossing en 20 microliter gedeutereerd water om veldstabilisatie of 'locking' van de spectrometer mogelijk te maken. Plaats vervolgens het oplossingsvolume van 500 microliter in een 5 millimeter NMR-buis. Verbind de overdrachtsbuis met een geautomatiseerd, op maat gemaakt injectieapparaat dat de hypergepolariseerde oplossing scheidt van het heliumgas dat voor de overdracht wordt gebruikt.

Het apparaat doseert automatisch 500 µL hypergepolariseerde oplossing in de monsterbuis. Plaats vóór de dissolutie de NMR-buis van vijf millimeter met 500 µL monster in het isocentrum van de 11,74 tesla NMR-spectrometer. Vul de boiler van de dissolutie-insert met 5 mL gedeutereerd water.

Zet het gedeutereerde water onder druk en verhit het met behulp van de weerstandsdraad tot een temperatuur van ongeveer 180 tot 200 graden Celsius door op de knop prepare heater in de softwareinterface van de cryostaat te klikken. Klik op de knop SS Operations in de softwareinterface van de cryostaat. Verwijder vervolgens de microgolfgeleider uit de oplosinsert.

Schuif de oplossingsinzet naar beneden in de monsterhouder. De oplossingsinzet moet de bodem van de monsterhouder bereiken en stevig worden aangedrukt om een lekvrije verbinding met de monstercontainer te maken, zodat er geen gedeutereerd water in de cryostaat lekt. Druk op de hardwaretrigger om de oplossingssequentie te starten, een vooraf bepaalde tijdreeks van pneumatische klepoperaties.

Direct na de oplossing mengt het injectieapparaat 500 microliters van de hypergepolariseerde oplossing met het monster dat in de NMR-spectrometer is geplaatst. Meet na de oplossing het NMR-hypergepolariseerde signaal van het monster in de spectrometer met een reeks flip-hoek puls-acquire sequenties van 10 graden met intervallen van 1,5 seconden, om de progressie van de magnetisatie van het substraat en het product te volgen. Typ na het instellen van de meting zg in de opdrachtregel van de software en druk op enter.

Zodra de magnetisatie volledig is ontspannen, meet u het NMR-thermiële signaal met een reeks pulse-acquire-sequenties met een fliphoek van 90 graden, met intervallen van ongeveer drie minuten, wat overeenkomt met ongeveer 3T1. Nadat de meting is ingesteld, typt u zg in de opdrachtregel van de software en drukt u op de enter-toets. Hier tonen de tijdscursussen van spectra, verkregen uit herhaalde pulsen met een fliphoek van 10 graden, de gevoeligheid en tijdsresolutie van de techniek.

Na de piekidentificatie van het pyruvaatsubstraat en het lactaatproduct wordt de kwantificering uitgevoerd door signaalintegratie van de metabolieten. De enzymatische activiteit wordt bepaald aan de hand van het tijdverloop van het productsignaal door middel van een lineair model. Om de meting te valideren, wordt dezelfde grootheid geëvalueerd aan de hand van de initiële reactiesnelheid, berekend uit de verhouding tussen de signalen van product en substraat.

Zodra de methode onder de knie is, kan een volledige meting van de enzymatische activiteit in ongeveer twee uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Na het bekijken van deze video zou u inzicht moeten hebben in hoe u een sterk gepolariseerd substraat voor NMR produceert, dit injecteert in een oplossing die een enzym bevat, en de enzymatische activiteit volgt met behulp van DNP-versterkte NMR. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de enzymatische oplossing zorgvuldig te bereiden met vers enzym en cosubstraten, en om elke luchtbel in de monsterbuis te vermijden.

Met de ontwikkeling van DNP-versterkte magnetische resonantie in de vloeistoffase kunnen onderzoekers nu de substraatopname en de enzymatische transformatie daarvan in verschillende celtypen onderzoeken door de snelheid van productvorming te meten. Houd er rekening mee dat het werken met cryogene apparatuur en sterke magnetische velden uiterst gevaarlijk kan zijn. Bij het uitvoeren van deze metingen moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen tegen cryogenen en het controleren op de afwezigheid van magnetische objecten.

In tegenstelling tot klassieke NMR is op oplossingsmiddel gebaseerde DNP-NMR beperkt tot een experimenteel tijdvenster van hooguit enkele minuten, afhankelijk van het substraat en de huidige stand van de techniek. Dit vormt een belemmering om verder te gaan dan eendimensionale spectroscopie. Dissolutie DNP-NMR vereist verdere ontwikkeling om het veelzijdigheidsniveau van klassieke multidimensionale NMR te bereiken.