Ontbinding Dynamic Nuclear Polarisatie Instrumentatie voor Real-time enzymatische reactie snelheidsmetingen door NMR

Het algemene doel van dit experiment is om enzymatische processen in realtime te volgen door dynamische nucleaire polarisatie verbeterde nucleaire magnetische resonantie. Magnetische resonantie in de vloeibare toestand verbeterd door de dynamische nucleaire polarisatie, DNP, kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen: hoe te bepalen, bijvoorbeeld, de snelheden van enzymatische transformatie van een paar moleculen in een cel of in vivo zonder deze paar moleculen op enige manier te wijzigen. De installatie van onze oplossing DNP apparatuur in ons laboratorium en de komst hier van Dr. Riccardo Balzan, een PhD in Arnaud Comment Laboratorium in Lausanne, is een grote stap vooruit voor ons onderzoek.

DNP verhoogt aanzienlijk de gevoeligheid van experimenten die we kunnen uitvoeren op onze 500 megahertz NMR spectrometers. Deze DNP apparatuur was de eerste die in Frankrijk werd geïnstalleerd en ik zou willen vermelden dat, door deze apparatuur functioneel te maken, alle leden van ons NMR-team betrokken waren en ik wil met name Gildas Bertho, onze onderzoeksingenieur, en Fatiha Kateb, onze maitre de conferences, vermelden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het directe, real-time kwantificering van het substraat en zijn endogene derivaten mogelijk maakt met een tijdresolutie van seconden.

Voor de polariserende oplossing, bereidt u twee milliliter van een 1,12 molaire, koolstof 13 gelabelde natriumpyruvaat oplossing gedoping met 33 millimolair TEMPO radicaal in een twee-op-één volume van gedeutereerd water tot gedeutereerd ethanol voor koolstof 13 observaties. Verlaag de dynamische nucleaire polarisatie, of DNP, cryostat temperatuur door de afkoelprocedure door op de afkoelknop op de cryostat software interface te klikken. Verzamel vloeibaar helium in de DNP cryostat door de vulprocedure.

Klik op de vulknop op de cryostat software interface. Plaats vervolgens 300 microliter van de geoptimaliseerde polariserende oplossing in de monstercontainer die wordt geleverd met de DNP polarisator. Bevriest de monstercontainer met het monster erin door het voorzichtig in een vloeibare stikstofbad te dompelen.

Verwijder de vloeibare stikstof die mogelijk aanwezig is in de monstercontainer na de bevriesprocedure door de monstercontainer uit het vloeibare stikstofbad te halen en om te draaien. Plaats vervolgens het monster in de cryostat door eerst de monstercontainer in de monsterhouder te plaatsen. Plaats vervolgens de monsterhouder in de hoofdcryostat invoeging voordat de golfgeleider van de microgolf in de monsterhouder wordt geplaatst.

Verlaag de cryostat temperatuur door de één Kelvin koelprocedure te starten. Klik op de één Kelvin koelknop op de cryostat software interface. Schakel de microgolfbron in en bestraal het monster door op de microgolf aan-knop op de cryostat software interface te klikken.

Ontkoppel de coaxikabel van het NMR console detectiekanaal van de spectrometer spoel door de connector tegen de klok in 90 graden te draaien en te trekken. Sluit de coaxikabel van het detectiekanaal aan op de coaxiconnector van de cryostat NMR spoel. Plaats vervolgens de mannelijke connector van de NMR console kabel in de vrouwelijke connector van de cryostat NMR spoel, lettend op de oriëntatie pin.

Druk stevig en draai de connector met de klok mee 90 graden. Meet het NMR thermische signaal in de vaste toestand op de cryostat site met behulp van een eenvoudige pulse-acquire sequentie met ongecalibreerde, lage flip hoek pulsen herhaald met een interval van t gelijk aan vijf minuten. Na het instellen van de meting, schrijf zg in de opdrachtregel van de software en druk op enter op het toetsenbord.

Na het initiëren van de polarisatieprocedure, meet u het DNP verbeterde NMR signaal in de vaste toestand met dezelfde procedure en voorwaarden die zijn gebruikt voor de thermische signaalmeting. Ontkoppel de coaxikabel van het NMR console detectiekanaal van de cryostat NMR spoel door de connector tegen de klok in 90 graden te draaien en te trekken. Plaats vervolgens de coaxikabel van het detectiekanaal op de coaxiconnector van de spectrometer spoel.

Plaats de mannelijke connector van de NMR console kabel in de vrouwelijke connector van de spectrometer spoel, lettend op de oriëntatie pin. Druk stevig en draai de connector met de klok mee 90 graden. Bereid vers een konijnenspier LDH oplossing voor bij een eenheid per milliliter in reactiebuffer met 20 microgram per milliliter bovien serum albumine.

Meng vervolgens 478 microliter reactiebuffer, 2 microliter LDH oplossing en 20 microliter gedeutereerd water om voor spectrometer veldstabilisatie of vergrendeling te zorgen. Plaats vervolgens de 500 microliter oplossingsvolume in een 5 millimeter NMR buis. Verbind de overdrachtbuis met een geautomatiseerde, op maat gemaakte injectie-inrichting die de hypergepolariseerde oplossing scheidt van het heliumgas dat wordt gebruikt voor overdracht.

Het apparaat levert automatisch 500 microliter hypergepolariseerde oplossing in de monsterbuis. Voorafgaand aan de oplossing, plaats de vijf millimeter NMR buis met 500 microliter monster in het isocentrum van de 11,74 tesla NMR spectrometer. Voeg 5 milliliter gedeutereerd water toe aan de oplossing insert ketel.

Verdruk en verhit het gedeutereerd water door middel van de weerstandsdraad tot een temperatuur van ongeveer 180 tot 200 graden Celsius wordt bereikt door op de bereiden verwarmingsknop op de cryostat software interface te klikken. Klik op de SS Operations knop op de cryostat software interface. Verwijder vervolgens de microgolfgeleider van de oplossing insert.

Schuif de oplossing insert naar beneden in de monsterhouder. De oplossing insert moet de bodem van de monsterhouder bereiken en moet stevig worden geduwd om een lekdichte verbinding met de monstercontainer te maken om te voorkomen dat gedeutereerd water in de cryostat lekt. Druk op de hardware trigger om de oplossingssequentie te starten, een vooraf bepaalde getimede sequentie van pneumatische klepbewerkingen.

Net na de oplossing, mengt het injectieapparaat 500 microliter hypergepolariseerde oplossing met het monster dat in de NMR spectrometer is geplaatst. Na de oplossing, meet u het NMR hypergepolariseerde signaal van het monster in de spectrometer door een reeks van 10 graden, flip hoek pulse-acquire sequenties met tussenpozen van 1,5 seconden om de voortgang van de magnetisatie van het substraat en het product te volgen. Na het instellen van de meting, schrijf zg in de opdrachtregel van de software en druk op enter.

Zodra de magnetisatie