Name: Ontbinding Dynamic Nuclear Polarisatie Instrumentatie voor Real-time enzymatische reactie snelheidsmetingen door NMR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Leer hoe u enzymatische processen in realtime kunt volgen met dynamic nuclear polarization (DNP) NMR. Deze methode verhoogt de gevoeligheid van 500 MHz NMR-spectrometers voor directe kwantificering van substraten zonder moleculen te veranderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken dr JJ van der Klink voor de hulp bij de keuze en montage van de apparatuur, evenals Dr F. Kateb en Dr. G. Bertho voor nuttige discussies. AC werd gesteund door de Swiss National Science Foundation (verlenen PPOOP2_157547). Wij erkennen de financiering van Parijs Sorbonne Cité (NMR @ Com, DIM Analytics, Ville de Paris, de Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708), en de Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Ons team is onderdeel van Equipex programma&#39;s Paris-en-Résonance en CACSICE.

Opmerking: Alle data-analyse werd uitgevoerd met commerciële software. 1. Bereid de polariserende Solution <ol><li> Bereid 2 ml van een 1,12 M 13-gelabeld natriumpyruvaat (Na + [CH3-CO- 13 COO] -, substraat) oplossing gedoteerd met 33 mM TEMPOL radicaal (4-hydroxy-2,2,6,6- tetramethylpiperidine-1-oxyl, polariserende agent) 4 in 2: 1 d 2 O / d 6 ethanol voor 13 waarnemingen C. LET OP: Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen als gevolg van de brandbare aard van d 6 ethanol. </li><li> Controleer of de radicale concentratie optimaal is in termen van behaalde polarisatie. <ol><li> Veranderen enigszins de radicale concentratie van de oplossing in punt 1.1 (bijvoorbeeld tot 30 mM of 35 mM). </li><li> Bepaal iteratief de solid-state enhancement (zie stap 3) en vind de radicale concentratie die leidt tot de maximale verhoging. </li></ol></li></ol> 2. Polarization <ol><li> Verlaag de DNP cryostaat temperatuur door de cooldown procedure. Klik op de &#39;Cooldown&#39; knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D). </li><li> Verzamel vloeibaar helium in de DNP cryostaat door middel van het vullen. Klik op de &#39;Filling&#39; knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D). </li><li> Plaats 300 pl van de geoptimaliseerde polariserende oplossing van stap 1.1 in de monsterhouder voorzien van de DNP polarisator. Bevries de monsterhouder met het monster binnen door zachtjes dompelen in een vloeibaar stikstof bad. </li><li> Elimineer de vloeibare stikstof die in de monsterhouder na invriezen (stap 2,3) door extraheren van de monsterhouder uit de vloeibare stikstof bad en draaien ondersteboven zijn. OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om een ​​gedegen oplossing van het monster te verkrijgen (zie stap 5). </li><li> Plaats het monster in de cryostaat. LET OP: Deze Step, samengesteld uit de volgende deelstap, snel moeten worden uitgevoerd (dat wil zeggen, in minder dan 10-20 seconden) om het monster smelten voorkomen. <ol><li> Plaats het monster container in de monsterhouder. Schuif de monsterhouder in de belangrijkste cryostaat insert. Steek de microgolven golfgeleider in de monsterhouder. </li></ol></li><li> Verlaag de cryostaat temperatuur door het starten van de 1 K koeling procedure. Klik op de &#39;1K Cooling&#39; knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D). </li><li> Schakel de magnetron bron in en bestralen van het monster. Klik op de &#39;MW-ON knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D). </li></ol> 3. Solid-state NMR metingen <ol><li> Koppel de coaxkabel van de NMR-console detectie kanaal uit de spectrometer spoel door het draaien van de connector tegen de klok in 90 ° en te trekken. Steek de coaxiale kabel van de detectie-kanaal naar de coaxiale connector van de cryostaatNMR-spoel. Steek de mannelijke connector van de NMR console kabel in de vrouwelijke connector van de cryostaat NMR-spoel, met aandacht voor de oriëntatie pin; Duw stevig vast en draai de connector met de klok mee 90 °. </li><li> Meet de thermische NMR signaal in de vaste toestand bij de cryostaat plaatse met een simpele puls-sequentie verwerven met niet gekalibreerde lage flip-hoek pulsen herhaald met een interval van T = 5 min. Na het opzetten van de meting, schrijven in de opdrachtregel van de software &#39;zg&#39; en druk op &#39;Enter&#39; toets op het toetsenbord. Raadpleeg de NMR-spectrometer handleiding voor meer informatie over spectrometer werking en meetopstelling. </li><li> Meet de DNP-versterkte NMR signaal. Herhaal de handelingen van stap 3.2 na de inleiding van de DNP-proces zoals beschreven in paragraaf 2. </li><li> Koppel de NMR console detectie kanaal coaxiale kabel van de cryostaat NMR-spoel door het draaien van de connector tegen de klok in 90 ° en te trekken. Steek de coaxiale kabel van de detection kanaal naar de coaxiale connector van de spectrometer spoel. Steek de mannelijke connector van de NMR console kabel in de vrouwelijke connector van de spectrometer spoel, met aandacht voor de oriëntatie pin; Duw stevig vast en draai de connector met de klok mee 90 °. </li></ol> 4. Optimaliseer de homogeniteit van het Main Magnet Field ( &#39;vulplaten&#39;) <ol><li> Plaats in de spectrometer een buis met 500 ui van het mengsel verkregen in eerdere experimenten (dwz na stap 6,2). </li><li> Voer NMR spectrometer vulplaten door het variëren van de stroom in de shimming gradientspoelen zoek de maximale &quot;lock-signaal van deuterium. Selecteer de gewenste shimming spoel door op de bijbehorende knop op de NMR-console. <ol><li> Draai de knop op de NMR console de rotatierichting dat het slot signaal toeneemt bepalen. Blijven draaien totdat het signaal een maximum bereikt. Selecteer een andere vulplaten spoel en herhaal de maximalisatie until een lokaal maximum van alle shimming spoelen wordt gevonden. Raadpleeg de NMR-spectrometer handleiding voor meer informatie. Aan het einde, verwijder het monster wordt gebruikt voor vergrendeling. </li></ol></li></ol> 5. Ontbinding <ol><li> Plaats 5 ml van D 2 O in de ontbinding insert ketel. Druk en warmte het D2O via de weerstandsdraad tot T ≈ 180-200 ° C wordt bereikt. Klik op het &#39;Prepare Heater&#39; knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D). </li><li> Na voltooiing van het monster polarisatie procedure (bijvoorbeeld na 3 T DNP) op druk cryostaat iets boven kamerdruk. Klik op de knop &#39;SS Operations&#39; op de cryostaat software-interface (Figuur 2D). Verwijder de magnetron gids van de ontbinding insert. </li><li> Schuif de ontbinding insert (Figuur 3B) naar beneden in de monsterhouder (Figuur 3A-C). Het oplossen inzetstuk aan de bodem van de monsterhouder bereikt en moet volledig bij een lekdichte verbinding met de monsterhouder maken om D2O lekken in de cryostaat voorkomen. </li><li> Op de hardware trekker (Figuur 3C-h) de ontbinding sequentie, een vooraf bepaalde getimede opeenvolging van pneumatische kleppen werkzaamheden aanvangen. </li></ol> 6. Injectie <ol><li> Voordat ontbinding plaats van een 5 mm NMR-buis, met 500 pi monster (bijvoorbeeld, D 2 O <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> meting in stap 7 of LDH oplossing van stap 8 voor enzymatische activiteit gemeten in stap 9), in het isocentrum van de 11,74 T NMR spectrometer (zie stap 4). </li><li> Net na ontbinding (stap 5), meng 500 pi gehyperpolariseerd oplossing met het monster geplaatst in de NMR-spectrometer in stap 6,1. <ol><li> Handmatig Injection: het verzamelen van de hypergepolariseerdeoplossing aan het einde van een 2,5 m lange verbindingsleiding in een bekerglas geplaatst nabij de NMR-spectrometer magneet. Handmatig injecteren 500 pi gehyperpolariseerd oplossing in de NMR-monsterbuis door middel van een op maat gemaakte capillair systeem. </li><li> Automatische injectie: vóór de ontbinding proces, sluit de verbindingsbuis een geautomatiseerde op maat gemaakte injectie apparaat dat het hypergepolariseerde oplossing uit de helium gas wordt gebruikt voor de overdracht van elkaar scheidt. Het apparaat geeft automatisch 500 ul van gehyperpolariseerd oplossing in de monsterbus. </li></ol></li></ol> 7. Liquid-state NMR Measurement <ol><li> Nadat het oplossen Meet de NMR gehyperpolariseerde signaal van het monster in de spectrometer door een reeks van 10 ° kantelhoek pulse-verwerven sequenties gescheiden door 1,5 sec om de progressie van magnetisatie van het substraat (A) en het product (B) volgen. Na het opzetten van de meting, schrijven in de opdrachtregel van de software &#39;zg&#39; en druk op de &amp; #39; Enter &#39;toets op het toetsenbord. Raadpleeg de NMR-spectrometer handleiding voor meer informatie over spectrometer werking en meetopstelling. </li><li> Zodra de magnetisatie volledig ontspannen (dat wil zeggen, na t = 10 T 1), meet de thermische NMR signaal door een reeks van 90 ° kantelhoek pulse-verwerven sequenties gescheiden door T = 3 1 T ≈ 3 min. Na het opzetten van de meting, schrijven in de opdrachtregel van de software &#39;zg&#39; en druk op &#39;Enter&#39; toets op het toetsenbord. Raadpleeg de NMR-spectrometer handleiding voor meer informatie over spectrometer werking en meetopstelling. </li></ol> 8. Bereiding van enzym bevattende monsters (specifiek voor pyruvaat tot lactaat Transformation) <ol><li> Bereid de reactiebuffer met het volgende recept: 50 mM gereduceerd nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), 1 mM ethyleen--azijnzuur (EDTA), 0,1 mM dithiothreïtol (DTT) in 0,1 M fosfaatbuffer, pH =7.0. </li><li> Bereid een konijn spier LDH oplossing 1 U / ml vers bereid in reactiebuffer bij 20 ug / ml runderserumalbumine, BSA. </li><li> Meng 478 gl reactiebuffer (stap 8,1), 20 gl D2O mogelijk te maken spectrometer veld stabilisatie ( &#39;vergrendeling&#39;) en 2 pl LDH-oplossing (stap 7,2). </li><li> Plaats de 500 ul volume van de oplossing bereid in Stap 8,3 in een 5 mm NMR-buis en plaatst de buis in de 500 MHz NMR spectrometer. </li></ol> 9. Compleet enzymatische reactie Rate Measurement Procedure <ol><li> Bereid de polariserende monster (stap 1) en polariseren is (stap 2). </li><li> Voer vulplaten op de spectrometer (Stap 4) uiteenzetten en de enzymatische monster (stap 8). </li><li> Voer de ontbinding (stap 5) en de injectie (Stap 6). </li><li> Meten een reeks signalen van het gehyperpolariseerde monster met 10 ° kantelhoek acquisities pulsen gescheiden door 1,5 sec (stap 7). Deze stap maakt het meten van het hypergepolariseerdesignaal verval en het signaal opbouw van metabolieten. </li></ol> 10. Fitting <ol><li> Iedere afgenomen in stap 9,4 spectrum identificeren van de pieken die overeenkomen met substraat (A) en product (B) respectievelijk en integreren (bepalen piekoppervlak). De pieken integralen geven de magnetisatie tijdsverloop signalen (M (A, B) (t), zie vergelijking 2). </li><li> Met oplossing van vergelijking (2), bepaalt de waarde van F = (RA + k eff ) Vanaf een eenvoudige exponentiële fit van het substraat geïntegreerde signaal in stap 10,1. </li><li> Met behulp van de waarde F = (R A + k eff ) Bepaald in stap 10,2, bepalen k eff en RB een fit van het produktsignaal M B (t) met de functie verkregen door integratie van vergelijking (2). Raadpleeg Representatieve resultaten sectie (Enzymatic activiteit en metabole metingen) voor details over de reactie modelleren, montage en rf correctie. </li></ol>

<ol><li>Overhauser, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+Nuclei+in+Metals%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Polarization of Nuclei in Metals.</a> Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).</li>
<li>Abragam, A., Goldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+dynamic+nuclear+polarisation%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Principles of dynamic nuclear polarisation.</a> Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).</li>
<li>Wolber, J., Ellner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+highly+polarized+nuclear+spins+in+solution+using+dynamic+nuclear+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Inst.+Met.+Phys.+Res.+Sec.+A%22%5BJournal%5D)">Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization.</a> Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).</li>
<li>Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+35%25+liquid-state+13C+polarization+obtained+via+dissolution+dynamic+nuclear+polarization+at+7+T+and+1+K+using+ubiquitous+nitroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals.</a> PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).</li>
<li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%3E+10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR.</a> PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).</li>
<li>Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B2-13C%5D-Fructose%3A+A+Hemiketal+DNP+Substrate+for+In+Vivo+Metabolic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging.</a> JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Rate+Determination+by+Dynamic+Nuclear+Polarization+Enhanced+NMR+of+a+Diels%E2%88%92Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction.</a> An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).</li>
<li>Harrison, C., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kinetic+models+for+analysis+of+pyruvate-to-lactate+exchange+by+hyperpolarized+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR.</a> NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+visualization+of+betaine+aldehyde+synthesis+and+oxidation+using+hyperpolarized+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy.</a> Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).</li>
<li>Lerche, M. H., Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dynamic+nuclear+polarization-NMR+on+blood+plasma+for+assays+of+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism.</a> NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).</li>
<li>Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+of+Patients+with+Prostate+Cancer+Using+Hyperpolarized+%5B1-13C%5DPyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Trans.+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate.</a> Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108(2013).</li>
<li>Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cancer+Metabolism+by+Imaging+Hyperpolarized+Nuclei%3A+Prospects+for+Translation+to+Clinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research.</a> Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Magnetic+Resonance+as+a+Sensitive+Detector+of+Metabolic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function.</a> Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+T-1+limit%3A+Singlet+nuclear+spin+states+in+low+magnetic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22PRL%22%5BJournal%5D)">Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields.</a> PRL. 92 (15), 153003(2004).</li>
<li>Carravetta, M., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+long-lived+nuclear+spin+states+in+solution+nuclear+magnetic+resonance.+I.+Singlet+states+in+low+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field.</a> J. Chem. Phys. 122 (21), 214505(2005).</li>
<li>Vasos, P. R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+states+to+sustain+hyperpolarized+magnetization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization.</a> PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).</li>
<li>Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+long-lived+13C2+state+lifetimes+at+natural+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22JMR%22%5BJournal%5D)">Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance.</a> JMR. 239, 81-86 (2014).</li>
<li>Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-lived+nuclear+singlet+state+of+N-15-nitrous+oxide+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution.</a> JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).</li>
<li>Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nuclear+Singlet+Lifetime+of+More+than+One+Hour+in+Room-Temperature+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Ange.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution.</a> Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).</li>
<li>Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+Persistent+Singlet+State+of+N%282%29O+in+Blood+and+Other+Solvents-Potential+as+a+Magnetic+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22MRM%22%5BJournal%5D)">Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer.</a> MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Comment, A., van den Brandt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+a+DNP+prepolarizer+coupled+to+a+rodent+MRI+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner.</a> Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).</li>
<li>Balzan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Molecular+Magnetic+Resonance+Imaging+and+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+using+Hyperpolarized+Nuclei%22">Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei</a>. 5966, EPFL - EDPY. Available from:
 <a target="_blank" href="http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf">http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf</a> 1-140 (2013).</li>
<li>Bornet, A., Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+by+Cross+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JPC+Letters%22%5BJournal%5D)">Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization.</a> JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).</li>
<li>Bowen, S., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+injection+for+hyperpolarized+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy.</a> PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).</li>
<li>Cavadini, S., Vasos, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+states+open+the+way+to+longer+time-scales+in+the+measurement+of+diffusion+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy.</a> Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+States+in+Multiple-Spin+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-lived States in Multiple-Spin Systems.</a> Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+hyperpolarisation+preserved+in+long-lived+states%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states.</a> Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).</li>
<li>Sarkar, R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+of+15N-Choline+Metabolites+Enhanced+by+Dynamic+Nuclear+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization.</a> JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze niet hebben concurrerende financiële belangen

De kritische punten van de ontbinding DNP NMR experiment zijn: (i) het polarisatieniveau bereikt voor het substraat, waarbij het laagste productconcentratie noodzakelijk experimenten en het aantal signaal acquisities die kunnen worden uitgevoerd en (ii) de levensduur bepaalt magnetisatierichting ten opzichte van de duur van de overdracht tussen de polarisatie en de detectie sites en de snelheid van substraat transformatie. Het injectiesysteem van de ontbinding DNP opstart hierin beschreven maakt monsteroverdrachtsstrook...

Dynamic nucleaire polarisatie (DNP), 1,2 een techniek ontwikkeld om de kernspin polarisatie, dat wil zeggen, het gebrek aan evenwicht tussen de &#39;up&#39; en &#39;down&#39; spin populaties (P = verbeteren [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), werd het eerst geïntroduceerd in 1950. Kernspins zoals 13C kan worden gepolariseerd P = -1 10 in gunstige omstandigheden, kenmerkend bij een temperatuur in de orde van 1 K en in een magnetisch veld van 3,4 3,357 T. Een doorbraak voor biologische toepassingen kwam in de vroege 2000 met de ontwikkeling van ontbinding DNP bestaande in ontdooide gepolariseerde monsters oververhit water met behoud van de hoge nucleaire polarisatieniveau verkregen bij lage temperaturen. 5 de vloeistof-NMR signaal wordt versterkt met een factor 10 3 -10 4 ten opzichte gemeenschappelijkthermisch-gepolariseerde RT NMR omstandigheden. Ontbinding DNP verschaft derhalve een manier om niet-invasief meten biochemische reactiesnelheden in situ in realtime, waardoor controle dynamiek van NMR met een tijdsresolutie van 1 seconde of minder 6 -. 10 het mogelijk werd ook virustypen in zeer lage concentraties 11. Onder de niet-invasieve moleculaire beeldvorming modaliteiten, hypergepolariseerde NMR is de enige techniek die tegelijkertijd een substraat en metabolieten daarvan in realtime waardoor metingen. Ontbinding DNP werd enthousiast ontvangen in verschillende wetenschappelijke gebieden, variërend van in vitro NMR klinische MRI 12 en de meest veelbelovende toepassingen hebben betrekking op de in situ bewaking van de stofwisseling. 13,14 De belangrijkste beperking van ontbinding DNP is dat na verloop van tijd op de volgorde van vijfmaal de longitudinale relaxatietijd T1 constant, de verbeterde polaireordening is verloren. Het is daarom noodzakelijk om moleculen te dragen nucleaire spins vertonen relatief lange T 1 te gebruiken. De tijdspanne van de polarisatie verbetering breiden, langzaam ontspannen kernspin toestanden, bekend als langlevende toestanden (LLS), kan worden gebruikt 15 -. 17 LLS ongevoelig zijn voor de intra-pair dipool-dipool wisselwerking, zodat hun karakteristieke relaxatietijdconstante t LLS, kan veel langer dan T1. 18 een magnetisatie levensduur van tientallen minuten tot 1 uur kan daarom worden verkregen, 19,20 en LLS zijn zowel resonantiespectroscopie voorgesteld (MRS) en MRI. 21 De belangrijkste punten die zorgvuldig moeten worden geoptimaliseerd voor het bestuderen van enzymatische reactiesnelheden door hypergepolariseerde NMR zijn: (i) het maximaliseren van de solid-state polarisatie en (ii) het minimaliseren van de polarisatie verlies tijdens het overbrengen van het gehyperpolariseerde oplossing vanpolarisator aan de NMR spectrometer. Dit artikel beschrijft de aanpassing van een op maat gemaakte oplossing DNP apparatuur en injectie systeem om enzymatische reacties te bestuderen. De eigenschappen en prestaties van de installatie zal worden gedemonstreerd met de bekende en algemeen gebruikte gehyperpolariseerde substraat [1- 13 C] pyruvaat. De belangrijkste redenen voor deze keuze zijn, ten eerste, het is natuurlijk lang 13C longitudinale relaxatietijd (T 1&gt; 50 sec bij hoge magnetische velden en temperaturen boven 293 K), die toezicht reacties mogelijk maakt gedurende een aantal minuten, en ten tweede zijn centrale rol in kanker metabolisme. 13,14 behulp oplossen DNP NMR en een speciaal ontwikkelde injectiesysteem, de oxidatie van pyruvaat gekatalyseerd door lactaatdehydrogenase (LDH) kan worden gecontroleerd aanwezigheid van een eerste verzameling ongemerkt lactaat 9,22 of zonder ongelabelde lactaat toegevoegd , zoals hier getoond. Aangetoond is dat de [1- 13 C] lactaat gemeten signaal in vivo (met inbegrip van in de cellen) na de injectie van gehyperpolariseerde [1- 13 C] pyruvaat is voornamelijk te wijten aan een snelle label uitwisseling tussen pyruvaat en lactaat in plaats van lactaat productie. 6 We presenteren hier de realtimeproductie van [1- 13 C] lactaat van gehyperpolariseerde [1- 13 C] pyruvaat geïnjecteerd in een NMR-buis met LDH maar aanvankelijk geen lactaat. Systeembeschrijving Er zijn twee belangrijke onderdelen in een ontbinding DNP setup (figuur 1): de DNP polarisator en de NMR-spectrometer. Het belangrijkste element van de DNP polarisator een cryostaat koeling van het monster tot ongeveer 1 K in een bad gepompt helium. De cryostaat wordt in een 3,35 T supergeleidende magneet en een geometrie heeft die garandeert de gepolariseerde monster bij het ​​isocentrum van de magneet (figuur 1) hebben. Binnen de cryostaat, het monster (a) wordt omringd door een NMR-spoel (b) om de polarisatie te meten buildup, in een overmoded microgolfruimte (c). Het gehele monster wordt bewaard bij lage temperatuur in een bad gepompt helium (d) en bestraald met microgolven door de golfgeleider. Het hele systeem wordt beheerd door op maat gemaakte software (Figuur 2D). De hardware en cryogene apparatuur die nodig is om DNP te voeren en de daaropvolgende ontbinding zijn nog steeds een technologische uitdaging. Een nieuwe DNP cryostaat 23,24 werd ontwikkeld en getest om de cryogene prestaties te bepalen en vervolgens geoptimaliseerd voor snelle cool-down, helium hold-tijd en de totale minimale helium verbruik tijdens het gebruik. De cryostaat bestaat uit twee delen. Het eerste deel van de cryostaat is de isolatie Dewar (figuur 2A) die ongeveer in bovenste deel kan worden gescheiden (a) de staart of uitkomstenruimte (b) en de buitenste vacuümkamer (OVC) gehouden onder hoog vacuüm en huisvesting de stralingsschermen (c). Het tweede deel van de cryostaat is de belangrijkste insert (figuur 2B), geplaatst in de isolerende Dewar, waarbij alle processchema voorschriften worden beheerd. De vloeibare helium uit de externe opslag Dewar door de transportleiding (a), in de eerste trap gecondenseerd in de afscheider (b), een tussenkamer die zowel aan de bovenkant van de cryostaat koud en de helium afgedampt verwijderen tijdens de overdracht. De separator druk wordt verlaagd door pompen door een capillair (c) rond het bovenste deel van de cryostaat; de stroom van koude helium in de capillair wordt gebruikt afkoelen van de schotten (d) en de stralingsschermen in de isolatie Dewar (OVC). Het monster wordt geplaatst en gepolariseerd in de steekproef ruimte. De uitkomstenruimte is verbonden met de separator via een andere capillair (e), rond de staart van de belangrijkste cryostaat insert. Dit capillair kan worden geopend of gesloten door een naaldklep handbediende buiten. Om de lage temperatuur gebruikt tijdens de DNP pr bereikenocess, vloeibaar helium moet worden verzameld in de cryostaat steekproef ruimte en de druk verlaagd tot het mbar bereik. De handelingen die nodig zijn voor cryostaat operatie worden uitgevoerd door middel van een vrij complex pompsysteem met drie sets van pompen, bewaakt en beheerd in verschillende plaatsen met elektronische en elektro-mechanische instrumenten (figuur 2C). De cryostaat OVC dient door het eerste pompsysteem naar hoog vacuüm te pompen. Dit systeem bestaat uit een turbomoleculaire pomp ondersteund door een rotatiepomp (a). De vloeibare helium wordt vanuit de opslag Dewar (b) door de cryostaat transportleiding inlaat naar de cryostaat separator. De separator heeft een uitlaat verbonden met de tweede pompende set. Deze set bestaat uit een 35 m 3 / h membraanpomp (c). Deze lijn maakt het verwijderen van het heliumgas gekookt tijdens de overdracht van de Dewar en tijdens separator koeling. De vloeibare helium verzameld in de afscheider kunnen dan worden overgebracht naar de monsterruimte door de dopIllary buizen hierboven beschreven. Vloeibare helium brengen van de scheider naar de monsterruimte vervolgens lagere uitkomstenruimte druk bereik, een derde pompsysteem bestaande uit een 250 m 3 / uur Roots mbar pomp ondersteund door een 65 m 3 / uur centrifugaalpomp (d) is verbonden met de cryostaat via een handmatige vlinderklep (e). Alle vacuümsysteem activiteit wordt gecontroleerd en gereguleerd door een elektro-hulpmiddel naar maat (f). Dit apparaat regelt vacuüm lijn verbindingen tussen de cryostaat separator (g) en sample ruimte (h) verkooppunten, de tweede / pompsystemen derde (c, d), een gecomprimeerde helium fles (i) en de buitenwereld. Communicatie tussen (f) als buiten gaat door een eenrichtingsklep (j). De elektro-pneumatische inrichting (f) en alle systeemparameters en de ontbinding hardware worden gecontroleerd en beheerd door een op maat gemaakte elektronische inrichting aangesloten USB met een gemeenschappelijke pc. Uiteindelijk alle systeem via het elektronischeapparaat, wordt beheerd door op maat gemaakte standalone software (Figuur 2D) in voorkomend geval activiteiten worden gelanceerd door middel van een interface met behulp van software knoppen. Om het monster te beheren en meet NMR signaal opbouw in vaste toestand een aantal inserts (Figuur 3A). Om de cryostaat voor polarisatie te bereiden, plaatst u de belangrijkste monster inzetstuk (a), in de cryostaat. De hoofdmonster inzetstuk is voorzien van een NMR-spoel (b) geplaatst binnen een overmoded verguld microgolfruimte. Pre-vries het substraat bevattende oplossing gepolariseerd (polariserende oplossing) bij de temperatuur van vloeibare stikstof in een geschikte monsterhouder en plaats het op het bodemeinde van de glasvezel monsterhouder (c). Schuif de monsterhouder in de belangrijkste monster insert aan de magneet isocentrum bereiken. Steek de vergulde golfgeleider (d) in het monster houder. De golfgeleider kan de microgolf gegenereerd vanuit een externe microgolfbron reizen met minimale verliezen to het monster. De op maat gemaakte software voor cryostaat beheer verwerkt automatisch op op de overeenkomende interface-toets verschillende bewerkingen zoals cooldown (de cryostaat temperatuur dicht verlaagd tot vloeibaar helium temperatuur), het vullen (de cryostaat is gevuld met vloeibaar helium tot een vooraf bepaald niveau ), een extra stap van het afkoelen tot T ≈ 1 K (het vloeibare helium bad wordt gepompt de laagst mogelijke temperatuur te bereiken), druk brengen (de cryostaat enigszins druk boven kamertemperatuur druk P = 10-30 mbar cryostaat opening zonder risico toestaan besmetting van de cryostaat per vliegtuig) en oplossing (automatische procedure om de DNP monster op te lossen en breng de verkregen oplossing van het hypergepolariseerde meetplaats, dwz de NMR spectrometer). De polarisatie wordt uitgevoerd bestralen van het monster met microgolven op 94 GHz (in een polariserend veld B 0 </sub&gt; = 3,35 T). Een monster geacht volledig gepolariseerd na 3 DNP T, waarbij T DNP is de polarisatie opbouw tijd. T DNP is van dezelfde orde van grootte als de longitudinale relaxatietijd van het doel kernen in vaste toestand bij het ​​gegeven gebied en temperatuur. In alle experimenten werd het monster gepolariseerd langer dan 5 T DNP. Aan het einde van de polarisatie tijd, het monster moet worden opgelost in een RT oplossing om te worden gebruikt voor het meten van enzymatische activiteit. Tijdens het oplossingsproces worden 5 ml oververhitte D 2 O uit de ketel van de ontbinding insert (Figuur 3B) gedrukt door samengeperst helium gas (P = 6-8 bar) om de DNP-versterkte staal te bereiken en los het. De resulterende hypergepolariseerde oplossing wordt naar buiten geduwd de ontbinding insert door de samengeperst gas helium, door de ontbinding insert het stopcontact (zie 3C-b </sTrong&gt;), een 2 mm binnendiameter teflon verbindingsbuis. De tijd die nodig is voor het oplossen proces is 300 msec. 23 De tijd die nodig is voor de steekproef transfer van de DNP polarisator om de NMR-spectrometer site gaat over 3 sec. Het oplossingsproces wordt uitgevoerd met een oplossing insert (Figuur 3B). Het oplossen inzetstuk bestaat uit een elektronisch-pneumatische eenheid (a), een koolstofvezel stok (b) met verbindingsslangen tussen de boiler in de pneumatische montage en de monsterhouder kast (c), die lekdichte koppeling maakt met het monster container, en terug naar de uitlaat. De elektropneumatische samenstel (figuur 3C) wordt gebruikt voor de productie en rijden oververhitte D 2 O tot de koolstofvezel vasthouden aan de monsterhouder en vervolgens het gehyperpolariseerde oplossing uit de cryostaat extraheren. De elektro-pneumatische assemblage bestaat uit pneumatische kleppen (a) dat de verbindingen tussen de co controlempressed helium (P = 6-8 bar) lijn (b), het toestel (c) wanneer de D 2 O wordt geïnjecteerd door de klep (d) en de uitlaat (e) door de koolstofvezel stok (f). Het systeem wordt gecompleteerd door een druk G, een thermometer en een verwarmingsmantel weerstandsdraad in de ketel (c), een trekker (h) en een aansluitdoos (i) gebruikt om het systeem te communiceren met het elektronisch beheer inrichting. De DNP cryostaat en de NMR-spectrometer verbonden met een transportleiding, dwz een PTFE-buis van 2 mm binnendiameter waarbinnen het gehyperpolariseerde oplossing wordt geduwd door druk gebrachte helium (P = 6-8 bar) bij ontbinding wordt geactiveerd. Het oplossen sequentie bestaat uit de volgende stappen: in de eerste 300 msec, oververhitte D 2 O wordt geduwd om de monsterhouder om te smelten en los het hypergepolariseerde bevroren oplossing. Daarna wordt het hypergepolariseerde oplossing geëxtraheerd uit de cryostaat zich op grond van pressurized (P = 6-8 bar) heliumgas en geduwd door de 2 mm binnendiameter PTFE-buis (figuur 3C-e) om de meting plaats waar de injectie wordt uitgevoerd met een van de in stap beschreven procedures 6.2.1 of Step 6.2 0,2. De tweede component van de ontbinding DNP NMR opstelling is de NMR spectrometer. In de hierin beschreven opstelling, de NMR-spectrometer werkt op een veld B 0 = 11,7 Tesla. Een 5 mm NMR probe wordt gebruikt om het gehyperpolariseerde signaal na ontbinding meten. De NMR-spectrometer wordt bediend door middel van de NMR-console, gebruikt voor zowel solid-state en vloeibare toestand NMR-metingen, en de firma meegeleverde software XWinNMR. Een typische meting bestaat uit een lage kantelhoek vaste puls (hetzij gekalibreerd voor liquidstate of niet gekalibreerde voor solid-state metingen) gevolgd door signaal acquisities. Metingen van de solid state thermische polarisatie signaal en DNP-afgeleide signaal opbouw worden uitgevoerd met de op maat gemaakte 13 C spoel op de plaats van de DNP polarisator (figuur 3ab) gekoppeld aan de NMR spectrometer. In deze specifieke situatie de NMR-spectrometer niet signaal vergrendeling uit te voeren. Wanneer solid-state metingen worden uitgevoerd, aanzienlijke verstoringen op de polarisatie te voorkomen, moet de tijd tussen verwervingen lang genoeg is globaal meer dan 0,5 T DNP. Het vaste verbetering wordt gedefinieerd als <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation4.jpg" width="100" /> waar <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" /> wordt het hypergepolariseerde signaal (verkregen in stap 3,3) en <img alt="Equation6" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation6.jpg" width="23" /> is de solid state signaal (verkregen bij thermisch evenwicht bij gepompt vloeibaar helium temperatuur in stap 3.2) (Figuur 4A). Deze parameter defines de maximale polarisatie vindt NMR experimenten vóór onvermijdelijke verliezen tijdens het overbrengen van het gehyperpolariseerde oplossing. De meting wordt uitgevoerd met een eenvoudige puls-verwerven sequentie met behulp van een niet-gekalibreerde lage flip hoek pols. Puls kalibratie wordt vaak overgeslagen solidstate metingen. Een analoge procedure kan worden gebruikt om het gehyperpolariseerde signaalversterking in de vloeibare toestand te bepalen. In dit geval wordt het monster geplaatst in de spectrometer buis voor de injectie (stap 6,2), bestaande uit 500 gl D 2 O. Na oplossing en injectie, zijn er twee belangrijke parameters te controleren. De eerste is de versterking van de hypergepolariseerde NMR spectrometer site, <img alt="Equation7" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation7.jpg" width="95" /> (Figuur 4B), waarbij <img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" /> het signaal direct na de injectie van de hyper<html> gepolariseerde oplossing (verkregen in stap 7,1) en <img alt="Equation9" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation9.jpg" width="20" /> is de thermische polarisatiesignaal (verkregen in stap 7,2). De tweede is de longitudinale relaxatietijd T1 (Figuur 4B, bijvoegsel), verbonden met het substraat en elke stofwisselingsproduct (verkregen door exponentiële fitting signalen verkregen in stap 7,1). Deze twee parameters bepalen de minimum substraatconcentratie gezorgd voor een voldoende signaal-ruisverhouding (SNR) en de beschikbare tijdvenster voor de meting van de metabole omzettingen te verkrijgen. De verhouding tussen de solid-state polarisatie <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> en liquidstate polarisatie <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> geeft een schatting van de polarisatie verliezen door ontspanning tijdens het gehyperpolariseerde oplossing overdracht. Een waardeation12 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt; moeten worden waargenomen in afwezigheid van ontspanning verliezen.

<table><tbody><tr><td>DNP polarizer</td><td>Vanderklink s.a.r.l (Zwitserland)</td><td>///</td><td>Cryostat en elektronische apparatuur voor monsterpolarisatie</td></tr><tr><td>Vacuum systeem componenten</td><td>Edwards vacuum (Frankrijk)</td><td>Verschillende</td><td> - turbomoleculaire pompopstelling - membraan pompopstelling - roots pompsysteem met hoge capaciteit - vacuüm fittingen en componenten </td></tr><tr><td>DNP 3.35T Magneet</td><td>Bruker (Frankrijk)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 MHz NMR Spectrometer</td><td>Bruker (Frankrijk)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (VS)</td><td></td><td>Data-analyse software</td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETHANOL-D6, WATERVRIJ, 99.5 ATOM % D</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;4-Hydroxy-TEMPO 97%</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>gereduceerd nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfaat buffer, pH&nbsp;=&nbsp;7.0</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDH enzym in&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>boviens serum albumine, BSA</td><td>Sigma Aldrich (Frankrijk)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontbinding dynamic nuclear polarisatie instrumentatie voor real-time enzymatische reactie snelheidsmetingen door nmr

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

De belangrijkste beperking van NMR-based onderzoek is een lage gevoeligheid. Dit vraagt ​​om lange overname tijden, waardoor het voorkomen van real-time NMR metingen van metabole omzettingen. Hyperpolarisatie via ontbinding DNP omzeilt deel van de gevoeligheid geeft dankzij de grote out-of-evenwicht kernmagnetisatie gevolg van de elektron-to-kern rotatie polarisatieoverdracht. De hoge NMR verkregen signaal kan worden gebruikt om chemische reacties in real time. Het nadeel van hypergepolariseerde NMR woont in de beperkte tijd venster beschikbaar voor signaal acquisitie, die meestal in de orde van de kernspin longitudinale relaxatietijdconstante, T 1, of, in gunstige gevallen, aan de orde van de relaxatietijdconstante in verband met de singlet-toestand van gekoppelde kernen, T LLS. Cellulaire opname van endogene moleculen en stofwisseling kan essentiële informatie over de ontwikkeling van tumoren en drugs antwoord te geven. Numerous vorige hypergepolariseerde NMR studies hebben de relevantie van pyruvaat aangetoond dat een metabole substraat voor het bewaken van enzymatische activiteit in vivo. Dit werk geeft een gedetailleerde beschrijving van de experimentele opstelling en die vereist zijn voor het bestuderen van enzymatische reacties, met name de pyruvaat tot lactaat succespercentage in aanwezigheid van lactaat dehydrogenase (LDH) door hypergepolariseerde NMR.

NMR signaal winsten met behulp van ontbinding DNP De DNP effect aan de overdracht van de hoge polarisatie van ongepaard elektron spins, typisch van stabiele radicalen moleculen NMR-actieve kernen onder microgolfbestraling van het monster. De meest gebruikte vrije radicalen zijn TAM (OXO63) en TEMPOL. 4 Polarisatie procedures met behulp van TEMPOL kan worden geoptimaliseerd door &#39;cross-polarisatie&#39;. 25 <p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

De gevoeligheidsverbetering die wordt geboden door oplossingsdynamische nucleaire polarisatie (DNP) maakt het mogelijk metabolische processen in realtime te volgen door NMR en MRI. De kenmerken en prestaties van een specifiek oplossings-DNP-setup dat is ontworpen voor het bestuderen van enzymatische reacties worden besproken.

Ontbinding Dynamic Nuclear Polarisatie Instrumentatie voor Real-time enzymatische reactie snelheidsmetingen door NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Het algemene doel van dit experiment is om enzymatische processen in real-time te volgen middels nucleaire magnetische resonantie versterkt door dynamische nucleaire polarisatie. Magnetische resonantie in vloeibare fase, versterkt door dynamische nucleaire polarisatie (DNP), kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen: hoe men bijvoorbeeld de snelheden van enzymatische transformatie van een paar moleculen in een cel of in vivo kan bepalen zonder dit paar moleculen op welke wijze dan ook te hoeven wijzigen. De installatie van onze dissolution DNP-apparatuur in ons laboratorium en de komst van Dr. Riccardo Balzan, PhD van het laboratorium van Arnaud Comment in Lausanne, is een grote stap voorwaarts voor ons onderzoek.DNP verhoogt de gevoeligheid van de experimenten die we kunnen uitvoeren op onze 500 megahertz NMR-spectrometers aanzienlijk. Deze DNP-apparatuur was de eerste die in Frankrijk werd geïnstalleerd en ik wil vermelden dat alle leden van ons NMR-team betrokken waren bij het functioneel maken van deze apparatuur; in het bijzonder wil ik Gildas Bertho, onze onderzoeksingenieur, en Fatiha Kateb, onze maitre de conferences, noemen. Het belangrijkste voordeel van deze technie

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

This video describes the nuclear magnetic resonance spectroscopy technique to study protein-protein interactions between 15N-labeled wild-type and mutant envoplakin proteins and the unlabeled vimentin protein. The successful interaction between wild-type envoplakin and vimentin leads to extensive line broadening and peak disappearance in the NMR spectra, whereas the absence of an interaction between the mutated envoplakin and vimentin results in well-resolved peaks in the NMR spectra.

Nuclear Magnetic Resonance to Study Atomic Level Protein-Protein Interactions

Een dynamische multicompartiment-fantoom wordt gebruikt om bepaalde biologie van belang te simuleren voor metabolische studies met behulp van hypergepolariseerde magneetresonantie-agentia.

Gebruik van een Multi-compartiment Dynamic enkel enzym Phantom voor Studies van gehyperpolariseerd Magnetic Resonance Agents

Een methode nieuwe elektronen paramagnetische resonantie (EPR), een snelle scan EPR (RS-EPR), is aangetoond voor 2D spectrale ruimtelijke beeldvorming die superieur is aan de traditionele continue golf (CW) techniek en opent nieuwe locaties voor in vivo beeldvorming. Resultaten worden gedemonstreerd op 250 MHz, maar de techniek is toepasbaar bij een bepaalde frequentie.

Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters<em&gt; In Vivo</em

Dynamische nucleaire polarisatie met daaropvolgende oplossing van het monster heeft real-time studies van metabolisme in biologische systemen mogelijk gemaakt. Gehyperpolariseerd [1-13C]pyruvaat werd gebruikt om lactate dehydrogenase-activiteit te bestuderen in een prostaatcarcinoom-cellijn in vitro.

hypergepolariseerde 13 C Metabolic magnetische resonantie spectroscopie en beeldvorming

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Een protocol voor het voorbereiden van 13C,15N-geëtiketteerden schimmel en plant monsters voor multidimensionale Solid state NMR spectroscopie en dynamische nucleaire polarisatie (DNP) onderzoeken wordt gepresenteerd.

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

We presenteren een protocol voor het meten van de magnetische veld afhankelijkheid van de spin-Lattice ontspannings tijd van 13C-verrijkte verbindingen, hypergepolariseerd door middel van dynamische nucleaire polarisatie, met behulp van snelle veld-fietste relaxometrie. Concreet hebben we dit aangetoond met [1-13C] Pyruvate, maar het protocol kan worden uitgebreid naar andere hypergepolariseerde substraten.

Meten van de spin-Lattice ontspanning magnetische veld afhankelijkheid van Hypergepolariseerde [1-13C] Pyruvate

Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N-ontspanningsdispersieprofielen door oplossing NMR-spectroscopie.

15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele eiwitdynamica op een residuspecifieke manier karakteriseren. We bieden een hands-on protocol voor het opnemen van NMR 15N, R1 en R2 relaxatie en {1H}-15N heteronucleair Overhauser effect (hetNOE) experimenten, gevoelig voor de picoseconden tot nanoseconden tijdschaal.

NMR 15N relaxatie-experimenten voor het onderzoek van de picoseconde tot nanoseconde structurele dynamica van eiwitten

Dit protocol integreert een op maat gemaakt bioreactorsysteem met gehyperpolariseerde ¹³C NMR-spectroscopie om het real-time pyruvaatmetabolisme in levende cellen te meten, waardoor de reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid voor metabole studies en toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen worden verbeterd.

Real-time metabole detectie in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde 13C NMR

Leer hoe u enzymatische processen in realtime kunt volgen met dynamic nuclear polarization (DNP) NMR. Deze methode verhoogt de gevoeligheid van 500 MHz NMR-spectrometers voor directe kwantificering van substraten zonder moleculen te veranderen.

Ontbinding Dynamic Nuclear Polarisatie Instrumentatie voor Real-time enzymatische reactie snelheidsmetingen door NMR

Meer video's verkennen