Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie
April 2nd, 2016
Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Het algemene doel van deze procedure is om allel-specifieke CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie te gebruiken om de regulatie van gentranscriptie in muizen embryonale stamcellen te bestuderen. Het grote voordeel van deze techniek, die een hybride genoom gebruikt om mono-allelische deleties te genereren en te analyseren. In plaats daarvan elimineert het de noodzaak om mono-allelische versterkte deleties te analyseren die mogelijk niet levensvatbaar zijn.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van functionele genomics te beantwoorden. Zoals, welk gen een specifieke enhancer reguleert en hoe afhankelijk is dat gen van een specifieke enhancer voor zijn activiteit. Deze methode kan inzicht geven in de pluripotentie van stamcellen, het kan ook worden toegepast op andere systemen.
Het kan ons bijvoorbeeld helpen te begrijpen hoe stamcellen hun lot veranderen om neuronen, bloedcellen of spieren te worden. Na het ontwerpen, construeren en bevestigen van de sequentie van de geleide RNA, of gRNA, die zal worden gebruikt, bereid je voor om de endotoxine-vrije plasmiden in ES-cellen te transfecteren. Gebruik een centrifuge, pellet een keer tien tot de zesde F1 embryonale stamcellen gegenereerd door het kruisen van Mus musculus 129 met Mus castaneus in een buis van 1,5 milliliter bij 300 keer g'voor vijf minuten.
Na het draaien, gooi het supernatant weg en voeg 100 microliter van de resuspendatie buffer toe die wordt geleverd door de kitfabrikant. Voor deletie van het doel-DNA-gebied, voeg vijf microgram toe van elk P Cas9 GFP 5-prime en 3-prime gRNA plasmiden. Gebruik een pipet, meng voorzichtig.
Vermijd het introduceren van luchtbellen. Gebruik vervolgens de elektronische pipettip van de microporator om 100 microliter van de elektroporeringsmix aan te zuigen, zorg ervoor dat er geen lucht in de tip komt. Steek vervolgens de pipet in het transfectieapparaat.
Selecteer het juiste protocol en druk op start. Terwijl de elektroporering actief is, observeer de tip. Bij de juiste set-up, zouden kleine bubbels uit de buiselektrode moeten komen.
Een vonk duidt op de aanwezigheid van een luchtbel en zal de transfectie verstoren. Als dit gebeurt, moet de elektroporering worden herhaald met een nieuwe batch cellen. Na de elektroporering, werpt de getransfecteerde cellen in een schotel van tien centimeter bedekt met gelatine bevattend tien milliliter ES-celmedium.
Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Na 48 uur, gebruik een flowcytometer om de cast negen GFP positieve ES-cellen te sorteren en te isoleren. Voed vervolgens tot 1 tot 1,5 keer 10 tot de vierde GFP positieve cellen in een schotel van tien centimeter bedekt met gelatine bevattend tien milliliter ES-celmedium.
Plateren op deze lage dichtheid zal het ophalen van individuele ES-celkolonies vergemakkelijken. Vier tot vijf dagen later, gebruik een microscoop om individuele balvormige, enkele ES-celkolonies te identificeren. Gebruik een pipet om elke kolonie over te brengen naar een put van een 96-wellsplaat voorbehandeld met gelatine en bevattend 30 microliter tripsine.
Zodra alle kolonies zijn opgehaald en in medium gedissocieerd, laat de cellen groeien bij 37 graden Celsius in de koolstofdioxide-incubator tot de meeste putten meer dan 70%conflueert zijn. Dit duurt meestal ongeveer twee dagen. Wanneer de cellen klaar zijn om te splitsen, verwijder het medium en voeg 30 microliter tripsine toe.
Incubeer de cellen gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens aan elke put 180 microliter ES-celmedium toe om de tripsine te neutraliseren. Pipet omhoog en omlaag om een enkele cel suspensie te bereiken.
Van elke put, breng 70 microliter over naar elk van de drie gelatine-gecoate 96-wellsplaten bevattend 130 microliter ES-celmedium in elke put. Incubeer bij 37 graden Celsius. Wanneer de platen 70 tot 85% confluency bereiken, gebruik ze om genotypering en expressieanalyse van elke klon te verrichten, zoals beschreven in de volgende secties.
Bewaar de celstammen zoals beschreven in het bijbehorende document. Hier, vier sets primers zullen worden ontworpen om de klonen te screenen op de gewenste deletie. Deze omvatten: binnenste primers, buitenste primers en gRNA flankerende primers voor zowel 5-prime als 3-prime gRNA doelsites.
Begin door de website hier te bezoeken om de single nucleotide polymorfisme of snip track te verkrijgen die overeenkomt met de 129 en Cas genotypen. Dit leidt naar de Mitchell Lab CRISPR-webpagina. Klik daar op de gegeven link.
De site zal doorsturen naar de UCSC genoombrowser bevattend de track die snips weergeeft tussen de 129 en Cas genomen in de MM-9 muisgenoomsamenstelling. Voer vervolgens de coördinaten van het te verwijderen gebied in. en klik op ga"Zoom in op een regio van ongeveer 500 basenparen in het midden van de gewenste deletie bevattend meer dan drie snips.
Het ontwerp van allel-specifieke primers kan gecompliceerd zijn als snips schaars zijn. Als het niet mogelijk is om absolute allel-specifieke primers te ontwerpen, kunnen gematigde allel-specifieke primers worden gebruikt. Onthoud alleen om de CT waarden te vergelijken tussen de verwijderde en niet-verwijderde klonen tijdens de analyse van de qPCR resultaten.
Klik nu op Weergave"in het bovenste paneel. Selecteer DNA uit het vervolgkeuzemenu. De pagina"DNA in venster ophalen" zal verschijnen.
Kies in de sequentieopmakopties voor alle hoofdletters en klik op DNA ophalen"om de doelsequentie in alle hoofdletters weer te geven. Kopieer deze sequentie en plak deze in een Word-documentbestand. Vergelijk vervolgens de sequentie met de 129 cast snip track en markeer de snip posities en markeer de 129 snips met de kleine letters.
Wanneer u klaar bent met de 129 sequentie, kopieer deze om twee sneldag geformatteerde sequenties te maken. Een voor 129 en een voor Cas. In de cast sequentie, vervang de juiste base op elke snip positie, markeer de snip met een kleine letter.
Label vervolgens de sequentie met het
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het gebruik van CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie om allelspecifieke regulatie van genregulatie in muis embryonale stamcellen te bestuderen. De techniek maakt gebruik van een hybride genoom om de analyse van monoalleel deleties te vergemakkelijken en biedt inzichten in genregulatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Functionele genoomkunde
- Genregulatie
- CRISPR/Cas9 technologie
Achtergrond
- Het begrijpen van enhancer-activiteit is cruciaal voor genregulatie.
- Loss-of-function analyse is een sleutelmethode op dit gebied.
- Muis embryonale stamcellen bieden een model voor het bestuderen van genregulatie.
- Hybride genomen kunnen helpen bij het analyseren van specifieke geninteracties.
Doel van de studie
- Om de rol van specifieke enhancers in genregulatie te onderzoeken.
- Om de afhankelijkheid van genen van specifieke enhancers te bepalen.
- Om het begrip van pluripotentie van stamcellen en toepassingen ervan te verbeteren.
Gebruikte methoden
- CRISPR/Cas9-gemedieerde deletietechniek.
- Gebruik van F1 ES-cellen met een hybride genoom (Mus musculus 129 x Mus castaneus).
- Analyse van monoalleel deleties om genregulatie te bestuderen.
- Experimentele validatie van enhancer-activiteit door middel van loss-of-function analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle implementatie van allelspecifieke deleties in stamcellen.
- Inzichten in de regulatie van genregulatie door specifieke enhancers.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op verschillende biologische systemen.
- Bijdraging aan het begrip van functionele genoomkunde.
Conclusies
- De CRISPR/Cas9-methode is effectief voor het bestuderen van enhancer-activiteit.
- Deze aanpak kan de relatie tussen enhancers en genregulatie verduidelijken.
- Bevindingen kunnen bredere implicaties hebben voor stamcelonderzoek en functionele genoomkunde.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise interrogation of enhancer function through allele-specific CRISPR/Cas9 deletion in hybrid mouse embryonic stem cells, addressing a key challenge in target validation: linking distal regulatory elements to gene expression. By leveraging natural SNPs between Mus musculus 129 and Mus castaneus alleles, the approach supports mechanistic de-risking of transcriptional regulators without confounding homozygous lethality, providing predictive confidence in enhancer-gene relationships early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by testing enhancer necessity for gene expression in a physiologically relevant stem cell model.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through monoallelic loss-of-function analysis that avoids phenotypic confounding from complete regulatory element deletion.
- Scientific Value: Enhances target confidence by providing direct cis-regulatory evidence via allele-specific deletion screening using SNP-discriminating primers.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Facilitates assay standardization through qPCR-based genotyping with allele-specific inside and outside primers to distinguish heterozygous, homozygous, and wild-type clones.
- Operational Value: Enables scalable screening workflow using 96-well plate colony picking and qPCR on 384-well plates for high-throughput deletion validation.
- Operational Value: Supports assay reproducibility by requiring confirmation of no indels on the non-deleted allele via gRNA-flanking primers before expression analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Provides disease-relevant system insights by studying enhancer-mediated regulation of pluripotency factors like Sox2 in mouse embryonic stem cells.
- Translational Value: Supports predictive confidence in stem cell fate decisions by linking enhancer deletion to changes in gene expression relevant to differentiation pathways.
- Translational Value: Enables mechanistic de-risking of enhancer targets through quantitative expression analysis (qPCR) showing allele-specific reduction in target gene transcription.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing functional validation of non-coding regulatory elements prior to therapeutic targeting, with outputs directly informing target prioritization and de-risking decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-gene relationships through allele-specific deletion and expression analysis in a genetically tractable model.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized qPCR workflow using allele-specific primers to quantify deletion efficiency and specificity across clones.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (CT values, melt curves) that enable comparison of allelic expression and deletion zygosity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by studying enhancer function in a stem cell model relevant to differentiation and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for enhancer validation across genomic regions using the same SNP-based primer design and CRISPR workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in enhancer function through direct loss-of-function evidence without compensatory mechanisms from homozygous deletion.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via SNP-guided allele-specific primer design and qPCR screening protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by clarifying enhancer dependency and reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of transcriptional targets based on validated enhancer-gene relationships in a disease-relevant cellular context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 design, allele-specific primer engineering, and qPCR analysis for allelic discrimination.
- Dependent on access to F1 hybrid embryonic stem cells with sufficient SNP density (every ~125 bp) for reliable allele-specific targeting.
- Necessitates standardization across teams for primer design workflows using UCSC genome browser and Primer3Plus to ensure allele specificity.
- Involves adaptation considerations for non-hybrid models where SNP density may be insufficient for allele-specific resolution.
- Includes practical limitations such as the need to confirm absence of indels on the non-deleted allele before attributing expression changes to enhancer loss.
