Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Het algemene doel van deze procedure is om allelspecifieke CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie te gebruiken voor het bestuderen van de regulatie van gentranscriptie in embryonale stamcellen van muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er een hybride genoom wordt gebruikt om monoalleliche deleties te genereren en te analyseren. Hierdoor is het niet langer nodig om monoalleliche deleties te analyseren die mogelijk niet levensvatbaar zijn.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de functionele genomica. Zo kan worden vastgesteld welk gen door een specifieke enhancer wordt gereguleerd en in hoeverre dat gen voor zijn activiteit afhankelijk is van een specifieke enhancer. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de pluripotentie van stamcellen, kan zij ook worden toegepast op andere systemen.

Het kan ons bijvoorbeeld helpen begrijpen hoe stamcellen hun lot veranderen om neuronen, bloedcellen of spiercellen te worden. Na het ontwerpen, construeren en bevestigen van de sequentie van het te gebruiken gids-RNA, of gRNA, bereidt u de transfectie van de endotoxine-vrije plasmiden in ES-cellen voor. Pellet met behulp van een centrifuge 1 × 10⁶ F1 embryonale stamcellen, gegenereerd door Mus musculus 129 te kruisen met Mus castaneus, in een 1,5 ml buis bij 300 ×g gedurende vijf minuten.

Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en voeg 100 µL toe van de resuspensiebuffer die door de fabrikant van de kit wordt geleverd. Voor deletie van de doelregio van het DNA voegt u telkens vijf µg van de P Cas9 GFP 5-prime en 3-prime gRNA-plasmiden toe. Meng voorzichtig met een pipet.

Voorkom dat er luchtbellen ontstaan. Gebruik vervolgens de elektronische pipetpunt van de microporator om 100 µL van het electroporatiemengsel op te zuigen, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen lucht in de punt terechtkomt. Plaats daarna de pipet in het transfectieapparaat.

Selecteer het juiste protocol en druk op start. Observeer de tip terwijl de elektroporatie plaatsvindt. Bij een correcte opstelling zouden er kleine belletjes uit de buiselektrode moeten komen.

Een vonk duidt op de aanwezigheid van een luchtbel en zal de transfectie verstoren. Als dit gebeurt, moet de elektroporatie worden herhaald met een nieuwe batch cellen. Spuit na de elektroporatie de getransfecteerde cellen uit in een met gelatine gecoate schaal van tien centimeter die tien milliliter ES-celmedium bevat.

Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 °C, 5% CO2. Gebruik na 48 uur een flowcytometer om de GFP-positieve ES-cellen te sorteren en te isoleren. Zaai vervolgens 1 tot 1,5 × 10⁴ GFP-positieve cellen uit in een gelatine-gecoate schaal van 10 cm met 10 mL ES-celmedium.

Het uitplaten bij deze lage dichtheid vergemakkelijkt het opvissen van individuele ES-celkolonies. Gebruik vier tot vijf dagen later een microscoop om individuele, bolvormige, enkelvoudige ES-celkolonies te identificeren. Draag elke kolonie met een pipet over naar één putje van een 96-well plaat die is voorbehandeld met gelatine en 30 µL tripsom bevat.

Zodra alle kolonies zijn opgepikt en gedissocieerd in medium, worden de cellen gekweekt bij 37 °C in de CO2-incubator totdat de meeste wells een confluentie van meer dan 70% hebben bereikt. Dit duurt gewoonlijk ongeveer twee dagen. Wanneer de cellen klaar zijn om te splitsen, wordt het medium verwijderd en worden 30 µL tripsom toegevoegd.

Incubeer de cellen gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens aan elke put 180 µL ES-celmedium toe om het trypsin te neutraliseren. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.

Breng van elke put 70 µL over naar elk van drie met gelatine gecoate 96-putjesplaten die elk 130 µL ES-celmedium per put bevatten. Incubeer bij 37 °C. Wanneer de platen een confluentie van 70 tot 85% bereiken, worden deze gebruikt voor genotyping en expressieanalyse van elke kloon, zoals beschreven in de volgende secties.

Bevries de celvoorraden zoals beschreven in het bijbehorende document. Hier worden vier sets primers ontworpen om de klonen te screenen op de gewenste deletie. Deze omvatten: interne primers, externe primers en gRNA-flankerende primers voor zowel de 5-prime als de 3-prime gRNA-doelplaatsen.

Begin met het bezoeken van de hier getoonde website om het single nucleotide polymorphism (snip) track te verkrijgen dat correspondeert met de 129- en Cas-genotypen. Dit leidt naar de CRISPR-webpagina van het Mitchell Lab. Klik daar op de opgegeven link.

De site zal doorsturen naar de UCSC genome browser met het track dat de snips tussen de 129- en Cas-genomen in de MM-9 muisgenoom-assemblage weergeeft. Voer vervolgens de coördinaten in van de regio die verwijderd moet worden en klik op "go". Zoom in op een regio van ongeveer 500 baseparen in het midden van de gewenste deletie die meer dan drie snips bevat.

Het ontwerp van allelspecifieke primers kan ingewikkeld zijn als SNP's schaars zijn. Als het niet mogelijk is om absolute allelspecifieke primers te ontwerpen, kunnen gematigd allelspecifieke primers worden gebruikt. Vergeet niet om bij de analyse van de qPCR-resultaten de CT-waarden tussen de gedeleteerde en niet-gedeleteerde klonen te vergelijken.

Klik nu op "View" in het bovenste paneel. Selecteer "DNA" in het drop-downmenu. De pagina "Get DNA in Window" verschijnt.

Kies bij de opties voor sequentieopmaak voor volledig in hoofdletters en klik vervolgens op 'Get DNA' om de doelsequentie in hoofdletters weer te geven. Kopieer deze sequentie en plak deze in een Word-document. Vergelijk vervolgens de sequentie met het 129 cast snip-spoor, markeer de snip-posities en geef de 129 snips aan met kleine letters.

Wanneer u klaar bent met de 129-sequentie, kopieert u deze om twee sequenties in fasta-formaat te maken. Eén voor 129 en één voor Cas. Vervang in de Cas-sequentie op elke snip-positie de juiste base en markeer de snip met een kleine letter.

Label vervolgens de sequentie met het bijbehorende genoom, 129 of Cas. Typ daarna in de browser het adres voor Primer3Plus in. Plak in het juiste veld de 129-sequentie waarin de snip is gesubstitueerd.

Gebruik de standaardinstellingen om de primers te ontwerpen. Om de interne allel-specifieke primers te ontwerpen, klikt u op het vervolgkeuzemenu rechts van Task en selecteert u Primer List, waarna u op Pick Primers klikt. Er wordt een nieuwe pagina geopend met een lijst van forward- en reverse-primers.

Vink het selectievakje aan om een forward- of reverse-primer te kiezen die een snip heeft, aangegeven door een kleine letter aan het 3'-uiteinde of binnen vier basen van het 3'-uiteinde. Let op dat primers met een snip aan het 3'-uiteinde een verhoogde allelspecificiteit vertonen tijdens qPCR. Klik onderaan het scherm op "Send to Primer3 Manager".

Er wordt een nieuwe pagina geopend waarop de geselecteerde primer wordt weergegeven. Om de tweede primer te selecteren, keert u terug naar de pagina met de primerlijst en klikt u op de terugknop om terug te keren naar de hoofdpagina. Selecteer in het vervolgkeuzemenu voor taken Detectie.

De hoofdpagina wordt vernieuwd en onderaan verschijnen tekstvakken voor de linker- en rechterprimersequentie. Plak de eerste primersequentie in het juiste vak. Ga vervolgens naar het tabblad General Settings naast het tabblad Main en wijzig de instelling voor het bereik van de productgrootte naar 80 tot 200 base pairs.

Klik op "Pick Primers". Er opent een pagina met vijf mogelijke primerparen voor de eerste primersequentie. Kies een primer-set uit de lijst met primerparen door de vakjes links van de primers aan te vinken en klik onderaan het scherm op "Send to Primer3 Manager". Dit zullen de 129 allelspecifieke interne primers zijn.

Herhaal deze stappen om primers voor het cast-allel te ontwerpen. Pas deze techniek vervolgens toe op het ontwerp van externe allelspecifieke primers en niet-allelspecifieke primers. Test ten slotte de primers op allelspecificiteit met behulp van qPCR, zoals beschreven in het bijbehorende document.

Extraheer het genomisch DNA uit de eerder geprepareerde 96-wells plaat. Centrifugeer de plaat kort om eventuele condensatie naar de bodem van de well te laten zakken. Dit DNA dient als template voor de deletiescreening.

Voer vervolgens op een 384-wellplaat qPCR uit in duplo voor elke kloon. Gebruik een twee-staps PCR gevolgd door smeltcurve-analyse met detectie. Controleer na de run eerst elk allel op amplificatie met de interne allel-specifieke primers.

Het uitblijven van amplificatie van één allel of CT-waardeverschillen van meer dan vijf cycli tussen allelen wijst erop dat deze klonen een heterozygote deletie dragen. Het uitblijven van amplificatie van beide allelen wijst erop dat zij een homozygote deletie dragen. Controleer vervolgens elk allel op amplificatie met de externe allelspecifieke primers.

Als de doeldeletie groter is dan 1 KB, vindt amplificatie met externe primers alleen plaats als er een deletie aanwezig is. Een CT-waarde van 22 tot 28 bevestigt de deletie. Voor doeldeleties kleiner dan 1 KB dient de grootte van het amplicon via elektroforese te worden bevestigd.

Een 96-well plaat met deletieklonen werd gescreend via qPCR met behulp van allelspecifieke interne primers. De grijze balken representeren amplificatie door Cas-specifieke primers en de zwarte balken representeren amplificatie door 129-specifieke primers. Een lage CT-waarde of geen amplificatie met interne primers duidt op deletie van het target.

Klonen met een deletie op één of beide allelen worden vervolgens gescreend met de buitenste primers. Met deze buitenste primers bevestigt amplificatie de deletie. Klonen met een monoallelic deletie worden gescreend met behulp van primers die flankeren aan de gRNA-doelregio's om de afwezigheid van inserties of deleties, zogenaamde indels, op het niet-gedeleteerde allel te bevestigen.

Alleen monoallelische klonen zonder grote indels op de targetlocaties van het niet-gedeleteerde allel worden gebruikt in de daaropvolgende expressieanalyse. Hier worden representatieve resultaten getoond van 129- of Cas SCR-gedeleteerde klonen. De SCR is een onlangs beschreven Sox2-specifieke enhancer in ES-cellen.

Rode balken representeren de expressie van het Sox2 Cas-allel, en blauwe balken representeren de amplificatie van het Sox2 129-allel. Zoals in deze figuur te zien is, verminderde deletie van de SCR op het 129- of Cas-allel de expressie van Sox2 in CIS. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een grote deletie genereert met CRISPR-technologie en hoe u allelspecifieke primers gebruikt om uw gedeleteerde klonen te genotyperen.