Name: Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer CRISPR/Cas9-gemedieerde deletietechnieken om genregulatie te bestuderen in muizenembryonale stamcellen. Deze methode maakt monoallelische verwijderingen mogelijk voor functioneel genomics-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen alle leden van het Mitchell-lab bedanken voor hun nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research, de Canada Foundation for Innovation en het Ontario Ministry of Research and Innovation (operationele en infrastructurele subsidies in handen van JAM).

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
<li>Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid-specific%2C+developmental-stage-independent+enhancer+far+upstream+of+the+human+%27beta-like+globin%27+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).</li>
<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
<li>Mlynarczyk-Evans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosomes+alternate+between+two+states+prior+to+random+X-inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation.</a> PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+base+mispairs+by+Taq+DNA+polymerase%3A+implications+for+single+nucleotide+discrimination+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).</li>
<li>Keane, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+variation+and+its+effect+on+phenotypes+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation.</a> Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).</li>
<li>Yalcin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-based+characterization+of+structural+variation+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome.</a> Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben het beleid Jupiter&#39;s op belangenverstrengeling te lezen en hebben geen conflicten te onthullen.

CRISPR / Cas9 gemedieerde genoom editing-technologie biedt een eenvoudige, snelle en goedkope methode voor het genoom modificatie. De methode die hier beschreven voor het genereren en te analyseren monoallelische enhancer schrapping voor functionele enhancer karakterisering maakt gebruik van SNPs in de F1 muizencellen. De voordelen van deze benadering zijn: 1) monoallelische enhancer deleties niet verstorende effecten die plaatsvinden wanneer een kritische enhancer geschrapt beide allelen, dwz een grote verlagi...

Transcriptionele regulatoire elementen cruciaal zijn voor spatio-temporeel fijnafstelling van genexpressie tijdens de ontwikkeling 1 en wijziging van deze elementen kan leiden tot ziekten door afwijkende genexpressie 2. Veel ziekte-geassocieerde gebieden geïdentificeerd door genoomwijde associatiestudies in niet-coderende gebieden en hebben kenmerken van transcriptie enhancers 3-4. Identificeren enhancers en matchen met de genen die ze reguleren wordt bemoeilijkt doordat zich meestal verscheidene kilobasen verwijderd van de genen die ze reguleren en kan worden geactiveerd in een weefsel-specifieke wijze 5-6. Enhancer voorspellingen zijn vaak gebaseerd op histonmodificatie merken, mediator-cohesin complexen en binding van celtype-specifieke transcriptiefactoren 7-10. Validatie van voorspelde enhancers wordt meestal gedaan door een vector gebaseerde test waarbij de enhancer expressie van een reportergen activeert 11-12. Deze gegevens valuable informatie over de wettelijke mogelijkheden van vermeende enhancersequenties, maar niet hun functie onthullen in hun endogene genomische context of identificeren van de genen die ze reguleren. Genoom bewerking dient als een krachtig middel om de functie van transcriptionele regulatoire elementen in hun endogene context met verlies-van-functie analyse bestuderen. Recente ontwikkelingen in het genoom van het bewerken, namelijk de CRISPR / Cas9 genoom editing systeem, vergemakkelijken het onderzoek van genoom-functie. De CRISPR / Cas9 is eenvoudig te gebruiken en bruikbaar voor biologische systemen. De Cas9 eiwit is gericht op een specifieke plaats in het genoom van een gids-RNA (gRNA) 13. De SpCas9 / gRNA complex scant het genoom van de beoogde genomische sequentie die moet 5 &#39;een protospacer aangrenzende motief (PAM) sequentie, NGG 14-15. Baseparing van de gRNA om zijn doel, een 20 nucleotide (nt) sequentie die complementair is aan de gRNA, activeert SpCas9 nuclease-activiteit resulteert in een double breuken (DSB) 3 bp stroomopwaarts van de PAM reeks. Specificiteit wordt bereikt door volledige basenparing in het gRNA zaad regio, de 6-12 nt naast de PAM; omgekeerd, niet overeenkomt met 5 &#39;van het zaad worden gewoonlijk getolereerd 16-17. De geïntroduceerde DSB kan worden gerepareerd door de niet-homologe end-joining (NHEJ) DNA repair of homologie gerichte reparatie (HDR) mechanisms.NHEJ DNA herstel veroorzaakt dikwijls insertie / deletie (indels) van enkele bp op de doelplaats die kunnen verstoren het open leeskader (ORF) van een gen. Om grotere deleties in het genoom twee gRNAs, die het gebied van belang flankeren genereren, kan worden gebruikt 18-19. Deze benadering is bijzonder nuttig voor het bestuderen van transcriptionele enhancers geclusterd in locus controle gebieden of super-enhancers die groter zijn dan conventionele versterkers 9,18,20-22 zijn. Monoallelische schrappingen zijn een waardevol model voor het bestuderen van cis -regeling van transcriptie. De waargenomen Change in transcriptieniveau monoallelische na verwijdering van een versterker correleert met de rol van deze versterker in genregulatie zonder verstorende effecten die kunnen optreden wanneer de transcriptie van beide allelen mogelijk beïnvloed beïnvloeden cellulaire fitness. Evaluatie verminderde expressie is echter moeilijk zonder de mogelijkheid om onderscheiden verwijderd uit het wildtype allel. Bovendien genotypering deleties op elk allel zonder de mogelijkheid om de twee allelen te onderscheiden is moeilijk, vooral bij grote deleties van&gt; 10 kb tot 1 Mb 23, waarbij het ​​moeilijk is om de hele wild type gebied te amplificeren door PCR. Het gebruik van F1-ES-cellen gegenereerd door kruising Mus musculus 129 met Mus castaneus kunnen de twee allelen te onderscheiden door allel-specifieke PCR 18,24. De hybride genoom in deze cellen vergemakkelijkt allelspecifieke deletie screening en expressie analyse. Gemiddeld is er een SNP elke 125 bp tussen de twee genomen, Het verstrekken van flexibiliteit in primer ontwerp voor expressie en genotypering analyses. De aanwezigheid van één SNP kan de primer smelttemperatuur (Tm) beïnvloeden en doelwitspecificiteit in real-time kwantitatieve PCR (qPCR) amplificatie waardoor discriminatie van de twee allelen 25. Verder een mismatch in het 3 &#39;uiteinde van de primer grote invloed op het vermogen van DNA-polymerase om zich vanaf de primer voorkomen amplificatie van de ongewenste allel doel 26. Beschreven in het volgende protocol is het gebruik van F1 ES cellen voor allelspecifieke enhancer deleties van meer dan 1 kb en daaropvolgende expressie analyse met behulp van CRISPR / Cas9 genoom bewerkingssysteem (figuur 1). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> Figuur 1. Enhancer schrapping gebruik CRISPR / Cas9 studeren cis -REGning van genexpressie. (A) F1 ES-cellen gegenereerd door een kruising tussen Mus musculus 129 en Mus castaneus worden gebruikt om te zorgen voor allelspecifieke verwijdering. (B) Two guide RNA (gRNA) worden gebruikt om een grote Cas9 gemedieerde deletie van de enhancerregio induceren. (C) primersets worden gebruikt om grote mono- en bi-allelische deleties identificeren. De oranje primers de primers in de paarse primers de buitenste primers en de groene primers gRNA de flankerende primers. (D) Veranderingen in genexpressie worden bewaakt in de allelspecifieke qPCR. RFU geeft relatieve fluorescentie-eenheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System 100 &micro;L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Microporator transfection technology</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>genomic DNA extraction reagent</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel &amp; PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>High-Speed Plasmid Mini Kit</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free&nbsp;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select mix for CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>qPCR reagent</td></tr><tr><td>iScript cDNA synthesis kit</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>Reverse transcription reagent</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin with EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS without Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA fraction V (7.5%)</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Max Efficiency DH5&alpha; competent cells</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES cell qualified</td><td></td><td>FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential aminoacid</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Sealing tape</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>alcohol-free cell freezing container</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>Inhibitor for F1 ES cell culture</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>Inhibitor for F1 ES cell culture</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Inhibitor for F1 ES cell culture</td></tr></tbody></table>

het genereren van crispr / cas9 mediated monoallelische verwijderingen in enhancer-functie van muis embryonale stamcellen studie

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers controleren de celidentiteit door weefselspecifieke genexpressie te reguleren op een positie- en oriëntatie-onafhankelijke manier. Deze enhancers zijn vaak distaal van het gereguleerd gen gelegen in intergene regio's of zelfs binnen het lichaam van een ander gen. De positie-onafhankelijke aard van enhanceractiviteit maakt het moeilijk om enhancers te matchen met de genen die ze reguleren. Deletie van een enhancerregio levert direct bewijs voor enhanceractiviteit en is de gouden standaard om de rol van een enhancer in endogene gentranscriptie te onthullen. Conventionele op homologe recombinatie gebaseerde deletiemethoden zijn overschaduwd door recente vorderingen in genoombewerkingstechnologie die snelle en precies gelokaliseerde veranderingen in de genomen van talrijke modelorganismen mogelijk maken. CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking kan worden gebruikt om het genoom in veel celtypen en organismen snel en kosteneffectief te manipuleren, vanwege de gemak waarmee Cas9 kan worden gericht op het genoom door een geleide RNA van een op maat gemaakte expressieplasmide. Homozygote deletie van essentiële gen-regulerende elementen kan leiden tot letaliteit of een verandering van het cellulaire fenotype, terwijl mono-alleel deletie van transcriptionele enhancers de studie van cis-regulatie van genexpressie mogelijk maakt zonder dit verstorende probleem. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie in F1 muis embryonale stamcellen (ES) (Mus musculus129 x Mus castaneus). Mono-alleel deletie, screening en expressieanalyse wordt vergemakkelijkt door enkele nucleotidepolymorfismen (SNP) tussen de twee allelen die gemiddeld elke 125 bp in deze cellen voorkomen.

De hier beschreven protocol gebruikt F1 ES-cellen cis -regeling van genexpressie bestuderen monoallelische enhancer verwijderde cellen gegenereerd met CRISPR / Cas9 genoom bewerking (figuur 1). De gRNA en allelspecifieke primer ontwerp voor genotypering en genexpressie zijn de belangrijkste factoren in deze aanpak. Elk allel-specifieke primer set moet worden gevalideerd door qPCR om allel specificiteit te bevestigen. Allelspecifieke primers die alleen hun genomi...

Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Het algemene doel van deze procedure is om allelspecifieke CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie te gebruiken voor het bestuderen van de regulatie van gentranscriptie in embryonale stamcellen van muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er een hybride genoom wordt gebruikt om monoalleliche deleties te genereren en te analyseren. Hierdoor is het niet langer nodig om monoalleliche deleties te analyseren die mogelijk niet levensvatbaar zijn.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de functionele genomica. Zo kan worden vastgesteld welk gen door een specifieke enhancer wordt gereguleerd en in hoeverre dat gen voor zijn activiteit afhankelijk is van een specifieke enhancer. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de pluripotentie van stamcellen, kan zij ook worden toegepast op andere systemen.Het kan ons bijvoorbeeld helpen begrijpen hoe stamcellen hun lot veranderen om neuronen, bloedcellen of spiercellen te worden. Na het ontwerpen, construeren en bevestigen van de sequentie van het te gebruiken gids-RNA, of gRNA, bereidt u de transfectie van de endotoxine-vrije plasmiden in ES-cellen voor. Pellet met behulp van een centrifuge 1 × 10⁶ F1 embryonale stamcellen, gegenereerd door Mus musculus 129 te kruisen met Mus castaneus, in een 1,5 ml buis bij 300 ×g gedurende vijf minuten.Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en voeg 100 µL toe van de resuspensiebuffer die door de fabrikant van de kit wordt geleverd. Voor deletie van de doelregio van het DNA voegt u telkens vijf µg van de P Cas9 GFP 5-prime en 3-prime gRNA-plasmiden toe. Meng voorzichtig met een pipet.Voorkom dat er luchtbellen ontstaan. Gebruik vervolgens de elektronische pipetpunt van de microporator om 100 µL van het electroporatiemengsel op te zuigen, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen lucht in de punt terechtkomt. Plaats daarna de pipet in het transfectieapparaat.Selecteer het juiste protocol en druk op start. Observeer de tip terwijl de elektroporatie plaatsvindt. Bij een correcte opstelling zouden er kleine belletjes uit de buiselektrode moeten komen.Een vonk duidt op de aanwezigheid van een luchtbel en zal de transfectie verstoren. Als dit gebeurt, moet de elektroporatie worden herhaald met een nieuwe batch cellen. Spuit na de elektroporatie de getransfecteerde cellen uit in een met gelatine gecoate schaal van tien centimeter die tien milliliter ES-celmedium bevat.Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 °C, 5% CO2. Gebruik na 48 uur een flowcytometer om de GFP-positieve ES-cellen te sorteren en te isoleren. Zaai vervolgens 1 tot 1,5 × 10⁴ GFP-positieve cellen uit in een gelatine-gecoate schaal van 10 cm met 10 mL ES-celmedium.Het uitplaten bij deze lage dichtheid vergemakkelijkt het opvissen van individuele ES-celkolonies. Gebruik vier tot vijf dagen later een microscoop om individuele, bolvormige, enkelvoudige ES-celkolonies te identificeren. Draag elke kolonie met een pipet over naar één putje van een 96-well plaat die is voorbehandeld met gelatine en 30 µL tripsom bevat.Zodra alle kolonies zijn opgepikt en gedissocieerd in medium, worden de cellen gekweekt bij 37 °C in de CO2-incubator totdat de meeste wells een confluentie van meer dan 70% hebben bereikt. Dit duurt gewoonlijk ongeveer twee dagen. Wanneer de cellen klaar zijn om te splitsen, wordt het medium verwijderd en worden 30 µL tripsom toegevoegd.Incubeer de cellen gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens aan elke put 180 µL ES-celmedium toe om het trypsin te neutraliseren. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.Breng van elke put 70 µL over naar elk van drie met gelatine gecoate 96-putjesplaten die elk 130 µL ES-celmedium per put bevatten. Incubeer bij 37 °C. Wanneer de platen een confluentie van 70 tot 85% bereiken, worden deze gebruikt voor genotyping en expressieanalyse van elke kloon, zoals beschreven in de volgende secties.Bevries de celvoorraden zoals beschreven in het bijbehorende document. Hier worden vier sets primers ontworpen om de klonen te screenen op de gewenste deletie. Deze omvatten: interne primers, externe primers en gRNA-flankerende primers voor zowel de 5-prime als de 3-prime gRNA-doelplaatsen.Begin met het bezoeken van de hier getoonde website om het single nucleotide polymorphism (snip) track te verkrijgen dat correspondeert met de 129- en Cas-genotypen. Dit leidt naar de CRISPR-webpagina van het Mitchell Lab. Klik daar op de opgegeven link.De site zal doorsturen naar de UCSC genome browser met het track dat de snips tussen de 129- en Cas-genomen in de MM-9 muisgenoom-assemblage weergeeft. Voer vervolgens de coördinaten in van de regio die verwijderd moet worden en klik op "go". Zoom in op een regio van ongeveer 500 baseparen in het midden van de gewenste deletie die meer dan drie snips bevat.Het ontwerp van allelspecifieke primers kan ingewikkeld zijn als SNP's schaars zijn. Als het niet mogelijk is om absolute allelspecifieke primers te ontwerpen, kunnen gematigd allelspecifieke primers worden gebruikt. Vergeet niet om bij de analyse van de qPCR-resultaten de CT-waarden tussen de gedeleteerde en niet-gedeleteerde klonen te vergelijken.Klik nu op "View" in het bovenste paneel. Selecteer "DNA" in het drop-downmenu. De pagina "Get DNA in Window" verschijnt.Kies bij de opties voor sequentieopmaak voor volledig in hoofdletters en klik vervolgens op 'Get DNA' om de doelsequentie in hoofdletters weer te geven. Kopieer deze sequentie en plak deze in een Word-document. Vergelijk vervolgens de sequentie met het 129 cast snip-spoor, markeer de snip-posities en geef de 129 snips aan met kleine letters.Wanneer u klaar bent met de 129-sequentie, kopieert u deze om twee sequenties in fasta-formaat te maken. Eén voor 129 en één voor Cas. Vervang in de Cas-sequentie op elke snip-positie de juiste base en markeer de snip met een kleine letter.Label vervolgens de sequentie met het bijbehorende genoom, 129 of Cas. Typ daarna in de browser het adres voor Primer3Plus in. Plak in het juiste veld de 129-sequentie waarin de snip is gesubstitueerd.Gebruik de standaardinstellingen om de primers te ontwerpen. Om de interne allel-specifieke primers te ontwerpen, klikt u op het vervolgkeuzemenu rechts van Task en selecteert u Primer List, waarna u op Pick Primers klikt. Er wordt een nieuwe pagina geopend met een lijst van forward- en reverse-primers.Vink het selectievakje aan om een forward- of reverse-primer te kiezen die een snip heeft, aangegeven door een kleine letter aan het 3'-uiteinde of binnen vier basen van het 3'-uiteinde. Let op dat primers met een snip aan het 3'-uiteinde een verhoogde allelspecificiteit vertonen tijdens qPCR. Klik onderaan het scherm op "Send to Primer3 Manager".Er wordt een nieuwe pagina geopend waarop de geselecteerde primer wordt weergegeven. Om de tweede primer te selecteren, keert u terug naar de pagina met de primerlijst en klikt u op de terugknop om terug te keren naar de hoofdpagina. Selecteer in het vervolgkeuzemenu voor taken Detectie.De hoofdpagina wordt vernieuwd en onderaan verschijnen tekstvakken voor de linker- en rechterprimersequentie. Plak de eerste primersequentie in het juiste vak. Ga vervolgens naar het tabblad General Settings naast het tabblad Main en wijzig de instelling voor het bereik van de productgrootte naar 80 tot 200 base pairs.Klik op "Pick Primers". Er opent een pagina met vijf mogelijke primerparen voor de eerste primersequentie. Kies een primer-set uit de lijst met primerparen door de vakjes links van de primers aan te vinken en klik onderaan het scherm op "Send to Primer3 Manager". Dit zullen de 129 allelspecifieke interne primers zijn.Herhaal deze stappen om primers voor het cast-allel te ontwerpen. Pas deze techniek vervolgens toe op het ontwerp van externe allelspecifieke primers en niet-allelspecifieke primers. Test ten slotte de primers op allelspecificiteit met behulp van qPCR, zoals beschreven in het bijbehorende document.Extraheer het genomisch DNA uit de eerder geprepareerde 96-wells plaat. Centrifugeer de plaat kort om eventuele condensatie naar de bodem van de well te laten zakken. Dit DNA dient als template voor de deletiescreening.Voer vervolgens op een 384-wellplaat qPCR uit in duplo voor elke kloon. Gebruik een twee-staps PCR gevolgd door smeltcurve-analyse met detectie. Controleer na de run eerst elk allel op amplificatie met de interne allel-specifieke primers.Het uitblijven van amplificatie van één allel of CT-waardeverschillen van meer dan vijf cycli tussen allelen wijst erop dat deze klonen een heterozygote deletie dragen. Het uitblijven van amplificatie van beide allelen wijst erop dat zij een homozygote deletie dragen. Controleer vervolgens elk allel op amplificatie met de externe allelspecifieke primers.Als de doeldeletie groter is dan 1 KB, vindt amplificatie met externe primers alleen plaats als er een deletie aanwezig is. Een CT-waarde van 22 tot 28 bevestigt de deletie. Voor doeldeleties kleiner dan 1 KB dient de grootte van het amplicon via elektroforese te worden bevestigd.Een 96-well plaat met deletieklonen werd gescreend via qPCR met behulp van allelspecifieke interne primers. De grijze balken representeren amplificatie door Cas-specifieke primers en de zwarte balken representeren amplificatie door 129-specifieke primers. Een lage CT-waarde of geen amplificatie met interne primers duidt op deletie van het target.Klonen met een deletie op één of beide allelen worden vervolgens gescreend met de buitenste primers. Met deze buitenste primers bevestigt amplificatie de deletie. Klonen met een monoallelic deletie worden gescreend met behulp van primers die flankeren aan de gRNA-doelregio's om de afwezigheid van inserties of deleties, zogenaamde indels, op het niet-gedeleteerde allel te bevestigen.Alleen monoallelische klonen zonder grote indels op de targetlocaties van het niet-gedeleteerde allel worden gebruikt in de daaropvolgende expressieanalyse. Hier worden representatieve resultaten getoond van 129- of Cas SCR-gedeleteerde klonen. De SCR is een onlangs beschreven Sox2-specifieke enhancer in ES-cellen.Rode balken representeren de expressie van het Sox2 Cas-allel, en blauwe balken representeren de amplificatie van het Sox2 129-allel. Zoals in deze figuur te zien is, verminderde deletie van de SCR op het 129- of Cas-allel de expressie van Sox2 in CIS. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een grote deletie genereert met CRISPR-technologie en hoe u allelspecifieke primers gebruikt om uw gedeleteerde klonen te genotyperen.

generating-crisprcas9-mediated-monoallelic-deletions-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

CRISPR/Cas9 is een robuust systeem om genen en genetische elementen te onderbreken. Hier beschrijven we een protocol voor het efficiënt creëren van genomische deleties in zoogdiercellijnen met behulp van CRISPR/Cas9.

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren multiplexed targeting van versterkers met de deactivering fusieproteïne SID4X-dCas9-KRAB, ook bekend als enhancer interferentie (Enhancer-i). Dit protocol stelt de identificatie van versterkers die regelen van genexpressie en vergemakkelijkt de dissectie van de relaties tussen de versterkers van regulering van een gemeenschappelijk doel-gen.

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Deze methode is ontworpen om de vorming van PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen in cellijnen te volgen, en de methode kan worden aangepast aan vele andere systemen.

Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Dit artikel rapporteert de constructie van centromeer-geassocieerde proteïne-E (CENP-E) knock-outcellen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem en drie op fenotype gebaseerde screeningstrategieën. We hebben de CENP-E knock-out cellijn gebruikt om een nieuwe benadering vast te stellen om de specificiteit en toxiciteit van de CENP-E-remmers te valideren, wat nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en biologisch onderzoek.

Generatie van Centromeer-geassocieerde proteïne-E CENP-E-/- knock-outcellijnen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem

De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

Leer CRISPR/Cas9-gemedieerde deletietechnieken om genregulatie te bestuderen in muizenembryonale stamcellen. Deze methode maakt monoallelische verwijderingen mogelijk voor functioneel genomics-onderzoek.

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie (Video) | JoVE Journal

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Meer video's verkennen