Name: High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer hoe je recombinante humane glycoproteïnen produceert met HEK293-cellen in suspensie via transient transfectie. Deze methode optimaliseert eiwitvouwing en glycosylering voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door de subsidies K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) en P01GM107012 (KWM) van de National Institutes of Health, en door fondsen van de Roy J. Carver Afdeling Biochemie, Biofysica &amp; Moleculaire Biologie aan de Iowa State University . De inhoud van dit werk is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.

Dit protocol is voldoende voor expressie met behulp van HEK293F of HEK293S cellen. 1. Cell Oprichting <ol><li> Cultuur Inenting Opmerking: Alle cultuur manipulatie procedures moeten worden uitgevoerd in een BSL-2-faciliteit en elk item bracht in de bioveiligheid kast moeten worden gesteriliseerd door te besproeien met een ethanol 70% in water oplossing. <ol><li> Bedien de incubator schudder bij 135 rpm, 80% vochtigheid en 8,0% CO2 en 37 ° C. &quot;Aan&quot; de UV lamp van de bioveiligheid kast tenminste 1 uur voor werken. Voorverwarmen de afgedichte Medium Medium A en B flessen in het waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Steriliseren 125 ml Erlenmeyer groei kolven met een geventileerde dop, pipetten, pipetten en voorverwarmde media flessen door te besproeien met de 70% ethanol in wateroplossing. Plaats deze items in de bioveiligheid kast. Let op: Steriliseer alleen de buitenste plastic voor de 125 ml Erlenmeyer kolf, en slechts te verwijderen toen het is in de bioveiligheid kast. </li><li> Voor een cultuur 30 ml, in te trekken 26 ml Medium A en 3 ml medium B (10% van de uiteindelijke cultuur) en breng in de 125 ml Erlenmeyer kolf en meng door schudden (hierna aangeduid als vers kweekmedium). </li><li> Overdracht één flacon cellen met HEK293F cellen, bij -80 ° C bevroren, op ijs en te verplaatsen naar de cultuur kamer. Opmerking: HEK293F cellen worden toegevoerd bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml. </li><li> Verwarm de flacon voorzichtig in waterbad bij 37 ° C gedeeltelijk ontdooien van de cellen (ca. een minuut en cellen niet volledig ontdooid). Steriliseer de buitenkant van het flesje met 70% ethanol in wateroplossing en zet deze in de bioveiligheid kast. </li><li> Met behulp van 1 ml pipet, trekt de cel suspensie (ongeveer 0,7 ml) en breng in de 125 ml erlenmeyer met 29 ml vers kweekmedium. Sluit het deksel van de cultuur kolf en verplaatsen in de bebroede shaker. </li></ol&gt; </li><li> Cell Onderhoud: Check cel dichtheid, levensvatbaarheid en cel Passages <ol><li> Controleer de cellen dichtheid na 24 uren van ontdooien van de cultuur door de onderstaande protocol. Opmerking: Cellen worden gekweekt gedurende 24 uur na ontdooien groei essentiële cellen en levensvatbaarheid van&gt; 80% te verzekeren. </li><li> Steriliseren de kolf met 70% ethanol in water oplossing en zet het in de bioveiligheid kast. </li><li> Met behulp van een pipet en pipet 1 ml, langzaam terug te trekken 100 ul schorsing cultuur en de overdracht in een steriele 0,5 ml Eppendorf buis. Sluit en breng de kolf terug in de shaker zo spoedig mogelijk. </li><li> Meng 7,5 pi van een trypan blauwe oplossing met 7,5 pi cellen. Meng krachtig met 7,5 ul van de cellen / trypan blauw mengsel en overbrengen naar het tellen dia. </li><li> Schakel de automatische celgetalmeter en plaats het tellen dia in de laadruimte. De automatische lezer wordt geactiveerd en cellen automatisch geteld in eenhedenvan het aantal cellen per ml en percentage levensvatbaarheid </li><li> Bepaal het volume van de donor cultuur vereist voor de overdracht naar een vers kweekmedium aan de cellen dichtheid van 0,3 x 10 6 levende cellen / ml. Opmerking: Zie een rekenvoorbeeld in aanvullende materialen. </li><li> Herhaal stap 1.1.2 en 1.1.3 van de &quot;1.1 Cultuur Enten&quot; protocol hierboven om materialen die nodig zijn voor vers kweekmedium te bereiden. </li><li> Overdrachtsmedium A (23 ml) en Medium B (3 ml) om een ​​frisse 125 ml kolf. Verwijder de voorraad flessen Medium Medium A en B van de bioveiligheid kast. Opmerking: voorraden media flessen niet in de bioveiligheid kast bewaard tegelijkertijd de HEK 293F cellen. Dit beperkt de mogelijkheid van besmetting van de voorraad medium flessen. </li><li> Verwijder de HEK293 celkweek uit de incubator en spuit met 70% ethanol in wateroplossing. Met behulp van een nieuwe pipet, trek de hoeveelheid van de cellen (4 ml, werd dit volume bepaald op basis to stap 1.2.6) van de cultuur en overbrengen naar de kolf met vers kweekmedium. </li><li> Transfer zowel de culturen van de bioveiligheid kast om de incubator shaker ingesteld op basis van 1.1.1. Kweek cellen om een benaderende densiteit van 2-3 x 10 6 levende cellen / ml. Opmerking: De geschatte verdubbeling tijd van de cellen is 32 uur. Het zal 3-4 dagen duren om deze dichtheid te bereiken. Incubeer de cellen gedurende 3-4 passages stabiele groei patroon van cellen voorafgaand aan de eerste transfectie hebben. </li></ol></li></ol> 2. Bereid Materialen voor transfectie <ol><li> Voorbereiden van HEK293 cellen (dag 1) <ol><li> Subcultuur cellen tot een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in vers medium B 24 uur voor transfectie volgens stap 1,2. Opmerking: het volume van de transfectie cultuur afhankelijk van het aantal cellen. Transfectie grotere volumes (&gt; 20 ml) een groter volume van cultuur in dit stadium vereist. </li></ol></li><li> Voorbereiden van Stocks van Materialen <ol><li> Bereid voorraadoplossing van lineaire Polyethyleenimine (PEI) bij een concentratie van 1 mg / ml in een buffer die 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en 150 mM NaCl (pH 7,5). PEI volledig op te lossen; kan 30-60 minuten duren bij kamertemperatuur. Steriliseren door 0,22 pM spuitfilter en bewaar bij -20 ° C gedurende langdurig gebruik. </li><li> Bereid steriele plasmide DNA (volgens stap 2.2.2.1-2.2.2.4). De plasmideconstructie procedure wordt elders 42 beschreven. Een korte procedure voor DNA-bereiding wordt hier uitgelegd: <ol><li> Kweek een cultuur van chemisch competente Escherichia coli getransformeerd met de vector pGEn2 in 1 liter LB medium (Tryptone- 10 g / L, gist afzuig- 5 g / l natrium- chloride- en 10 g / l) aangevuld met 100 ug / ml ampicilline. E. coli wordt gekweekt bij 37 ° C in een niet-bevochtigde incubator schudden. </li><li> Zuiver het pGEn2 codeert doelwit plasmide DNA volgens de Manubrikant DNA zuivering protocol. </li><li> Om volledige steriliteit van het plasmide DNA te verzekeren, voert de laatste isopropanol neerslag en resuspensie stappen van de DNA-extractie in de bioveiligheid kast. </li><li> Voeg het volume isopropanol (gespecificeerd in het plasmide preparaat kit) aan de geëlueerde DNA en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 min. Steriliseer de buitenkant van het DNA houder met 70% ethanol in wateroplossing en breng deze in de bioveiligheid kast. Gooi de isopropanol supernatant met een pipet en air-droog de DNA pellet. Eenmaal droog, resuspendeer de pellet in steriele 10 mM Tris buffer, pH 8,0. </li></ol></li><li> Bereid voorraad oplossing van 220 mm valproic (VPA) zuur in water en steriliseer door passage door een steriel 0,22 pm filter. Bewaar de oplossing bij -20 ° C tot verder gebruik. </li></ol></li></ol> 3. Vaststelling van een tijdelijke transfectie <ol><li> Transfectie (Dag 0) <ol><li> Controleer de celdichtheid door de stappen 1.2.2 tot 1.2.5 van de &quot;1.2. Cell Onderhoud&quot; hierboven. Bepaal het aantal cellen voor de transfectie (2,5-3,0 x 10 6 levende cellen / ml de levensvatbaarheid&gt; 95%). Zie een rekenvoorbeeld in aanvullende materialen. </li><li> Breng het volume suspensiekweek cellen berekend in de vorige stap (hier 67 ml) in een 250 ml centrifugebuis met een steriele serologische pipet. Verzamel cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 100 x g. </li><li> In de tussentijd bereiden een frisse transfectie kweekmedium volgende stap 1.1.3 volgens &quot;1.1. Cultuur Inenting&quot; hierboven. Zie de aanvullende materialen voor een rekenvoorbeeld. Ook de overdracht 5 ml vers kweekmedium in een steriele 15 ml buis en zet apart. </li><li> Transfer buisjes die de celpellets in de bioveiligheid kast na het steriliseren de buitenkant van de buizen met 70% ethanol in wateroplossing en een steriele pipet th decanterene bovenstaande bestaande uit kweekmedium besteed. </li><li> Krachtig resuspendeer de gepelleteerde cellen door en neer te pipetteren met behulp van 10 ml vers kweekmedium en overdracht naar de kolf transfectie vers kweekmedium (bereid in stap 3.1.3 hierboven). Schroef de dop op de geventileerde celkweek kolf en zet de kolf met de incubator (zoals vastgesteld in 1.1.1) gedurende 15 min-1 uur met schudden. </li><li> Gedurende deze tijd, verdun het plasmide-DNA en PEI voorraden met verse kweekmedium (met het volume 5 ml uit stap 3.1.3 hierboven ingetrokken) tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ul. Zie rekenvoorbeelden in aanvullende materialen om de hoeveelheid DNA te bepalen en PEI. Breng de kolf met de verspreide cellen in de bioveiligheid kast. </li><li> Voeg plasmide DNA (300 ui 0,5 ug / ul) aan de kweek met behulp van micro-pipet en meng door voorzichtig handmatig schudden. Voeg PEI (900 ul van 0,5 ug / ul) om de cultuur, meng door zachtjes te schudden. Voeg 3,8 ml vers culture medium, uit stap 3.1.3, hierboven en overdracht kolf naar de incubator shaker gedurende 24 uur. </li><li> Reinig de bioveiligheid kast volgens de Stap 1.1. </li></ol></li><li> Verdunning (Dag 1) (Voor een 50 ml transfectie volume) <ol><li> Incubeer de getransfecteerde cultuur gedurende 24 uur. </li><li> Zuig 1 ml voorverwarmd 220 mM valproïnezuur (VPA, bereid volgens stap 2.2.3.) Met een steriele 1 ml serologische pipet en overgebracht naar een steriele 50 ml buizen. </li><li> Zuig 5,0 ml voorverwarmd Medium B en 44 ml voorverwarmd Medium A en voeg dit aan de VPO oplossing met een steriele serologische pipet 50 ml vers kweekmedium te bereiden met een uiteindelijke concentratie van 4,4 mM VPA. </li><li> Verplaats de kweek getransfecteerd in de bioveiligheid kast na het steriliseren van het uitwendige van de kolf met 70% ethanol in wateroplossing, voeg de voorbereide verdunningsmiddel en breng de kolf naar de schudinrichting geïncubeerd. </li></ol></li><li> Expressie en Harvest (2-6 dagen) <ol><li> Incubeer de cellen gedurende nog 4-5 dagen (5-6 dagen sinds transfectie). </li><li> Trekken hoeveelheden kweekmedium volgende stap 1.2.2. naar 1.2.5. beschreven in &quot;1,2. Cell onderhoud&quot; boven met een steriele 1 ml serologische pipet tot cellulaire levensvatbaarheid bewaken en opslaan aliquots eiwitexpressie te analyseren dagelijks door SDS-PAGE (zie hoofdstuk 5, hieronder). </li><li> Oogst cellen na 5-6 dagen door centrifugeren van de cellen plus medium bij 1000 g gedurende 5 min. Bovendien, de oogst van het bovenstaande als de levensvatbaarheid van de cellen daalt tot onder 50% (zie stappen 1.2.2-1.2.5). </li><li> Giet de bovenstaande vloeistof die uitgescheiden eiwitten bevatten. Voeg 5 ml van een 10% bleekwater naar de HEK celpellet en gooi als biologisch. </li></ol></li></ol> 4. Protein Purification <ol><li> Bereid een kolom met 5 ml Proteïne A-Sepharose. Equilibreren van de kolom met 5 kolomvolumes buffer A (20 mM 3- (N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCll). </li><li> Centrifugeer de verzamelde supernatant met expressie gebracht eiwit op hoge snelheid (14.000 g gedurende 10 min) om alle resterende celresten te verwijderen. Verzamelen door decanteren in een nieuwe buis. Gooi de pellet als biologisch. </li><li> Verzamel een 10 pl aliquot van het supernatans en bovendien laat een klein monster van elk eiwit zuiveringsstap om het monster met SDS-PAGE analyse (beschreven in paragraaf 5). Laad de geklaarde supernatant en het verzamelen van de stroom door. </li><li> Was de kolom met 3 kolomvolumes buffer A en elueer het eiwit met 5 kolomvolumes van 100 mM glycine, pH 3,0. Verzamel het eluaat in buizen met een half volume van 1 M Tris buffer, pH 8,0 snel neutraliseren van de pH. </li><li> Was de kolom met 10 kolomvolumes buffer A en op te slaan voor toekomstig gebruik. </li><li> Bufferuitwisseling het geëlueerde eiwit met ten minste een 10-voudige overmaat aan buffer A via 10 kDa moleculair gewicht cut-off centrifugale filters. Opmerking: de geëlueerde monster niet concentrereneen zeer klein volume (&lt;2 ml) in de buffer geëlueerd. Gebruik de centrifugale filters om de buffer te wisselen met buffer A. </li><li> WINKEL gezuiverde eiwit bij 4 ° C tot het volgende gebruik. Opmerking: Eiwit expressie in de supernatant worden gezuiverd door affiniteit kolommen geselecteerd op basis van eigenschappen van eiwit of het gebruik van affiniteitstags. Voor een typische zuiveringsprocedure, Proteïne A-kolom kan worden gebruikt voor IgG of Fc-fragmenten of nikkel kolom kan worden gebruikt om eiwitten tot expressie gebracht met een poly-histidine tag. Hier is een beschrijving van de zuiveringsstappen voor IgG1-Fc gebruikmaking van een Proteïne A kolom. </li></ol> 5. Analyse van eiwit door SDS-PAGE <ol><li> Verdun de monsters (7,5 pl) van elk monster met een gelijk volume van 2x loading buffer (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-mercaptoethanol, 20% glycerol en 0,01% broomfenolblauw). </li><li> Kook het mengsel bij 90 ° C gedurende 5 min met een verwarmingsblok of waterbad. Centrifugeer de monsters bij 10.000 g for 1 min. Laad de bereide gel met 5 ul van marker eiwit en 14 ul van monsters voor analyses met behulp van een 20 ul pipet met een wegwerp tip. </li><li> Run een gel bij 25 mA gedurende 60 min. Zodra de elektroforesestap is voltooid, breng de gel aan een houder met 1 l water en magnetron 5 min. </li><li> Vlekken op de gel met een kleuroplossing (40% ethanol, 10% azijnzuur en 0,1% Coomassie brilliant blue) gedurende 2 uur en ontkleuring in water. </li></ol> 6. Glycans analyse door massaspectrometrie <ol><li> Analyseer glycanen zoals eerder 44 beschreven. In het kort, 75 ug van IgG1-Fc werd getrypsiniseerd, vervolgens behandeld door PNGaseF voor de vrijlating van glycanen 45. Gepubliceerd glycanen werden gepermethyleerd en door matrix-geassisteerde laser-desorptie ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOFMS) geanalyseerd. </li></ol> 7. Protocol Aanpassingen voor speciale Scenario <ol><li> Etikettering Eiwitten met 15 N-gemerkte aminozuren (voor een 50 ml transfectie volume) <ol><li> Doseer 5 mg van elk aminozuur in een enkele steriele glazen flesje. Mengen met 4 ml autoclaaf water (let Tyr niet volledig oplosbaar, in tegenstelling tot de Leie en Phe). Steriliseer de oplossing autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min. Laat de oplossing afkoelen tot ongeveer 50-60 ° C. </li><li> Voor een 50 ml transfectie volume, volgt u stap 3.1.3 volgens &quot;3.1 Oprichting van een tijdelijke transfectie&quot;. Zie de sectie aanvullende materialen voor een voorbeeld met de juiste volumes. </li><li> Voor transfectie volgen stappen &quot;3. Instelling van een transiënte transfectie&quot; met vers kweekmedium vervangen met gemerkt aminozuurresten zoals hierboven bereid. </li><li> Na 24 uur transfectie, op de dag van de cultuur verdunning intrekken 5,0 ml voorverwarmd Medium B, 40 ml voorverwarmd Medium A en een vers geautoclaveerd 4 ml van de aminozuur mengsel (bereid als in stap 7.1.1. Hierboven) en voeg 1ml voorverwarmd voorraadoplossing van VPA oplossing 50 ml vers kweekmedium verdunning te bereiden met een uiteindelijke concentratie van 4,4 mM VPA. Voeg dit medium aan de transfectie cultuur met een steriele serologische pipet. </li><li> Breng de kweek getransfecteerd in de bioveiligheid kast na het steriliseren van het uitwendige van de kolf met 70% ethanol in wateroplossing, voeg de voorbereide verdunningsmiddel en breng de kolf naar de schudinrichting geïncubeerd. Opmerking: Medium A een chemisch gedefinieerd serumvrij medium. Aldus is het mogelijk om een ​​andere formulering te bereiden. Neem contact op met de leverancier om een ​​aangepaste Medium Een voorbereiding die bepaalde aminozuren ontbeert verkrijgen. Het is mogelijk om alle aminozuren weggelaten, maar wij verkiezen medium dat slechts enkele uitgelezen residuen mist gebruiken omdat een volledige uitval medium aanpassing van osmolariteit na supplementatie vereist. We kozen voor een Lys-Tyr-Phe uitval medium dat kan worden aangevuld en niet osmolariteit aanpassing. Furthermore, het Medium Een leverancier niet vrij deelt de concentraties van medium componenten; we gebruikten 100 mg / l elk voor Lys, Tyr en Phe succesvol. Volumes van de transfectie en expressie medium moet worden bijgesteld wanneer de extra aminozuren. Hier zijn de aanpassingen aan het protocol hierboven voor isotoop labeling </li></ol></li><li> Vullen de Transfectie met een klein molecuul <ol><li> Bereid 100 mM voorraadoplossing van 2-deoxy-2-fluor-l-fucose gebruik geautoclaveerd water en steriliseer deze oplossing wordt met een 0,22 uM filter. </li><li> Voor een kweek 50 ml, voeg 125 ul (250 uM) van de fucose analoge oplossing voor de transfectie en dilutievloeistof. Opmerking: we nagelaten verdere volumeregeling uitvoeren omdat toevoeging van de substituent op deze concentratie maakt slechts 0,25% van het totale kweekvolume .Het is mogelijk om de expressie met behulp van kleine molecule inhibitoren van glycan verwerkende wijzigen. Hier beschrijven we de voorwaarden voor het opnemen van 2-deoxy-2-fluor-l-fucose, een remmer van glycan fucosylatie. Hebben we&gt; 90% reductie in fucosylatie door toevoeging van fucose analoog in een concentratie van 250 uM in de transfectie en dilutievloeistof. </li></ol></li></ol>

Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen in dit manuscript.

Dit protocol illustreert eiwitexpressie via transiënte transfectie van HEK293F of S cellen. De in de Barb en Moremen labs opgericht optimale transfectie voorwaarden gebruik van een kritische combinatie van celdichtheid en reagensconcentraties hoog rendement transfectie te bereiken. Kritische overwegingen bij de uitvoering van dit protocol zijn onder andere: het behoud van een stabiele cultuur voor transfectie (met consistente cultuur verdubbeling keer); transfectie van actief groeiende cellen (verdunning cellen tot 1 x ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Het produceren van hoge opbrengsten van de juiste gevouwen en post-translationeel gemodificeerde menselijke eiwitten voor een gedetailleerde analyse van de structuur en functie blijft een belangrijke uitdaging. Een groot aantal expressiesystemen beschikbaar die recombinante eiwitten met natief-achtige en gedrag produceren. Bacteriële expressiesystemen, voornamelijk Escherichia coli-stammen, zijn de meest toegankelijke en gebruikte gereedschappen in de onderzoeksarena, vanwege de eenvoud van deze expressiesystemen, ofschoon gist, plant, insect en zoogdier systemen zijn ook beschreven 04/01. Het merendeel van deze systemen zijn niet in staat geschikte posttranslationele modificatie van de doeleiwitten. Een fundamenteel belang van de Barb en Moremen laboratoria is het produceren van eukaryote eiwitten met de juiste glycosylering. Veel menselijke eiwitten nodig passende glycosylering voor de juiste functie (zie 5). De eukaryotischeglycosyleringsmachinerie is uitgebreid en in staat om een uiteenlopende modificaties, zowel asparagine (N) - en serine / threonine (O) complex-gebonden glycanen 6. Geschat wordt dat&gt; 50% van humane eiwitten N-geglycosyleerd 7. Glycanen essentiële componenten van verschillende proteïnen, waaronder therapeutische monoklonale antilichamen, erytropoëtine en bloedstollingsfactoren zoals factor IX, om een ​​paar te noemen. Hoewel meerdere methoden bestaan ​​om de juiste N-geglycosyleerde eiwitten te bereiden en variëren van puur synthetische 8-10, om chemoenzymatic 11-14 of herstel van ontworpen recombinante systemen 15-20, niet verrassend, menselijke expressie systemen hebben tot nu toe bewezen de meest robuust werkwijzen voor het genereren van humane eiwitten. Veel therapeutische humane glycoproteïnen worden geproduceerd in recombinante systemen die gebruik zoogdiercellen. Systemen van de nota zijn de Chinese hamster ovarium (CHO), muis myeloom (NS0), baby hamster kidney (BHK), humane embryonale nier (HEK-293) en menselijke netvlies cellijnen die werkzaam zijn in de hechting of opschorting cultuur eiwitproductie 4,21,22. Echter, zoogdieren eiwitexpressiesystemen het genereren van stabiele cellijnen, dure kweekmedia en substraat geassisteerde transfectie procedures 23 vereist. Zoogdiercel transfectie wordt bereikt met behulp van talrijke middelen zoals calciumfosfaten 24,25, kationische polymeren (DEAE-dextran, polybreen, polylysine, polyethylimine (PEI)) of positief geladen kationische liposomen 26-29. PEI is een polykationisch, geladen, lineair of vertakt polymeer (25 kDa) 26 dat een stabiel complex vormt met DNA en endocytose. Na aanzuren van het endosoom wordt PEI gedacht te zwellen, waardoor de scheuring van endosomen en afgifte van het DNA in het cytoplasma 26,30. Tot voor kort, voorbijgaande transfectie in suspensiop kweek werd uitgevoerd door voorafgaande DNA / PEI complexvorming, gevolgd door toevoeging aan de 29 celkweek. Echter, Würm en medewerkers rapporteerden een zeer efficiënt protocol geoptimaliseerd voor recombinante eiwitproductie in HEK293 cellen die een DNA / PEI complex in situ 31,32 gevormd. Deze vermeden voorbereiding, sterilisatie van het complex, en de buffer te wisselen in een kweekmedium. Verdere optimalisatie door het opnemen van expressie verbeteren van plasmiden heeft geleid tot een aanzienlijke toename van de opbrengst 33. Hierin is een methode die voortbouwt op deze vooruitgang en is breed toepasbaar. Expressie mogen ook worden gewijzigd volgens de N-glycan samenstelling beïnvloeden. De HEK293S cellijn met een gen deletie die N-glycan verwerking in een tussenstadium stopt, leidt tot de expressie van eiwitten met uniforme N-glycanen bestaande uit 2 N-acetylglucosamineresten plus vijf mannose residuen (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Deze cellenmissen het N-acetylglucosaminyl transferase I (GNTI) gen dat vereist is voor stroomafwaartse N-glycan verwerkende 36,37. Het gebruik van glycosyltransferase-remmers waaronder kifunensine, siaalzuur analogen en fucose analoge en 2-deoxy-2-fluor-fucose gelijksoortige gevolgen en beperkingen N-glycan verwerkende 38-41. Het protocol hier gerapporteerde gebruikt pGEn2 vector zoals getoond in figuur 1 42,43, PEI bijgestaan ​​transiënte transfectie in zoogdiercellen leidingen (HEK293F HEK293S of cellen) en de terugwinning van hoge opbrengsten op passende geglycosyleerd eiwit. Dit systeem is robuust en is geschikt voor diverse factoren, waaronder isotopen en glycan techniek voor de productie van grote titers van recombinante eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Biosafety cabinet&nbsp;</td><td>NuAire, Inc.</td><td>CellGard ES NU-S475-400</td><td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td></tr><tr><td>Incubatie shaker</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Multitron Cell&nbsp;</td></tr><tr><td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>14571C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>125 Erlenmeyer kolf met ontluchter</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431143</td><td></td></tr><tr><td>250 Erlenmeyer kolf met ontluchter</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle HEK 293F Cellen</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>1 ml wegwerp serologische pipet</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml wegwerp serologische pipet</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml wegwerp serologische pipet</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td><td>Drummond Scientific</td><td>161263</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw oplossing&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Telling slides&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td>Bereid stockoplossing met een concentratie van 1 mg/ml in een buffer met 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) en 150 mM NaCl (pH 7,5). Los PEI volledig op; steriliseer door een 0,22 μM spuitfilter en bewaar bij -20 °C.</td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Spuitfilter, 0,22 μM</td><td>Fisher Scietific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Trisaminomethan (Tris base)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>222249</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>BDH chemicals</td><td>BDH8014</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid zuiveringskit</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td></td></tr><tr><td>Valproic (VPA)</td><td>SIGMA</td><td>P4543</td><td>Bereid stockoplossing van 220 mM&nbsp; in water, steriliseer door een steriele 0,22 mm filter te passeren en bewaar bij -20 °C</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EW-17707-65</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Sepharose kolom</td><td>SIGMA</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>QIAGEN</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino)propaansulfonzuur (MOPS)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa moleculair gewicht cut-off Amicon&reg; Ultra centrifugal filters&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>ALDRICH</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>ALDRICH</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>SIGMA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur, Glaciaal&nbsp;</td><td>Fisher Scietific</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>coomassie briljantblauw&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15N gelabeld L-Tyrosine</td><td>ALDRICH</td><td>332151</td><td></td></tr><tr><td>15N gelabeld L-Lysine</td><td>ALDRICH</td><td>592900</td><td></td></tr><tr><td>Ongelabeld L-Phenylalanine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>ALDRICH</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&nbsp;</td><td>SANTA CRUZ Biotechnology</td><td>sc-283123</td><td></td></tr></tbody></table>

high yield expressie van recombinante humane eiwitten met de transient transfectie van hek293 cellen in suspensie

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

De kunst van het produceren van recombinante eiwitten met complexe post-translationele modificaties is een grote uitdaging voor studies van de structuur en functie. De snelle vaststelling en hoge herstel van transiënt getransfecteerde zoogdiercellijnen richt deze barrière en is een effectieve manier tot expressie eiwitten die van nature via de ER en Golgi-gemedieerde secretorische pathway. Hier is een protocol voor het eiwit expressie met behulp van het menselijk HEK293F en HEK293S cellijnen getransfecteerd met een zoogdierexpressievector ontworpen voor hoge eiwit opbrengsten. De toepasbaarheid van dit systeem wordt aangetoond met behulp van drie representatieve glycoproteïnen die uitgedrukt met opbrengsten tussen 95-120 mg van het gezuiverde eiwit teruggevonden per liter cultuur. Deze eiwitten zijn de menselijke FcγRIIIa en rat α2-6 sialyltransferase, ST6GalI, beide uitgedrukt met een N-eindstandige GFP fusie, alsook ongemodificeerd menselijk immunoglobuline G1 Fc. Deze robuuste systeem utilizes een serumvrij medium dat is aangepast voor expressie van isotopisch verrijkte eiwitten en koolhydraten structurele studies met massaspectrometrie en kernmagnetische resonantiespectroscopie. Verder kan de samenstelling van de N-glycan worden afgesteld door toevoeging van een kleine molecule bepaalde glycaan wijzigingen voorkomen op een wijze die de opbrengst vermindert.

Hoog niveau eiwitexpressie en zuiverheid Deze geoptimaliseerde expressie systeem genereerde een hoge opbrengst van versuikerde eiwitten. Een typisch patroon wordt de expressie van IgG1-Fc (figuur 1). In dit geval, Dag 0 is de dag transfectie gevolgd op dag 1 (verdunning) en vervolgteelt dag tot dag 5. Eiwit expressie wordt geanalyseerd met de oplosbare fractie expressie in het ruwe medium. Een zeer kleine hoev...

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Het algemene doel van deze procedure is om mammaliaanse glycoproteïnen met de juiste mammaliaanse glycosylering tot expressie te brengen door recombinant eiwitten naar het ER en het GOGI-gemedieerde secretiepad te richten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de immunologie, zoals de rol van een specifieke specificatie, patronen in de structuur en het immuunactivatiepotentieel van antilichamen en antilichaamfragmenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er menselijke cellen worden gebruikt om menselijke eiwitten tot expressie te brengen, wat de juiste cellulaire machinerie biedt om de doeleiwitten correct te vouwen en te modificeren.De incubatieschudmachine voor de vestiging van de cellen moet minimaal één uur vóór de inoculatie van de cultuur worden bediend bij 135 RPM, 80% luchtvochtigheid, 8% kooldioxide en 37 °C. Zet de UV-lamp van de veiligheidskast aan en verwarm de verzegelde flessen met medium A en medium B voor in een waterbad van 37 °C. Zet de UV-lampen uit en steriliseer de veiligheidskast met een oplossing van 70% ethanol en water.Steriliseer een erlenmeyer kweekkolf van 125 milliliter met geventileerde dop, pipetten, pipetteerdhulpen en voorverwarmde mediumflessen door ze te besproeien met een 70% ethanol-wateroplossing. Plaats deze items gedurende deze procedure in de biologische veiligheidskast. Alle items moeten op deze manier worden gesteriliseerd voordat ze in de biologische veiligheidskast worden gebracht.Bereid vers cultuurmedium voor een cultuur van 30 milliliter door 26 milliliters medium A en drie milliliters medium B af te nemen en over te brengen naar de 125 milliliter erlenmeyerkolf. Meng door voorzichtig te schudden. Warm een vial HEK 2 93 F-cellen, die eerder waren ingevroren bij minus 80 graden Celsius, op in een waterbad bij 37 graden Celsius om de cellen gedeeltelijk te ontdooien. Dit duurt ongeveer één minuut en de cellen mogen niet volledig ontdooid worden.Sterilise vervolgens de buitenkant van het flacon met de 70% ethanol in water-oplossing en plaats deze in de biologische veiligheidskabinet. Neem met een pipet van één milliliter de celsuspensie op en breng deze over in de erlenmeyer van 125 milliliter die 29 milliliter vers kweekmedium bevat. Sluit de dop van de kweekfles en plaats de fles gedurende 24 uur in de schudincubator.24 uur na inoculatie van de cultuur. Controleer de celdichtheid, steriliseer de cultuurfles met een 70% ethanol- en wateroplossing en plaats deze in de veiligheidskast. Gebruik een pipet van 1 ml en een pipetteerhulp om langzaam 100 µL van de cultuur op te nemen en over te brengen naar een steriele einor-buis van 0,5 ml.Sluit het deksel van de kweekfles en plaats de kweekfles zo snel mogelijk terug in de incubator-schudmachine. Meng 7,5 µL van een trypaanblauwoplossing met 7,5 µL cellen. Meng krachtig en breng vervolgens 7,5 µL van het mengsel over naar een telplaatje.Zet de automatische celteller aan en plaats het telplaatje in de lade. De automatische lezer wordt geactiveerd en de cellen worden automatisch geteld in eenheden van aantal cellen per milliliter en het percentage levensvatbaarheid. Bepaal het volume van de donorcultuur dat nodig is voor overdracht naar een vers cultuurmedium om een celdichtheid van 300 000 levende cellen per milliliter te verkrijgen.Bereid vers kweekmedium voor zoals eerder beschreven door 23 milliliter medium A en drie milliliter medium B over te brengen naar een schone kweekkolf van 125 milliliter. Verwijder daarna de voorraadflessen van medium A en medium B uit de veiligheidskast om het risico op contaminatie te verminderen. Haal de HEK 2 93 F cellen-kweekkolf uit de incubator.Besproei het met de 70% ethanol- en wateroplossing en plaats het in de veiligheidskast. Neem met een nieuwe pipet de juiste aliquot cellen uit de cultuur en breng deze over naar de kolf met vers cultuurmedium. Verplaats beide culturen van de veiligheidskast naar de schudincubator.Kweek de cellen tot een geschatte dichtheid van twee tot 3 miljoen levende cellen per milliliter voorafgaand aan de transfectie. Controleer de celdichtheid zoals eerder gedemonstreerd en bepaal het aantal cellen voor de transfectie. Gebruik hiervoor een steriele serologische pipet.Breng het juiste volume cel-suspensie over naar een centrifugebuis van 250 milliliter. Pellet de cellen door centrifugatie bij 100 ×g gedurende vijf minuten. Plaats de buis met de gecentrifugeerde cellen na sterilisatie in de biologische veiligheidskast.Gebruik een steriele pipet om het supernatant dat bestaat uit verbruikt kweekmedium af te gieten. Resuspendeer de gepelleteerde cellen krachtig door met 10 milliliters vers kweekmedium op en neer te pipetteren en breng deze over naar een voorbereide kolf met vers transfectiekweekmedium. Draai de dop op de geventileerde celkweekkolf en incubeer de kolf in de schudincubator gedurende 15 minuten tot één uur terwijl de cellen incuberen.Verdun de plasma-DNA en POLYETHERAMINE of PEI voorraden met vers kweekmedium tot een eindconcentratie van 0,5 micrograms per microliter. Haal de kweekfles met de gedispergeerde cellen uit de incubator-schudder en breng deze naar de veiligheidskast; voeg met een micropipet 300 microliters plasma-DNA toe aan de kweek en meng door voorzichtig handmatig te schudden, voeg vervolgens 900 microliters PEI toe aan de kweek en meng opnieuw. Voeg daarna 3,8 milliliters vers kweekmedium toe.Plaats de kolf gedurende 24 uur in de incubator-schudmachine. 24 uur na transfectie moet de celcultuur worden verdund. Gebruik voor het bereiden van het verdunningsmedium eerst een steriele serologische pipette van één milliliter om één milliliter VOORVERWARMD 220 millimolair valprozuur of VPA op te nemen en over te brengen naar een steriele koker van 50 milliliter.Gebruik vervolgens een steriele serologische pipette om vijf milliliter voorverwarmd medium B en 44 milliliter voorverwarmd medium A aan de VPA-oplossing toe te voegen. Dit resulteert in 50 milliliter vers kweekmedium met een uiteindelijke concentratie van 4,4 millimolair VPA. Haal de getransfecteerde kweek uit de incubator.Sterilise de buitenkant van de kolf en plaats de kolf in de biologische veiligheidskabinet. Voeg het bereide verdunningsmedium toe aan de cultuur. Plaats de kolf na de transfectie nog eens vier tot vijf dagen terug in de schudincubator.Controleer dagelijks de celviabiliteit via de eerder gedemonstreerde procedure. Er moeten elke dag aliquots worden bewaard voor proteïne-expressieanalyse, vijf tot zes dagen na transfectie of indien de celviabiliteit onder de 50% daalt. Oogst de cellen door de cellen samen met het medium vijf minuten te centrifugeren bij 1000 ×g. Verzamel het supernatant dat het uitgescheiden proteïne bevat. Voeg vijf milliliter van een 10% bleekoplossing toe aan de HEK-celpellet en gooi deze af als biologisch gevaarlijk afval.Vervolgens wordt het eiwit gezuiverd uit het verzamelde supernatant. Dit expressiesysteem genereerde een hoge opbrengst aan glycosyleerde eiwitten, zoals geïllustreerd door dit typische expressiepatroon van IgG1 Fc na transiënte transfectie van HK 293 F-cellen. Affiniteitszuivering met een eiwitkolom voor IgG1 Fc of een nikkelkolom voor histidinetagged GFP met FC gamma receptor III A resulteerde in eiwitten met een hoge zuiverheid.Dit systeem drukte isotoop verrijkt IgG one FC efficiënt uit in dit tweedimensionale NMR-spectrum, dat de resonantiefrequentie van waterstofkernen en de direct gebonden amide-stikstof correleert. Er werden goed verspreide signalen van 15 atomen waargenomen. Verschillende glycovormen werden geproduceerd met HEK 2 93 F- en HEK 2 93 s-cellen onder verschillende kweekcondities, zoals aangetoond door matrix-assisted laser DESORPTION ionisatie massaspectrometrie-analyses.IgG1 Fc tot expressie gebracht vanuit HEK 293S-cellen, bezat glycanen in een vorm met vijf mannose plus twee N-acetylglucosamine-residuen, die geen fucose-glycanen bevatten. Glycanen uit HEK 293F-expressiemateriaal waren complexe bi-antenaire vormen met kern-fucose en bestonden hoofdzakelijk uit terminale N-acetylglucosamine of een klein aandeel mono- of di-antenaire vormen. De toevoeging van een glycaneringsremmer bij een expressie uitgevoerd met HEK 293F-cellen vertoonde een reductie van meer dan 90% in fucose-incorporatie. Eenmaal beheerst, kan de transient transfection worden voltooid in 1,5 uur op dag één en 15 minuten op dag twee. Na een expressieperiode van vier tot zes dagen kan de oplossing die het eiwit bevat in 15 minuten worden geoogst.Ten slotte zal de zuivering van het eiwit ongeveer 1,5 uur duren; bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een stabiele cultuur moet worden gehandhaafd voorafgaand aan de transfectie, dat actief groeiende cellen moeten worden getransfecteerd en dat DNA moet worden toegevoegd voordat PEI wordt toegevoegd. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals functionele eiwitkarakterisering met behulp van diverse biofysische technieken, worden uitgevoerd om de structuur en functie van het tot expressie gebrachte glycoproteïne na de ontwikkeling te onderzoeken.Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van immunologie om de structuur-activiteitsrelatie van IgG en glycosylering in vitro en in vivo te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u glycoproteïnen kunt prepareren en zuiveren met behulp van onze combinatie van K 2 93 F-cellen en de PZ N twee-vector.

high-yield-expression-recombinant-human-proteins-with-transient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

The video demonstrates a method for producing therapeutic antibodies using stably transfected mammalian cells. Tryptone supplementation stimulates cell division, resulting in overgrowth and supporting a higher antibody yield. The antibody-containing medium is harvested, filtered, and stored for further use.

Antibody Production from a Batch Overgrowth Culture of Transfected Mammalian Cells

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

We beschrijven hier een kosteneffectief granzyme-expressiesysteem met behulp van HEK293T-cellen dat hoge opbrengsten produceert van zuivere, volledig geglycoseerde en enzymatisch actieve protease.

Een hoge opbrengst en kosten-efficiënte Expression System van Human granzymen in zoogdiercellen

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Dit protocol beschrijft de productie van een therapeutisch antilichaam in een zoogdier expressiesysteem. De beschreven werkwijzen omvatten bereiding van vector-DNA, transfectie en stabiele serumvrije adaptatie van humane embryonische nier 293 cellijn opgezet van grootschalige kweken en zuiveren met behulp van affiniteitschromatografie.

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

We bieden schaalbare protocollen voor constructontwerp, voorbijgaande transfectie en expressie en zuivering van volledige menselijke huntingtine-eiwitvarianten in HEK293-cellen.

Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

Leer hoe je recombinante humane glycoproteïnen produceert met HEK293-cellen in suspensie via transient transfectie. Deze methode optimaliseert eiwitvouwing en glycosylering voor immunologisch onderzoek.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Meer video's verkennen