High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie
28 december 2015
De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.
Het algemene doel van deze procedure is om glycoproteïnen van zoogdieren met geschikte glycosylering van zoogdieren tot expressie te brengen door recombinante eiwitten te richten op het ER en GOGI-mediade secretiepad. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de immunologie te beantwoorden, zoals wat de rol is van een specificatie, patronen in de structuur en immuunactiveringspotentieel van antilichamen en antilichaamfragmenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het menselijke cellen gebruikt om menselijke eiwitten tot expressie te brengen, wat de juiste cellulaire zending biedt om de doeleiwitten op de juiste manier te vouwen en te modificeren.
De incubator shaker voor cel-establishment moet worden gebruikt op 135 RPM, 80% vochtigheid, 8% koolstofdioxide en 37 graden Celsius ten minste een uur voorafgaand aan de cultuur-inoculatie. Zet de UV-lamp van de bioveiligheidskast aan, verwarm de verzegelde medium A- en medium B-flessen in een waterbad van 37 graden Celsius voor. Zet de UV-lampen uit en steriliseer de bioveiligheidskast met een 70% ethanol en water oplossing.
Steriliseer een 125 milliliter Erlenmeyer-groeifles met ventieldop pipettes, pipetters en voorverwarmde mediumflessen door met een 70% ethanol in water oplossing te besproeien. Plaats deze items in de bioveiligheidskast gedurende deze procedure. Alle items moeten op deze manier worden gesteriliseerd voordat ze in de bioveiligheidskast worden gebracht.
Bereid vers kweekmedium voor een 30 milliliter kweek door 26 milliliter medium A en drie milliliter medium B te onttrekken en over te brengen in de 125 milliliter Erlenmeyer-fles. Meng door voorzichtig te schudden, verwarm een fles HEK 2 93 F-cellen die eerder waren ingevroren bij min 80 graden Celsius in een waterbad van 37 graden Celsius om de cellen gedeeltelijk te ontdooien. Dit duurt ongeveer een minuut en de cellen mogen niet volledig worden ontdooid.
Steriseer vervolgens de buitenkant van de fles met de 70% ethanol in water oplossing en verplaats deze naar de bioveiligheidskast. Trek met een 1 milliliter pipet de celsuspensie op en breng deze over in de 125 milliliter Erlenmeyer-fles met 29 milliliter vers kweekmedium. Sluit het deksel van de kweekfles en plaats de fles gedurende 24 uur in de incubator shaker.
24 uur na kweek-inoculatie. Controleer de celdichtheid, steriliseer de kweekfles met de 70% ethanol en water oplossing en verplaats deze naar de bioveiligheidskast. Trek met behulp van een 1 milliliter pipet en pipetteer langzaam 100 microliters van de kweek op en breng deze over in een steriele 0,5 milliliter einorbuis.
Sluit het deksel van de kweekfles en plaats de kweekfles zo snel mogelijk terug in de incubator shaker. Meng 7,5 microliter van een trian blauw oplossing met 7,5 microliter van cellen. Meng krachtig en breng vervolgens 7,5 microliter van het mengsel over naar een telplaatje.
Zet de automatische celteller aan en plaats het telplaatje in de laadkamer. De automatische lezer wordt geactiveerd en cellen worden automatisch geteld in de eenheden van aantal cellen per milliliter en procent levensvatbaarheid. Bepaal het volume van de donorkweek dat vereist is voor overdracht naar een vers kweekmedium om een celdichtheid van 300.000 levende cellen per milliliter te verkrijgen.
Bereid vers kweekmedium voor zoals eerder getoond door 23 milliliter medium A en drie milliliter medium B over te brengen naar een verse 125 milliliter kweekfles. Verwijder daarna de voorraadflessen medium A en medium B uit de bioveiligheidskast om het risico op besmetting te verminderen. Haal de HEK 2 93 F celkweekfles uit de incubator.
Besproei deze met de 70% ethanol en water oplossing en plaats deze in de bioveiligheidskast. Gebruik een nieuwe pipet. Trek de juiste aliquot van cellen uit de kweek op en breng deze over naar de fles met vers kweekmedium. Breng beide culturen over van de bioveiligheidskast naar de incubator shaker.
Laat de cellen groeien tot een geschatte dichtheid van twee tot 3 miljoen levende cellen per milliliter voorafgaand aan transfectie. Controleer de celdichtheid zoals eerder is aangetoond en bepaal de hoeveelheid cellen voor de transfectie. Gebruik een steriele serologische pipet.
Breng het juiste volume celsuspensie over naar een 250 milliliter centrifugeerbuis. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 100 keer G gedurende vijf minuten. Breng na sterilisatie de buis met de gepelletede cellen over naar de bioveiligheidskast.
Gebruik een steriele pipet om het supernatant bestaande uit afgewerkt. Kweekmedium krachtig te decanteren, herstuur de gepelletede cellen door op en neer te pipetten met behulp van 10 milliliter vers kweekmedium, en breng over naar een voorbereide fles met vers transfectiekweekmedium. Schroef de dop op de geventileerde celkweekfles en incubeer de fles in de incubator shaker gedurende 15 minuten tot een uur terwijl de cellen incuberen.
Verdun het plasma-DNA en POLYETHERAMINE of PEI-voorraad met vers kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 microgram per microliter. Verwijder de kweekfles met de verspreide cellen uit de incubator shaker en breng deze naar de bioveiligheidskast. Gebruik een micropipet en 300 microliter plasma-DNA naar de kweek en meng door voorzichtig handmatig te schudden bij 900 microliter PEI naar de kweek en meng opnieuw. Breng vervolgens 3,8 milliliter vers kweekmedium over.
Breng de fles over naar de incubator shaker voor 24 uur. 24 uur na transfectie moet de celkweek worden verdund. Om het verdunningsmedium eerst voor te bereiden, gebruik een steriele 1 milliliter serologische pipet om een milliliter voorverwarmd 220 millimolair valproïnezuur of VPA op te trekken en breng deze over naar een steriele 50 milliliter buis.
Gebruik vervolgens een steriele serologische pipet om vijf milliliter voorverwarmd medium B en 44 milliliter voorverwarmd medium A toe te voegen aan de VPA-oplossing. Dit resulteert in 50 milliliter vers kweekmedium met een uiteindelijke concentratie van 4,4 millimolair VPA. Haal de getransfecteerde kweek uit de incubator.
Steriliseer de buitenkant van de fles en plaats de fles in de bioveiligheidskast. Vo
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het tot expressie brengen van zoogdier glycoproteïnen met correcte glycosylering door gebruik te maken van de ER- en Golgi-secretieroutes. Het is bijzonder nuttig voor immunologisch onderzoek, gericht op antilichaamstructuur en immuunactivering.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Eiwitexpressie
Achtergrond
- De productie van eukaryote eiwitten is uitdagend vanwege post-translationele modificaties.
- Menselijke cellen bieden de noodzakelijke omgeving voor correcte eiwitvouwing en -modificatie.
- Deze methode verbetert het begrip van antilichaamfunctionaliteit.
- Het ondersteunt selectieve aminozuurlabeling en kleine molecuulmodulatie.
Doel van de studie
- Om glycoproteïnen met zoogdier glycosylering tot expressie te brengen.
- Om het immuunactiveringspotentieel van antilichamen te onderzoeken.
- Om structurele patronen in antilichamen en antilichaamfragmenten te verkennen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een zoogdierexpressiesysteem.
- Targeting van recombinante eiwitten naar de ER- en Golgi-routes.
- Incubator shaker-instellingen: 135 RPM, 80% vochtigheid, 8% CO2, 37°C.
- Voorbereiding van kweekmedia en sterilisatiesterilisatie van de bioveiligheidskast.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle expressie van zoogdier glycoproteïnen.
- Aangetoond correcte glycosylering en vouwing van eiwitten.
- Biedt inzichten in antilichaamstructuur en immuunrespons.
- Een snel protocol voor eiwitexpressie opgesteld.
Conclusies
- Deze methode vergemakkelijkt de studie van glycoproteïnen in de immunologie.
- Gebruik van menselijke cellen verhoogt de relevantie van de bevindingen.
- Het protocol biedt een robuuste benadering voor eiwitexpressie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Transient transfection of HEK293 suspension cells enables rapid, high-yield production of recombinant human glycoproteins with native-like post-translational modifications, addressing a critical bottleneck in biologics discovery. This system supports early-stage target validation by providing properly folded and glycosylated proteins for functional and structural assays, reducing mechanistic ambiguity in antibody and cytokine studies. The ability to tune glycoforms and incorporate isotopic labels enhances predictive confidence in lead selection and de-risks downstream preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables expression of human FcγRIIIa, ST6GalI, and IgG Fc with yields of 95-120 mg/L, supporting quantitative binding and effector function assays.
- Operational Value: Uses serum-free, suspension-adapted HEK293F/S cells scalable to multi-liter cultures for consistent protein supply.
- Predictive Value: Glycoform tuning via VPA inhibition allows assessment of FcγR binding and ADCC potential without yield loss.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Secreted glycoproteins in culture supernatant simplify harvest and enable high-throughput purification via affinity tags (His, Protein A/G).
- Operational Value: Transfection-to-purification timeline of <6 days supports iterative antigen/antibody screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified proteins show high purity and homogeneity, suitable for SPR, ELISA, and biophysical characterization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Mammalian glycosylation patterns from HEK293 cells improve relevance of in vitro functional data to in vivo mechanisms.
- De-risking: Isotopic labeling (15N) enables NMR/MS structural analysis to confirm folding and modification early in discovery.
- Preclinical Alignment: Glycoengineered variants support Fc-silent or enhanced effector function molecule design for therapeutic optimization.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing recombinant antigens and immunoglobulins for early biophysical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-glycan interactions and immune complex formation using properly glycosylated Fc domains.
- Screening: Enables production of recombinant glycoproteins for screening antibody libraries or glycan-binding proteins.
- Analytics: Yields isotopically enriched samples for NMR and MS, facilitating structural epitope mapping and glycan profiling.
- Translational Research: Glycoform control allows evaluation of Fc effector functions predictive of in vivo activity.
- Enterprise Reuse: Platform is adaptable across projects for antibodies, cytokines, and enzymes requiring human-like glycosylation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through authentic human glycosylation and folding.
- Operational Value: Standardized, suspension-based protocol with defined transfection and harvest timelines.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early glycoform structure-function analysis.
- Portfolio Impact: Accelerates lead selection via high-yield, reproducible antigen/antibody production for mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and sterile technique.
- Dependent on incubator shaker with precise CO2, humidity, and temperature control.
- Needs access to biosafety cabinet, centrifuge, and protein purification systems (Ni-NTA, Protein A/G).
- Adaptation to other cell lines may require optimization of DNA/PEI ratios and transfection timing.
- Glycoform modulation via VPA requires validation of target protein function post-treatment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Culture Inoculation
5:11
Transfection
7:50
Expression and Harvest
8:36
Results: High Yield Expression of Appropriately Glycosylated Protein with Transient Transfection
10:20
Conclusion
3:00
Cell Maintenance: Checking Cell Density and Viability and Passaging Cells
